Flödescytometrisk analys av immunceller Inom Murine artärer

Summary

Denna uppsats presenterar en flödescytometri-baserad metod för att undersöka immun sammansättningen av artärer. Papperet illustrerar också ett extra teknik som tillåter att undersöka omgivande adventitia och kärlväggen separat. Denna metod öppnar möjligheter att utföra fenotypiska analyser av aorta leukocyter och tillämpa flera immunologiska analyser för åderförkalkning studier.

Abstract

Ateroskleros är en kronisk inflammatorisk process av medelstora och stora fartyg som kännetecknas av att det bildas plack består av skum, immunceller, vaskulära endotelceller och glatta muskulatur, trombocyter, extracellulär matris och en fettrika kärna med omfattande nekros och fibros i omgivande vävnader. ¹ det medfödda och adaptiva armar av immunförsvaret är involverade i initiering, utveckling och uthållighet av åderförkalkning. ^{2, 3} Det finns en stor mängd bevis för att olika undergrupper av immunceller, såsom makrofager, dendritiska celler, T-och B-lymfocyter, finns i artärer av friska och åderförkalkning hos möss med benägenhet ^4. Dessutom är immunceller som finns i det omgivande aorta adventitia som föreslår en viktig roll i denna vävnad i aterogenes. ²

Under en tid var den kvantitativa detektion av olika typer av immunceller, deras aktivering status och det cellulära sammansättning inom aortaväggen begränsas av RT-PCR och immunhistokemiska metoder för studier av åderförkalkning. Få försök gjordes att utföra flödescytometri använda mänskliga artärer, och ett antal problem, som hög autofluorescens, har rapporterats ^5,6. Mänskliga aterosklerotiska plack var kokas med kollagenas 1 och fria celler samlades in och färgas för CD14 + / CD11c + för att markera makrofager som härrör skum celler. I denna studie var en "falsk" kanal som används för att undvika falskt positiv färgning. ⁶ Nekrotiska material samlas under rötningsprocessen ger upphov till en stor mängd skräp som genererar en hög autofluorescens i aorta prover. För att lösa detta problem har en panel av negativa och positiva kontroller har föreslagits, men bara dubbla färgning skulle kunna tillämpas i dessa prover. Vi har utvecklat en ny flödescytometri-baserad metod ⁷ för att analysera immunceller sammansättning och karakterisera aktiveringen, proliferation, differentiering av immunceller i friska och åderförkalkning-benägen aorta. Denna metod gör att undersökningen av immunceller sammansättning aortaväggen och öppnar möjligheter att utnyttja ett brett spektrum av immunologiska metoder för undersökningar av immun aspekter av denna sjukdom.

Protocol

1. Isolering av murina artärer

Institutionella IACUC kommitté godkännande av tillvägagångssätt krävs för att arbeta med möss.

1. Förbered heparinzed PBS genom att lägga till 1000 enheter heparin till 50 ml PBS och vända röret för att blanda. Förbered en tom samling rör för blodet och en samling rör som innehåller PBS för varje aorta som ska samlas in. Håll alla slangar på is.
2. Heparinisera en spruta för att dra blod (0,1 ml av 1000 E / ml heparin), förbereda kirurgiska instrument (två par böjda tång, ett par dissekera sax, och ett par microshears), och en dissekera scen för dissekering.
3. Euthanize en mus med hjälp av koldioxid i en godkänd kammare efter NIH och institutionella IACUC politik kommitté om gnagare dödshjälp. Kontrollera om effektivitet innan de överförs musen till dissekera scen.
4. Kortfattat blöta musen med 70% etanol och fäst musen till dissekering scenen. Dra blod från mus via hjärt punktering.
5. Öppna buken och bröstet håligheter. Använd en 10 ml spruta med en 25 G-nål och helt BEGJUTA kärlsystemet med PBS innehållande 2% av heparin att helt ta bort blod från fartyg från hjärtat. Se till att det inte finns något blod i aorta vävnader. Perfusionen bör utföras långsamt med lite tryck för att säkerställa att alla plack i kärlväggen förblir intakta.
6. Dissekera och ta bort inre organ, urogenital organ, diafragman och mjälten, lämnar njurar, hjärta och aorta intakt.
7. Försiktigt dissekera fettvävnad och para-aorta lymfkörtlar bort från aorta, lämnar aorta och adventitia intakt. Samla hela kroppspulsådern även aortabågen, stigande, fallande, bröstkorg och buk portioner. Placera isolerade kroppspulsådern i en samling rör med PBS. Under isoleringen förfarande, försöka hålla fartyget fuktig.

2. Beredning av enstaka cellsuspensioner

1. Skapa en 1X Aorta Dissociation Solution Enzyme lager (ADES) (125 U / ml kollagenas typ XI, 60 U / ml Hyaluronidas typ 1-S, 60 U / ml DNas jag, och 450 U / ml kollagenas typ I, i 2,5 ml av PBS, ändras från Galkina et al. ^7). Alla enzymer är från Sigma-Aldrich. Placera lösningen beståndet enzymet på is.
2. Ta bort PBS från samlingen röret med aorta. Tillsätt 2,5 ml 1X ADES till varje aorta. Skär artärer i små bitar för att underlätta enzymatisk spjälkning eller lämna hela aorta intakt. Inkubera artärer med 1X enzym lösningen för en timme vid 37 ° C (långsammare skakning är valfritt).
3. Efter 1 timme inkubation, förbereda enda cellsuspensioner från smälta aorta genom skjuvning av artärer isär och passerar dem genom en 70 ìm cell sil i 5ml polypropylen FACS rör (BD Falcon). Pellets cellerna genom centrifugering (400xg, 5 minuter, 4 ° C).
4. Resuspendera cellerna i 1 ml FACS buffert (PBS kompletterad med 1% BSA och 0,05% NaN ₃₎ och avgöra hur många celler finns i aorta cellsuspension med trypan blå, en hemocytometer och ett ljusmikroskop. Det totala antalet celler som erhålls efter rötning beror på musens ålder och diet eller svårighetsgrad av åderförkalkning.

3. Flödescytometri färgning

1. Etikett ett lämpligt antal nya FACS rör. I allmänhet bör flödescytometri experiment har en icke-färgade kontrollrör, set med samma färg rör, lämplig fluorescens-minus-en-kontroller (FMO) ^8, lämpliga kontroller isotyp, och en uppsättning av experimentella rör. Eftersom det finns ett begränsat antal av aorta leukocyter som kan isoleras, kan mjälten leukocyter användas för att utföra enda kontroll färgning.
2. Vi använder ett standardprotokoll flödescytometri för att färga aorta cellsuspensioner. Kortfattat, överföring en alikvot av 0,5-1x10 ⁶ celler från en aorta cellsuspension i en FACS tub (er). Tillsätt 1 ml FACS buffert och pellets cellerna genom centrifugering. Avlägsna supernatanten från pelleterat celler genom dekantering.
3. Förbered Fc blockera lösning och cocktails antikropp för experimentella rör, fluorescens-minus-ett rör, och rör isotyp. Tillsätt 100μl för FC block i FACS buffert (14.2μg/ml, klon 2.4G2) för att alla rör och finger snärt eller Vortexa försiktigt för att resuspendera cellerna. Inkubera prov i 15-20 minuter i rumstemperatur.
4. Förbered antikropp färgning, isotyp färgning eller FMO kontroll cocktails färgning. Bestäm den optimala koncentrationen av antikroppar i din preliminära titrering experiment. I närvaro av Fc-block, lägg antikroppar cocktails (100ul/0.5-1.0x10 ⁶ celler) till provrören. Inkubera i 20-30 min vid 4 ° C i mörker.
5. Tillsätt 1 ml FACS buffert i varje rör för att vortexa och pellets cellerna genom centrifugering. Upprepa proceduren en gång till.
6. Dekantera supernatanten och suspenderaden pelleterat cellerna i 300μl på 2% PFA. Kör prover på en flödescytometer.
   • Notera: Normalt anti-CD45-antikropp (vanligt leukocyt antigen markör) läggs till alla de prover för att grinden CD45 ⁺ leukocyter senare ⁷ Dessutom bör CD45 FMO och isotypisk kontroller skall initialt användas för att placera CD45 ⁺ leukocyter grind som. CD45 uttryck kan variera mellan leukocyter.
   • OBS: För att upptäcka låg densitet uttrycka ytantigener eller låg antigener händelse, använd "ljusa fluorokromer" som R-Phycoerythrin (PE) eller Allophycocyanin (APC). Dessutom kan ovanliga händelser som kan upptäckas genom att samla flera matchas artärer tillsammans, men om fler än en miljon celler används, bör den mängd antikroppar som används per test ökas proportionellt.
   • OBS: För att säkerställa att det finns minimala blod föroreningar i de isolerade artärer och därmed i aorta cellsuspensionen i vissa experiment ytterligare färgning utfördes för TER-119, ⁷ ett antigen som uttrycks av röda blodkroppar (RBC). Antalet RBC till vita blodkroppar (WBC) i blodet är ungefär 10x10 ⁶ celler / l till 8x10 ³ celler / l. Baserat på uttrycket av TER-119 i aorta prover, kan andelen blodbaserade vita blodkroppar i provet beräknas. Vanligtvis har vi mindre än 0,02% av blodbaserade WBC i aorta prover. (Figur 1)
   • OBS: Eftersom enzymet behandlingen kan påverka uttrycket av ytantigener bör motståndet mot enzymet matsmältningen skall bestämmas för antigener av intresse. Kortfattat är perifera lymfkörtlar (PLN) eller små bitar av mjälte inkuberas med eller utan enzym cocktail i 1 timme vid 37 ° C. Efter 1 timme, är ett uttryck av antigener bestäms av flödescytometri. Enzymet cocktail har ingen effekt på flera ytantigener (Fig.2) ^7. I vissa andra fall ledde enzym behandling i en betydande förlust av antigen uttryck. Detta problem kan kringgås genom användning av alternativa cell markörer.
   • Obs: Live / döda cellviabiliteten färgning kan göras efter steg 4 om så önskas. Vanligtvis använder Live / Dead fastställbara Dead Cell Stain Kit (Invitrogen, molekylära sonder). Att färga cellerna med Live / Dead färg, skapa en 1x Live / Dead lösning genom att tillsätta 1μl av Re upplösta-live / döda färg i 1 ml PBS och vortexa att blanda. Tillsätt 100-200 l 1X Live / Dead färgämne till levande / döda singel, cocktail, FMO och isotyp kontrollprover. Inkubera prov med färgen vid rumstemperatur i 10 minuter i mörker. Den enda kontroll rör för Live / Dead bör inkuberas vid 56 ° C i mörker i 10 minuter att döda celler av värme chock. Tvätta cellerna med 1 ml PBS och pellets cellerna genom centrifugering. Återuppta protokollet i steg 5.
   • Obs: Intracellulär färgning för intracellulära antigener och cytokiner är kompatibel med detta protokoll. Kortfattat kan intracellulär färgning utföras med celler fixering / reagens permeabilization från BD Pharmingen, eBioscience eller Caltag laboratorier - beroende på antigener av intresse. För att fixa och permeabilize cellerna för intracellulär färgning, utföra fixering / permeabilization steg efter tillverkarens anvisningar, efter den extracellulära färgning steg (avsnitt 3 steg 5). Efter den intracellulära tvätta steg återuppta våra protokoll vid steg 6 (avsnitt 3 steg 6).

4. Flödescytometrisk analys av isolerade omgivande adventitia och kärlväggen

Som leukocyter kan migrera till aorta adventitia samt aterosklerotiska plack i aorta väggen, för att undersöka adventitial och aorta leukocyter med flödescytometri ett protokoll för att isolera och utföra flödescytometri på dessa två anatomiska platser utvecklades. ⁹ korthet innan hela artärer smälts med ADES (avsnitt 2, steg 2) i aorta adventitia är delvis smält och tas bort från resten av fartyget. När adventitia tas bort och ställ åt sidan, resten av aorta kokas med ADES att befria leukocyter från kärlväggen.

• Aorta Adventitia Isolering protokoll

1. Efter beredning av 1X ADES (avsnitt 2 steg 1), förbereda 2,5 ml / kroppspulsådern 1X Aorta adventitia matsmältningen enzym lösning (AADES) (781,25 U kollagenas II och 14,0625 U Elastase i 2.5mls PBS (Worthington biokemiska Corp, Lakewood, NJ )). ⁹ Placera stamlösningen på is tills det ska användas.
2. Ta bort PBS från samlingen röret med aorta. Tillsätt 2,5 ml 1X AADES till varje aorta. Klipp inte artärer i små bitar. Inkubera artärer med 1X adventitia enzymet lösning för 10-20 minuter vid 37 ° C.
3. Efter 10-20 minuter matsmältningen, överföra delvis smälta kroppspulsådern ur 1X AADES till en petriskål med färsk PBS. Mycket noga, med hjälp av två par böjda pincett, skala adventitial lagret borta frOm aortan som en enhet.
   • Obs: Längre digestionstid göra det lättare att ta bort adventitia, men om det adventitia är över-rötas det kommer att riva.
4. När adventitia har tagits bort helt, överföra adventitia och stora kroppspulsådern för att separera FACS rör. Tillsätt 1 mL PBS till adventitia röret och placera röret på is. Tillsätt 2,5 ml av 1X kroppspulsådern dissociation enzym lösning på aorta rör och inkubera stora kroppspulsådern i 40 minuter vid 37 ° C.
   • OBS: För att underlätta enzymatisk spjälkning kan aorta delas upp i mindre delar på denna punkt.
5. Efter 40 minuters matsmältningen, placera aortan röret på is och förbereda enda cellsuspensioner från aorta och adventitia genom skjuvning av artärer samt adventitia isär och passerar dem genom en 70 ìm cell sil i 5ml polypropylen FACS rör (BD Falcon). Pellets cellerna genom centrifugering (400xg, 5 minuter, 4 ° C). Återgå till avsnitt 2 steg 4 och återuppta protokollet.

5. Representativa resultat

Här presenterar vi ett antal figurer som visar flödescytometri färgning att analysera immun sammansättningen av hela artärer, aorta kärlväggen och omgivande aorta adventitia. Först visar vi en representant FACS plot som visar en TER-119 färgning på helblod och isolerad aorta cellsuspension (bild 1). TER-119 positiva röda blodkroppar som stod för 18% av cellerna i aorta cellsuspension, vilket tyder på att endast 0,014% av de celler som isolerats från suspensioner aorta cell blodbaserade. Detta är en viktig kontroll experiment som tydligt visar att smälta fartyg, men inte cirkulerande perifert blod är källan till de flesta leukocyter analyseras i aorta cellsuspension. Dessutom för att validera metoden bedömde vi effekterna av den stora kroppspulsådern dissociation enzymet cocktail på splenocyte ytantigener (Fig. 2). Enzymet cocktail har någon effekt på uttrycket av flera antigener, inklusive, CD45, CD19, CD3, TCRαβ, TCRγδ och flera andra ytantigener ^7.

CD45-färgning i samband med Live / Dead livskraft färgämne och lämpliga kontroller isotyp används för att upptäcka och sub-gate stora populationer av intresse och att utesluta cellulära skräp under analysen. I Fig.3, levande aorta CD45 ⁺ leukocyter var gated att bestämma den andel av IFN _Υ + T celler i poolade artärer av två unga ApoE ^{- / -} möss. För att betona mångsidigheten hos denna metod, att använda gating som presenteras i Fig.3, vi presenterar i Fig.4 representativa intracellulär färgning för CD68 + CD11b + makrofager och IFNγ + TCRαβ + celler från två ApoE ^{- / -} möss som utfodrats västerländsk diet för 12 veckor. Som väntat i västra kost matas ApoE ^{- / -} artärer, majoriteten av leukocyter i kroppspulsådern är makrofager (40% CD68 + CD11b +) eller andra myeloida celler (CD11b + CD68 ^låg och CD11b + CD68-). Dessutom Th1 celler utgör en stor del av aorta infiltrera TCRαβ T-celler (Fig. 4). Eftersom den totala andelen av aorta leukocyter och leukocyter delmängder varierar beroende på ålder av musen och svårighetsgraden av ateroskleros, bör den optimala gating strategi för stora populationer av intresse att empiriskt bestämmas

För att visa möjligheten att isolera aorta adventitia för flödescytometri färgning presenterar vi representativ CD45 ⁺ leukocyter färgning av aorta och adventitial cellsuspensioner (Fig 5). Kort sagt, tre år ApoE ^{- / -} var mus artärer smälts och sammanförs enligt ovan (avsnitt 2 och 4). Infiltrera CD45 ⁺ leukocyter upptäcktes i både adventitia (18% av cellsuspensionen) och resterande kroppspulsådern (11% av cellsuspensionen).

Figur 1. TER-119 färgning i smält aorta cellsuspension. Aorta var perfusion från hjärtat med PBS innehållande 2% heparin. Då aortan var kokas med enzymet cocktail för 1 timme vid 37 ° C. Aorta-celler fjädring och blodprov (som en positiv kontroll) färgades med anti-TER-119-PE Abs och analyseras med flödescytometri. TER-119-positiva röda blodkroppar som står för 18% av alla celler i aorta cellsuspension visar att endast 0,014% av alla leukocyter isolerade från artärer kommer sannolikt att vara blodbaserade leukocyter.

Figur 2. Enzym-cocktail behandling har ingen effekt på CD45 (överst) och CD19 (botten) uttryck på lymfocyter. + / CD19 ⁺ lymfocyter. Profiler är gated på CD45 ⁺ leukocyter.

Figur 3 gating strategi för analys av aorta leukocyter Två artärer var isolerade och sammanslogs från aterosklerotiska benägna ApoE ^{-.. / -} Möss och aorta suspensioner cell var beredda enligt ovan. Den cellsuspensioner färgades för CD45 (PerCP), TCRαβ (FITC), IFNγ (eFluor 450), och Live / Dead Aqua, och analyseras med hjälp av en Cytek DXP 8 Färg uppgraderas BD FACS Calibur. Kortfattat var CD45 ⁺ leukocyter gated (B) och analyseras närmare (CF). Döda celler togs bort från analysen bygger på Live / Dead Aqua färgning (D) och FSC tomter (E). Live aorta leukocyter undersöktes sedan för TCRαβ och IFNγ uttryck (F).

.. Figur 4 Intracellulär färgning av intracellulära antigener och cytokiner cellsuspensioner var beredda från en hel ApoE ^{- / -} aorta och mjälte som beskrivs. Aorta (A) och mjälten (B, C) suspensioner cell färgades för CD45, CD11b och CD68 eller en isotypisk kontroll med BD Cytofix / Cytoperm ™ Kit (BD Biosciences). Celler gated på CD45 ⁺ leukocyter och skräp uteslöts baserat på framåt och Side Scatter profiler. För intracellulära IFNγ färgning var aorta och mjälten cellsuspensioner odlade i fem timmar i RPMI 1640 kompletteras med Golgi stopp, PMA och Ionomycin C, som tidigare beskrivits. ⁹ Stimulerade enda aorta (D) och mjälten (E, F) cellsuspensioner var därefter färgats med CD45 (PerCP), TCRαβ (FITC), CD3 (APC-Cy7), Live Dead Aqua och IFNγ (eFluor 450, E) eller en isotyp (IgG1-eF450, F). T-celler (DF) har gated från levande CD45 + CD3 + leukocyter (CD45 + Live / Dead Aqua-) och undersökas för TCRαβ och IFNγ.

.. Figur 5 representativ bild av isolerade murina aorta adventitia och aorta kärlväggen representant flödescytometri motverka plot visar förekomsten av CD45 ⁺ T celler i adventitia och aorta väggen i åldrarna ApoE ^{- / -} möss. SSC-side scatter. För att eliminera autofluorescens från skräp och nekrotisk vävnad, var tomter gated för FSC> 750. För att undvika ytterligare autofluorescens från dubletter grindarna var också inrättas som FSC <3500, Rymdbolaget <3500. De procentsatser visar CD45 ⁺ celler i portarna.

Discussion

Här presenterar vi ett flöde-cytometry-baserad metod för undersökning av immunceller sammansättningen av murina artärer. Den stora fördelen med denna metod är förmågan att analysera aorta immunceller vid en enda cell nivåer och för att karakterisera aktiveringsstatus av aorta leukocyter. Denna metod är inte begränsad till murina artärer och vi (opublicerade data) och andra ¹⁰ används denna metod för att analysera prover från människa till exempel inre bröst artärer, aorta ventiler och kranskärl. En begränsning med denna metod är det relativt låga antalet murina aorta leukocyter återhämtat enstaka artärer. Medan antalet leukocyter återhämtat sig från en enstaka aterosklerotiska aorta är tillräckligt för en flödescytometri experiment, kan celler som är låga i överflöd vara svårt att upptäcka i en enda aorta cellsuspension. Vid behov kan detta problem kringgås genom användning av kombinerade prover 2-4 artärer för flödescytometri färgning. Dessutom kan då enzymet behandling påverka uttrycket av ytantigener bör motståndet mot enzymet behandling skall fastställas för alla antigen av intresse. Vi har tidigare godkänt flera antigen markörer, som inte påverkas av enzymatisk spjälkning ^7. Bör dock oprövade antikroppar kloner valideras av prövaren innan de används i experiment flödescytometri ^7.

Konkurrenskraftiga adoptiv transfer målsökande-analysen är en kraftfull metod för att analysera kinetik och mekanismer för leukocyt rekryteringen till ett område av inflammation. Vi framgång tillämpas analys flödescytometri av artärer från mottagaren mus för att undersöka mekanismen för leukocytmigration till artärer. ⁷ Att analysera nyligen ökat i cellerna kan införlivandet av bromodeoxyuridine (BrdU) in vivo användas som en utmärkt markör för celler som förökar sig. Vi tillämpat denna teknik med följande flödescytometri analys för att upptäcka antigen-specifika T celler i artärer hos mottagaren möss. ⁷

Det finns en växande mängd bevis tyder på att aorta adventitia spelar en viktig roll i aterogenesen. Immunhistokemisk färgning av artärer med det omgivande adventitia ger viktig information om leukocyt lokalisering inom de analyserade vävnader, men har vissa begränsningar i den detaljerade beskrivning av leukocyt subpopulationer. Vi utvecklade en flödescytometri baserad metod som tillåter analys av aorta och omgivande adventitia separat ⁹ Denna nya spännande flödescytometri-baserad teknik, i kombination med väletablerade histologi och molekylär-baserade tekniker, kommer att hjälpa till att identifiera eventuella skillnader i fenotypiska och funktionella egenskaper adventitial och kärlväggen som bor leukocyter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase XI	Sigma-Aldrich	C7657
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506
DNase I, type 2	Sigma-Aldrich	D4527
Collagenase I	Sigma-Aldrich	C0130
Collagenase II	Worthington Biochemical	LS004174
Elastase	Worthington Biochemical	LS002292