Summary
इस कागज प्रवाह cytometry आधारित aortas की प्रतिरक्षा संरचना की जांच विधि प्रस्तुत करता है. कागज भी एक अतिरिक्त तकनीक है कि आसपास adventitia और पोत दीवार अलग से जांच करने की अनुमति देता है दिखाता है. इस विधि संभावनाओं को खोलता है महाधमनी leukocytes के phenotypical विश्लेषण के प्रदर्शन और atherosclerosis के अध्ययन के लिए कई प्रतिरक्षाविज्ञानी assays लागू.
Protocol
1. Murine aortas के अलगाव
संस्थागत IACUC समिति के अनुमोदन प्रक्रिया के चूहों के साथ काम करने की आवश्यकता है.
- 50 मिलीलीटर पीबीएस और inverting ट्यूब मिश्रण हेपरिन सोडियम के 1000 इकाइयों को जोड़कर heparinzed पीबीएस तैयार. रक्त और प्रत्येक के लिए एकत्र हो महाधमनी के लिए पीबीएस युक्त एक संग्रह ट्यूब के लिए एक खाली संग्रह ट्यूब तैयार करें. बर्फ पर सभी ट्यूबों रखें.
- ड्राइंग रक्त (1000 यू / मिलीलीटर हेपरिन सोडियम की 0.1ml) के लिए एक सिरिंज Heparinize, शल्य चिकित्सा उपकरण, (घुमावदार संदंश के दो जोड़े, विदारक कैंची की एक जोड़ी, और microshears की एक जोड़ी) और विच्छेदन के लिए एक विदारक मंच तैयार.
- एक अनुमोदित NIH और संस्थागत IACUC समिति कृंतक इच्छामृत्यु के बारे में नीतियों का पालन कक्ष में कार्बन डाइऑक्साइड का उपयोग कर माउस euthanize. प्रभावशीलता के लिए विदारक चरण के लिए माउस को स्थानांतरित करने से पहले की जाँच करें.
- संक्षेप में 70% इथेनॉल के साथ माउस लेना और विच्छेदन चरण के लिए माउस जकड़ना. हृदय पंचर के माध्यम से माउस से रक्त ड्रा.
- पेट और छाती cavities खोलें. 25 ग्राम सुई के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग पूरी तरह से पीबीएस हेपरिन के 2% से युक्त करने के लिए पूरी तरह से हृदय पंचर द्वारा वाहिकाओं से खून निकालने के साथ vasculature perfuse. यकीन है कि वहाँ कोई रक्त महाधमनी ऊतकों के भीतर है. छिड़काव कम करने के लिए सुनिश्चित करें कि पोत दीवार में सभी सजीले टुकड़े बरकरार रहेगा दबाव के साथ धीरे धीरे प्रदर्शन करना चाहिए.
- काटना और आंत अंगों, genitourinary अंगों, डायाफ्राम और तिल्ली, गुर्दे, हृदय, और महाधमनी बरकरार छोड़ने को हटा दें.
- ध्यान से वसा ऊतकों और पैरा महाधमनी लिम्फ नोड्स महाधमनी से दूर काटना, महाधमनी और adventitia बरकरार जा. महाधमनी चाप सहित पूरे महाधमनी लीजिए, आरोही, उतरते, वक्ष और उदर भाग. पीबीएस के साथ एक संग्रह ट्यूब में अलग महाधमनी रखें. अलगाव प्रक्रिया के दौरान, पोत नम रखने की कोशिश.
2. एकल कक्ष निलंबन की तैयारी
- एक 1X महाधमनी हदबंदी एनजाइम शेयर (ADES) समाधान (125 यू / मिलीलीटर Collagenase प्रकार इलेवन, 60 यू / मिलीलीटर hyaluronidase प्रकार 1 एस, 60 यू / मिलीलीटर DNase मैं, और 450 यू / मिलीलीटर Collagenase प्रकार मैं, 2.5 में mls बनाएँ Pbs, Galkina एट अल से संशोधित 7.). सभी एंजाइमों सिग्मा Aldrich से हैं. बर्फ पर शेयर एंजाइम समाधान रखें.
- पीबीएस संग्रह महाधमनी युक्त ट्यूब से निकालें. प्रत्येक महाधमनी 1X ADES के 2.5 मिलीलीटर जोड़ें. छोटे - छोटे टुकड़ों में aortas कट enzymatic पाचन की सुविधा या पूरे महाधमनी बरकरार छोड़. 37 पर 1 घंटे के लिए 1X एंजाइम समाधान के साथ aortas सेते डिग्री सेल्सियस (धीमी मिलाते हुए वैकल्पिक है).
- 1 घंटे ऊष्मायन के बाद, पचा महाधमनी से aortas अलावा बाल काटना और एक 70 सुक्ष्ममापी सेल झरनी के माध्यम से उन्हें 5ml polypropylene FACS ट्यूबों (बी फाल्कन) में गुजर द्वारा एकल कक्ष निलंबन को तैयार है. गोली centrifugation द्वारा कोशिकाओं (400xg, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस).
- FACS बफर (पीबीएस में 1% BSA और 0.05% 3 NaN के साथ पूरक) के 1ml में कोशिकाओं Resuspend और निर्धारित कितने कोशिकाओं महाधमनी सेल trypan नीले, एक hemocytometer, और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग निलंबन में मौजूद हैं. पाचन के बाद प्राप्त की कोशिकाओं की कुल संख्या माउस उम्र और आहार या atherosclerosis की गंभीरता पर निर्भर करेगा.
3. प्रवाह cytometry धुंधला
- नई FACS ट्यूबों के एक उचित संख्या लेबल. सामान्य में, प्रवाह cytometry प्रयोगों गैर से सना हुआ एक नियंत्रण ट्यूब, एकल रंग ट्यूब, उपयुक्त प्रतिदीप्ति ऋण एक नियंत्रण (FMO) 8, उचित निर्धारण नियंत्रण, और प्रयोगात्मक ट्यूबों के एक सेट का सेट होना चाहिए. के बाद से वहाँ महाधमनी leukocytes कि अलग - थलग किया जा सकता है की सीमित संख्या है, प्लीहा - संबंधी leukocytes एकल नियंत्रण धुंधला करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- हम एक मानक प्रवाह cytometry प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए महाधमनी सेल निलंबन दाग. संक्षेप में, 0.5-1x10 FACS ट्यूब (ओं) में एक महाधमनी सेल निलंबन से 6 कोशिकाओं की एक विभाज्य हस्तांतरण. Centrifugation द्वारा 1ml FACS बफर और गोली की कोशिकाओं में जोड़ें. Decanting द्वारा pelleted कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला निकालें.
- एफसी ब्लॉक समाधान और एंटीबॉडी कॉकटेल प्रयोगात्मक ट्यूबों, प्रतिदीप्ति ऋण एक ट्यूब, और निर्धारण ट्यूबों के लिए तैयार करें. ट्यूब और उंगली झटका या धीरे कोशिकाओं resuspend भंवर के सभी FACS बफर में एफसी ब्लॉक (14.2μg/ml, 2.4G2 क्लोन) 100μl जोड़ें. कमरे के तापमान पर 15-20 मिनट के लिए नमूने सेते हैं.
- एंटीबॉडी धुंधला हो जाना, निर्धारण धुंधला हो जाना या FMO नियंत्रण धुंधला कॉकटेल तैयार करें. अपने प्रारंभिक अनुमापन प्रयोगों में एंटीबॉडी के इष्टतम एकाग्रता का निर्धारण करते हैं. एफसी ब्लॉक की उपस्थिति में, नमूना ट्यूबों के लिए एंटीबॉडी कॉकटेल (100ul/0.5-1.0x10 6 सेल) को जोड़ने. 4 में 20-30 मिनट के लिए सेते ° C अंधेरे में.
- प्रत्येक ट्यूब FACS बफर के 1ml जोड़ें, भंवर, मिश्रण करने के लिए और गोली centrifugation द्वारा कोशिकाओं. प्रक्रिया एक बार और दोहराएँ.
- सतह पर तैरनेवाला और resuspend निथारना2% पीएफए के 300μl में pelleted कोशिकाओं. एक प्रवाह cytometer पर नमूने चलाएँ.
- नोट: आमतौर पर विरोधी CD45 एंटीबॉडी (आम ल्युकोसैट प्रतिजन मार्कर) नमूने के सभी के लिए जोड़ा जाता है CD45 गेट leukocytes + बाद क्रम में 7 इसके अलावा, CD45 FMO और निर्धारण नियंत्रण शुरू में इस्तेमाल किया जा चाहिए के रूप में CD45 + ल्युकोसैट गेट जगह . CD45 अभिव्यक्ति leukocytes के बीच भिन्न हो सकते हैं.
- नोट: करने के लिए कम घनत्व सतह प्रतिजनों या कम घटना प्रतिजनों व्यक्त का पता लगाने, (पीई) आर Phycoerythrin या Allophycocyanin (APC) के रूप में "उज्ज्वल fluorochromes" का उपयोग करें. इसके अलावा, दुर्लभ घटनाओं को एक साथ कई मिलान aortas pooling द्वारा पता लगाया जा सकता है, लेकिन अगर एक लाख से अधिक कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है, परीक्षण के प्रति इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के राशि आनुपातिक वृद्धि हुई किया जाना चाहिए.
- नोट: सुनिश्चित करें कि वहाँ पृथक aortas में कम से कम रक्त contaminations हैं और फलस्वरूप महाधमनी सेल निलंबन में, कुछ प्रयोगों में अतिरिक्त धुंधला TER - 119, 7 एक लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) द्वारा व्यक्त प्रतिजन के लिए प्रदर्शन किया था . आरबीसी के रक्त में सफेद रक्त कोशिकाओं (WBC) संख्या 10x10 मोटे तौर पर 6 / सेल μl 8x10 3 सेल / μl है. महाधमनी नमूनों में TER 119 के अभिव्यक्ति के आधार पर, रक्त व्युत्पन्न नमूने में सफेद रक्त कोशिकाओं का प्रतिशत की गणना की जा सकती है. आमतौर पर हम महाधमनी नमूनों में रक्त व्युत्पन्न WBC के 0.02% से कम है. (Fig.1 )
- नोट: के बाद से एंजाइम उपचार सतह प्रतिजनों की अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकता है, एंजाइम पाचन के लिए प्रतिरोध हित के प्रतिजनों के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए. संक्षेप में, परिधीय लिम्फ नोड (PLN) या प्लीहा के छोटे टुकड़े के साथ या एंजाइम कॉकटेल के बिना 1 घंटे के लिए 37 में incubated डिग्री सेल्सियस 1 घंटे के बाद, प्रतिजनों की अभिव्यक्ति प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित किया जाता है. एंजाइम कॉकटेल कई सतह (Fig.2) एंटीजन 7 पर कोई प्रभाव नहीं है. कुछ अन्य मामलों में, एंजाइम उपचार प्रतिजन अभिव्यक्ति का एक महत्वपूर्ण नुकसान के परिणामस्वरूप. इस समस्या के वैकल्पिक सेल मार्कर का उपयोग करके circumvented किया जा सकता है.
- नोट: लाइव / मृत सेल व्यवहार्यता धुंधला 4 कदम के बाद किया जा सकता है अगर वांछित. आमतौर पर लाइव / मृत fixable मृत सेल दाग किट (Invitrogen, आण्विक जांच) का उपयोग करें. लाइव / मृत डाई के साथ कोशिकाओं दाग, पीबीएस और भंवर के 1ml में फिर से भंग डाई / रहते मृत के 1μl जोड़ने के मिश्रण करने के लिए एक 1x लाइव / मृत समाधान बनाने. जीना / मृत एकल, कॉकटेल, FMO और निर्धारण नियंत्रण नमूने 1x लाइव / मृत डाई के 100-200 μl जोड़ें. अंधेरे में 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर डाई के साथ नमूने सेते हैं. एकल नियंत्रण के लिए ट्यूब / लाइव मृत 56 में incubated होना चाहिए ° सी गर्मी झटका द्वारा कोशिकाओं को मारने के लिए 10 मिनट के लिए अंधेरे में. पीबीएस और गोली centrifugation द्वारा कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें. 5 कदम पर प्रोटोकॉल पुनरारंभ.
- नोट: Intracellular धुंधला intracellular प्रतिजनों और साइटोकिन्स के लिए इस प्रोटोकॉल के साथ संगत है. ब्याज की एंटीजन पर निर्भर करता है - संक्षेप में, intracellular धुंधला बी.डी. Pharmingen, eBioscience, या Caltag प्रयोगशालाओं से सेल निर्धारण / permeabilization अभिकर्मकों का उपयोग कर प्रदर्शन किया जा सकता है. Intracellular धुंधला के लिए कोशिकाओं को ठीक करने के लिए और permeabilize कदम / निर्धारण permeabilization प्रदर्शन, निर्माता के निर्देशों का पालन कोशिकी धुंधला कदम (अनुभाग 3 कदम 5) के बाद. Intracellular धोने कदम के बाद, चरण 6 (अनुभाग 3 कदम 6) में हमारे प्रोटोकॉल को फिर से शुरू.
4. पृथक आसपास adventitia और पोत दीवार के प्रवाह cytometry विश्लेषण
Leukocytes महाधमनी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से adventitia महाधमनी दीवार के भीतर atherosclerotic सजीले टुकड़े के रूप में की ओर पलायन करने के लिए प्रवाह cytometry द्वारा adventitial और महाधमनी leukocytes की जांच कर सकते हैं अलग और प्रवाह cytometry संरचनात्मक इन दो साइटों पर प्रदर्शन के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया था. पूरे aortas पहले संक्षेप में 9, ADES (धारा 2, चरण 2) महाधमनी adventitia आंशिक रूप से पचता है और पोत के बाकी हिस्सों से हटा के साथ पचा हैं. एक बार adventitia निकाल दिया है और अलग सेट, महाधमनी के बाकी ADES पोत दीवार से leukocytes आजाद कराने के साथ पचता है.
- महाधमनी Adventitia अलगाव प्रोटोकॉल
- 1X ADES (खंड दो कदम 1) की तैयारी के बाद, 2.5 मिलीग्राम / 1X महाधमनी adventitia पाचन एंजाइम (AADES) (781.25 यू Collagenase द्वितीय और 2.5mls पीबीएस (वर्दिग्टन जैव रासायनिक कॉर्प, Lakewood, NJ में 14.0625 यू इलास्टेज समाधान के महाधमनी तैयार )). 9 प्लेस उपयोग करें जब तक बर्फ पर शेयर समाधान.
- पीबीएस संग्रह महाधमनी युक्त ट्यूब से निकालें. प्रत्येक महाधमनी 1X AADES के 2.5 मिलीलीटर जोड़ें. छोटे - छोटे टुकड़ों में aortas में कटौती नहीं करो. 10-20 मिनट के लिए 37 पर 1X adventitia एंजाइम समाधान के साथ aortas सेते डिग्री सेल्सियस
- 10-20 मिनट के पाचन के बाद, आंशिक रूप से पचता महाधमनी हस्तांतरण 1X AADES ताजा पीबीएस के साथ एक पेट्री डिश. बहुत ध्यान से, घुमावदार संदंश के दो जोड़े का उपयोग कर, adventitial परत छील दूर frओम एक एकल इकाई के रूप में महाधमनी.
- नोट: अब पाचन बार यह आसान adventitia हटाने के लिए करना; तथापि, यदि adventitia अधिक पचता है इसे फाड़.
- जब adventitia पूरी तरह से हटा दिया गया है है, adventitia और अलग FACS ट्यूबों के लिए महाधमनी हस्तांतरण. Adventitia ट्यूब पीबीएस के 1ml जोड़ें, और बर्फ पर ट्यूब जगह. महाधमनी ट्यूब 2.5 mls के 1X महाधमनी हदबंदी एंजाइम समाधान जोड़ें और 37 पर 40 मिनट के लिए महाधमनी सेते डिग्री सेल्सियस
- नोट: enzymatic पाचन की सुविधा के लिए, इस बिंदु पर छोटे टुकड़ों में महाधमनी हो विभाजित कर सकते हैं.
- 40 मिनट पाचन के बाद, बर्फ पर महाधमनी ट्यूब जगह और महाधमनी और adventitia से aortas और adventitia अलावा बाल काटना और एक 70 सुक्ष्ममापी सेल झरनी के माध्यम से उन्हें 5ml polypropylene FACS ट्यूबों (बी फाल्कन) में गुजर द्वारा एकल कक्ष निलंबन को तैयार है. गोली centrifugation द्वारा कोशिकाओं (400xg, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस). अनुभाग 2 कदम 4 पर लौटें और फिर से शुरू प्रोटोकॉल.
5. प्रतिनिधि परिणाम
हम यहाँ के आंकड़े की एक संख्या है कि प्रवाह cytometry पूरे aortas की प्रतिरक्षा संरचना, महाधमनी पोत दीवार और आसपास के महाधमनी adventitia का विश्लेषण धुंधला दर्शाता उपस्थित थे. सबसे पहले, हम एक प्रतिनिधि FACS साजिश है कि पूरे रक्त और पृथक महाधमनी सेल निलंबन (1 छवि) पर एक TER 119 धुंधला दिखाता है प्रदर्शित करता है. TER 119 सकारात्मक लाल रक्त कोशिकाओं महाधमनी सेल निलंबन, जो इंगित करता है कि महाधमनी सेल निलंबन से अलग कक्षों का केवल 0.014% रक्त प्राप्त कर रहे हैं में कोशिकाओं के 18% के लिए हिसाब. यह एक महत्वपूर्ण नियंत्रण प्रयोग है कि स्पष्ट है कि पचा वाहिकाओं दर्शाता है, लेकिन परिधीय रक्त परिसंचारी नहीं सबसे leukocytes महाधमनी सेल निलंबन में विश्लेषण के लिए स्रोत है. इसके अलावा, विधि मान्य करने के लिए, हम splenocyte सतह प्रतिजनों पर महाधमनी हदबंदी एंजाइम कॉकटेल (छवि 2) के प्रभाव का मूल्यांकन. एंजाइम कॉकटेल सहित कई प्रतिजनों, CD45, CD19, CD3, TCRαβ, TCRγδ और कई अन्य सतह प्रतिजनों 7 की अभिव्यक्ति पर कोई प्रभाव है.
लाइव / मृत व्यवहार्यता डाई और उचित निर्धारण नियंत्रण के साथ संयोजन के रूप में धुंधला CD45 पता लगाने और ब्याज के उप प्रमुख गेट आबादी और विश्लेषण के दौरान सेलुलर मलबे को बाहर करने के लिए उपयोग किया जाता है. Fig.3, जीना महाधमनी में CD45 + leukocytes gated थे IFN का प्रतिशत निर्धारित Υ + दो युवा APOE जमा aortas भीतर टी कोशिकाओं - / - चूहों. इस विधि का बहुमुखी प्रतिभा पर जोर, gating Fig.3 में प्रस्तुत योजना का उपयोग करने के लिए, हम में मौजूद दो APOE से Fig.4 प्रतिनिधि CD68 + CD11b + मैक्रोफेज और IFNγ + TCRαβ + कोशिकाओं के लिए intracellular धुंधला - / - 12 के लिए चूहों खिलाया पश्चिमी आहार सप्ताह. / - पश्चिमी आहार खिलाया APOE में उम्मीद थी,. Aortas, महाधमनी के भीतर leukocytes के बहुमत (40% CD68 + CD11b +) या अन्य माइलॉयड कोशिकाओं (CD11b + कम CD68 और CD11b + CD68) मैक्रोफेज हैं इसके अलावा, TH1 कोशिकाओं TCRαβ टी कोशिकाओं (Fig.4) घुसपैठ महाधमनी के एक बड़े हिस्से शामिल हैं . महाधमनी leukocytes और ल्युकोसैट सबसेट का कुल प्रतिशत के रूप में माउस और atherosclerosis की गंभीरता की उम्र पर निर्भर करता है, ब्याज की प्रमुख आबादी के लिए इष्टतम gating रणनीति empirically निर्धारित किया जाना चाहिए
प्रवाह cytometry धुंधला के लिए महाधमनी adventitia अलग की व्यवहार्यता का प्रदर्शन करने के लिए, हम CD45 प्रतिनिधि उपस्थित + महाधमनी और adventitial सेल निलंबन के लिए ल्युकोसैट धुंधला ( चित्र 5). संक्षेप में, तीन आयु वर्ग के APOE - / - माउस aortas पचा थे और एक साथ जमा के रूप में ऊपर वर्णित (धारा 2 और 4 ). CD45 + leukocytes घुसपैठ दोनों adventitia (सेल निलंबन का 18%) और शेष महाधमनी (सेल निलंबन का 11%) में पाया गया.
चित्रा 1. पचा महाधमनी सेल निलंबन में TER-119 धुंधला हो जाना. महाधमनी पीबीएस 2% हेपरिन युक्त के साथ हृदय पंचर से perfused था. फिर महाधमनी 1 घंटे के लिए एंजाइम कॉकटेल के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर पचता था महाधमनी कोशिकाओं निलंबन और खून का नमूना (एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में) Abs के विरोधी TER-119 पीई के साथ दाग थे और प्रवाह cytometry से विश्लेषण किया. TER - 119 सकारात्मक महाधमनी सेल का संकेत है कि सभी leukocytes aortas से अलग का केवल 0.014% रक्त व्युत्पन्न leukocytes होने की संभावना हैं निलंबन में सभी कक्षों के 18% के लिए लाल रक्त कोशिकाओं खाते.
चित्रा 2. एनजाइम - कॉकटेल उपचार CD45 (ऊपर) या CD19 (नीचे) लिम्फोसाइटों पर अभिव्यक्ति पर कोई असर पड़ता है. + / CD19 + लिम्फोसाइटों के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं. प्रोफाइल CD45 + leukocytes पर gated हैं.
चित्रा 3 Gating रणनीति दो aortas महाधमनी leukocytes के विश्लेषण के लिए अलग और जमा atherosclerotic प्रवण APOE से - गया / - चूहों और महाधमनी सेल निलंबन ऊपर वर्णित के रूप में तैयार किए गए. सेल निलंबन CD45 PerCP (), TCRαβ (FITC), IFNγ (450 eFluor), और लाइव / मृत एक्वा के लिए दाग थे, और Cytek DXP 8 बी.डी. FACS Calibur उन्नत रंग विश्लेषण का उपयोग कर. संक्षेप में, CD45 + leukocytes gated थे (बी) और आगे विश्लेषण (CF). मृत कोशिकाओं लाइव मृत / एक्वा धुंधला (डी) और FSC भूखंडों (ई) पर आधारित विश्लेषण से हटा दिया गया. लाइव महाधमनी leukocytes तो TCRαβ और IFNγ अभिव्यक्ति (एफ) के लिए जांच की गई.
/ - चित्रा 4 intracellular प्रतिजनों और साइटोकिन्स के लिए intracellular धुंधला सेल निलंबन एक पूरी APOE से तैयार थे महाधमनी और तिल्ली के रूप में वर्णित है. महाधमनी (ए) और प्लीहा - संबंधी (बी, सी) सेल निलंबन CD45, CD11b, और CD68 या एक निर्धारण बी.डी. Cytofix / Cytoperm किट ™ (बी बायोसाइंसेज) का उपयोग नियंत्रण के लिए दाग थे. कक्ष CD45 + leukocytes पर gated थे और मलबे आगे और पक्ष स्कैटर प्रोफाइल के आधार पर बाहर रखा गया था. Intracellular IFNγ धुंधला के लिए, महाधमनी और प्लीहा - संबंधी सेल निलंबन Golgi रोक, PMA, और Ionomycin सी के साथ पूरक RPMI 1640 में पांच घंटे के लिए सुसंस्कृत थे, जैसा कि पहले वर्णित है. एकल 9 (डी) महाधमनी और प्लीहा - संबंधी (ई, एफ) सेल निलंबन थे प्रेरित या एक निर्धारण (IgG1 eF450, एफ), बाद में साथ दाग CD45 (PerCP), TCRαβ (FITC), CD3 (APC Cy7), मृत एक्वा, और IFNγ (ई 450 eFluor) जीते. टी कोशिकाओं (लोमो) CD45 जीना से CD3 + + leukocytes (CD45 + / लाइव मृत एक्वा) gated थे और TCRαβ और IFNγ के लिए जांच की.
/ - चूहों चित्रा 5 पृथक murine महाधमनी adventitia और महाधमनी पोत दीवार के प्रतिनिधि छवि प्रतिनिधि प्रवाह cytometry काउंटर साजिश CD45 की उपस्थिति + टी कोशिकाओं adventitia और महाधमनी दीवार में आयु वर्ग APOE के दर्शाता है . एसएससी के पक्ष तितर बितर. मलबे और परिगलित ऊतकों से autofluorescence खत्म करने के लिए, भूखंडों> FSC 750 के लिए gated थे. दोहरी फाटक भी FSC <3500, 3500 <एसएससी के रूप में स्थापित से अतिरिक्त autofluorescence से बचने के लिए. प्रतिशत फाटकों में CD45 + कोशिकाओं से संकेत मिलता है.
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Discussion
यहाँ, हम murine aortas प्रतिरक्षा सेल संरचना की जांच के लिए एक प्रवाह cytometry आधारित विधि प्रस्तुत करते हैं. इस विधि का प्रमुख लाभ के लिए एक एकल कोशिका के स्तर पर महाधमनी प्रतिरक्षा कोशिकाओं का विश्लेषण और महाधमनी leukocytes के सक्रियण स्थिति विशेषताएँ करने की क्षमता है. इस विधि murine aortas तक ही सीमित नहीं है और (अप्रकाशित डेटा) हम और 10 अन्य इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल करने के लिए आंतरिक स्तन धमनी, महाधमनी वाल्व और कोरोनरी धमनियों के रूप में मानव नमूनों का विश्लेषण. इस पद्धति का एक सीमा murine महाधमनी बरामद leukocytes एकल aortas की संख्या अपेक्षाकृत कम है. जबकि एक एकल atherosclerotic महाधमनी से बरामद leukocytes के एक प्रवाह cytometry प्रयोग के लिए पर्याप्त संख्या है, जो बहुतायत में कम कर रहे हैं कोशिकाओं के लिए एक एकल महाधमनी सेल निलंबन में पता लगाने के लिए मुश्किल हो सकता है. यदि आवश्यक हो, प्रवाह cytometry धुंधला के लिए 2-4 aortas से संयुक्त नमूने का उपयोग करके इस समस्या circumvented किया जा सकता है. इसके अलावा, एंजाइम उपचार के बाद से सतह प्रतिजनों की अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकता है, एंजाइम उपचार के लिए प्रतिरोध ब्याज के सभी प्रतिजनों के लिए निर्धारित होना चाहिए. हम पहले से कई प्रतिजन मार्करों, जो enzymatic पाचन 7 द्वारा अप्रभावित रहे हैं पुष्टि की है . हालांकि, untested एंटीबॉडी क्लोन प्रवाह cytometry 7 प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा रहा से पहले अन्वेषक द्वारा मान्य होना चाहिए.
प्रतियोगी दत्तक हस्तांतरण घर वापस आना परख सूजन के एक साइट के लिए ल्युकोसैट भर्ती के कैनेटीक्स और तंत्र का विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली विधि है. हम सफलतापूर्वक प्राप्तकर्ता चूहों से aortas के प्रवाह cytometry विश्लेषण लागू aortas ल्युकोसैट प्रवास के तंत्र की जांच 7. हाल ही में proliferated कोशिकाओं का विश्लेषण, vivo में bromodeoxyuridine (Brdu) का समावेश proliferating कोशिकाओं के लिए एक उत्कृष्ट मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. हम निम्न प्रवाह cytometry विश्लेषण करने के लिए प्राप्तकर्ता चूहों के aortas में प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं का पता लगाने के साथ इस तकनीक को लागू 7.
वहाँ सुझाव है कि महाधमनी adventitia atherogenesis में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता सबूत के एक बढ़ती शरीर है. आसपास adventitia साथ aortas के immunohistochemical धुंधला विश्लेषण ऊतकों के भीतर ल्युकोसैट स्थानीयकरण के बारे में आवश्यक डेटा प्रदान करता है, लेकिन ल्युकोसैट subpopulations की विस्तृत लक्षण वर्णन में कुछ सीमा होती है है. हम एक प्रवाह cytometry आधारित तरीका है कि अच्छी तरह से स्थापित ऊतक विज्ञान और आणविक आधारित तकनीक के साथ संयोजन के रूप में महाधमनी के विश्लेषण और आसपास adventitia अलग 9 इस रोमांचक नई प्रवाह cytometry आधारित तकनीक, परमिट विकसित की है, phenotypical और संभव मतभेद की पहचान करने में मदद करेगा adventitial और पोत दीवार रहने leukocytes के कार्यात्मक विशेषताओं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
HL55798 PO1 (के.एल. करने के लिए) और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन वैज्ञानिक विकास अनुदान 0525532U (उदा): इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase XI | Sigma-Aldrich | C7657 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| DNase I, type 2 | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| Collagenase I | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Collagenase II | Worthington Biochemical | LS004174 | |
| Elastase | Worthington Biochemical | LS002292 |
References
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