Análisis por citometría de flujo de células inmunes dentro de aortas murino

Summary

Este trabajo presenta una citometría de flujo basado en el método para investigar la composición inmunológica de aortas. El documento también muestra una técnica adicional que permite examinar los alrededores y adventicia pared de los vasos por separado. Este método abre la posibilidad de realizar análisis fenotípico de los leucocitos aórtica y aplicar varios ensayos inmunológicos para los estudios de la aterosclerosis.

Abstract

La aterosclerosis es un proceso inflamatorio crónico de los barcos de tamaño medio y grande que se caracteriza por la formación de placas consiste en células espumosas, células del sistema inmune, las células vasculares endoteliales y de músculo liso, plaquetas, la matriz extracelular, y un núcleo rico en lípidos, con extensa necrosis y fibrosis de los tejidos circundantes. ¹ Los brazos innata y adaptativa de la respuesta inmune están implicados en la iniciación, desarrollo y la persistencia de la aterosclerosis. ^{2, 3} hay un importante cuerpo de evidencia de que los diferentes subconjuntos de las células inmunes, como los macrófagos, dendríticas las células, los linfocitos T y B, están presentes en las aortas de los ratones sanos y con tendencia ^{aterosclerosis-4.} Además, las células inmunes se encuentran en la adventicia aórtica rodea lo que sugiere un papel importante de este tejido en la aterogénesis. ²

Desde hace algún tiempo, la detección cuantitativa de los diferentes tipos de células del sistema inmune, su estado de activación, y la composición celular dentro de la pared de la aorta se vio limitada por RT-PCR y los métodos de inmunohistoquímica para el estudio de la aterosclerosis. Pocos intentos se hicieron para realizar citometría de flujo utilizando aortas humanos, y una serie de problemas, tales como una alta autofluorescencia, se han reportado ^5,6. Las placas ateroscleróticas humanas fueron digeridos con colagenasa 1, y se recogieron las células libres y se tiñeron de CD14 + / + CD11c para destacar derivada de macrófagos en células espumosas. En este estudio, un "simulacro" de canal se utiliza para evitar falsos positivos tinción. ⁶ material necrótico acumulado durante el proceso de digestión dar lugar a una gran cantidad de desechos que genera una alta autofluorescencia en las muestras de la aorta. Para resolver este problema, un panel de controles positivos y negativos se ha propuesto, pero sólo la doble tinción se podría aplicar en estas muestras. Hemos desarrollado un nuevo flujo de citometría basado en el método ⁷ para analizar la composición de las células inmunitarias y caracterizar la activación, proliferación, diferenciación de las células inmunes en aorta sana y propenso aterosclerosis. Este método permite la investigación de la composición de las células inmunes de la pared aórtica y abre la posibilidad de utilizar una amplia gama de métodos inmunológicos para la investigación de los aspectos inmunológicos de la enfermedad.

Protocol

1. El aislamiento de aortas murino

La aprobación del comité institucional IACUC del procedimiento es necesario para trabajar con ratones.

1. Prepare heparinzed PBS mediante la adición de 1000 unidades de heparina sódica a 50 ml de PBS y la vuelta al tubo para mezclar. Preparar un tubo de recogida de vacío para la sangre y un tubo de colección que contiene PBS para cada aorta para ser recogidos. Mantenga todos los tubos en hielo.
2. Heparinizar una jeringa para extraer sangre (0,1 ml de Heparina sódica 1000 U / ml), preparar las herramientas quirúrgicas (dos pares de pinzas curvas, un par de tijeras de disección, y un par de microshears), y una etapa de la disección de la disección.
3. La eutanasia a un ratón que utiliza dióxido de carbono en una cámara de aprobado tras NIH y las políticas institucionales del comité IACUC respecto a la eutanasia de roedores. Comprobar la eficacia antes de transferir el ratón a la etapa de disección.
4. Brevemente empapar el ratón con el 70% de etanol y sujetar el ratón a la etapa de la disección. Extraer la sangre del ratón a través de punción cardíaca.
5. Abra las cavidades abdominal y torácica. Con una jeringa de 10 ml con una aguja de 25 g, completamente perfundir los vasos con PBS que contenía 2% de la heparina para eliminar completamente la sangre de los vasos por punción cardiaca. Asegúrese de que no hay sangre en los tejidos de la aorta. La perfusión debe realizarse lentamente y con poca presión para asegurar que todas las placas en la pared del vaso se mantienen intactos.
6. Diseccionar y extraer las vísceras, órganos genitourinarios, el diafragma y el bazo, dejando a los riñones, el corazón y la aorta intacta.
7. Diseccionar cuidadosamente el tejido adiposo y para-aórtica ganglios linfáticos lejos de la aorta, dejando a la aorta y la adventicia intacta. Recopilar toda la aorta incluyendo arco aórtico, ascendente, descendente, torácica, abdominal y porciones. Coloque la aorta aislada en un tubo de recogida con PBS. Durante el procedimiento de aislamiento, trate de mantener la humedad del buque.

2. Preparación de suspensiones de células individuales

1. Crear un Aorta 1X enzima disociación solución madre (ADES) (125 U / ml de colagenasa tipo XI, 60 U / ml tipo hialuronidasa 1-s, 60 U / ml DNasa I, y 450 U / ml colagenasa tipo I, en 2,5 ml de PBS, modificado a partir de Galkina et al. ^7). Todas las enzimas son de Sigma-Aldrich. Coloque la solución de la enzima de valores en el hielo.
2. Retire el PBS del tubo de colección que contiene la aorta. Añadir 2,5 ml de 1X a cada ADES aorta. Cortar las aortas en trozos pequeños para facilitar la digestión enzimática o salir de la aorta todo intacto. Incubar las aortas con la solución de la enzima 1X durante 1 hora a 37 ° C (más lento temblor es opcional).
3. Después de la incubación de 1 hora, preparar suspensiones de células individuales de la aorta digerido por corte de la aorta y, aparte de pasarlos por un colador m 70 células en 5 ml de polipropileno FACS tubos (BD Falcon). Precipitar las células por centrifugación (400xg, a 5 minutos, 4 ° C).
4. Resuspender las células en 1 ml de tampón FACS (PBS suplementado con BSA al 1% y 0,05% de NaN ₃₎ y determinar cómo las células están presentes en la suspensión de células de aorta con azul de tripano, un hemocitómetro, y un microscopio de luz. El número total de células obtenidas después de la digestión depende de la edad del ratón y la dieta o la severidad de la aterosclerosis.

3. Citometría de flujo de tinción

1. Etiqueta de un número adecuado de nuevos tubos de FACS. En general, los experimentos de citometría de flujo debe tener un tubo de control no de colores, juego de tubos de un solo color, fluorescencia apropiado-menos-uno de control (FMO) ^8, los controles apropiados isotipo, y un conjunto de tubos experimental. Puesto que hay un número limitado de leucocitos aórtica que puede ser aislado, los leucocitos del bazo se puede utilizar para realizar la tinción de control único.
2. Utilizamos un protocolo de citometría de flujo estándar para teñir las suspensiones de células de aorta. En pocas palabras, la transferencia de una parte alícuota de 0,5-1x10 ⁶ células de una suspensión de células de la aorta en un tubo de FACS (s). Añadir 1 ml de tampón FACS y precipitar las células por centrifugación. Eliminar el sobrenadante de las células se sedimentan por decantación.
3. Prepare una solución de Fc bloque y cócteles de anticuerpos para los tubos de experimentación, los tubos de fluorescencia-menos-uno, y los tubos de isotipo. Agregar 100μl de Fc bloque en tampón FACS (14.2μg/ml, clon 2.4G2) para todos los tubos y la película de los dedos o suavemente vortex para resuspender las células. Incubar las muestras durante 15-20 minutos a temperatura ambiente.
4. Prepare la tinción de anticuerpos, la tinción de isotipo o cócteles FMO control de las manchas. Determinar la concentración óptima de anticuerpos en los experimentos de titulación previa. En presencia de bloqueo Fc, añadir un cóctel de anticuerpos (100ul/0.5-1.0x10 ⁶ celdas) para los tubos de muestra. Incubar durante 20-30 min a 4 ° C en la oscuridad.
5. Añadir 1 ml de solución tampón FACS a cada tubo y agitar para mezclar, y que sedimenten las células por centrifugación. Repita el procedimiento una vez más.
6. Se decanta el sobrenadante y resuspenderlas células sedimentadas en 300μl de 2% PFA. Ejecutar las muestras en un citómetro de flujo.
   • Nota: Por lo general de anticuerpos anti-CD45 (antígeno leucocitario marcador común) se añade a todas las muestras con el fin de puerta de leucocitos CD45 ⁺ después ⁷ Además, CD45 FMO y controles de isotipo debe ser utilizado inicialmente para colocar la puerta de leucocitos CD45 ⁺ como. CD45 expresión puede variar entre los leucocitos.
   • Nota: Para la detección de baja densidad que expresan antígenos de superficie o antígenos de baja de eventos, utilice "fluorocromos brillante" como el R-ficoeritrina (PE) o aloficocianina (APC). Además, los eventos poco comunes pueden ser detectados por la agrupación de varias aortas combinarse juntos, sin embargo si hay más de un millón de células se utilizan, la cantidad de anticuerpos utilizados por cada prueba se debe aumentar proporcionalmente.
   • Nota: Para asegurarse de que hay un mínimo de contaminación de sangre en la aorta aislada y por lo tanto en la suspensión de células de aorta, en algunos experimentos adicionales tinción se realizó para TER-119, ^{7 de} un antígeno expresado por las células rojas de la sangre (glóbulos rojos). El número de glóbulos rojos a los glóbulos blancos (WBC) en la sangre es de aproximadamente 10x10 ⁶ células / microlitro de 8x10 ³ células / microlitro. Basado en la expresión de TER-119 en muestras de la aorta, el porcentaje de derivados de la sangre los glóbulos blancos en la muestra se puede calcular. Por lo general tenemos menos del 0,02% de derivados de la sangre del CMB en las muestras de la aorta. (Fig. 1)
   • Nota: Dado que el tratamiento enzimático puede afectar la expresión de antígenos de superficie, la resistencia a la digestión de la enzima debe ser determinada por los antígenos de interés. En pocas palabras, los ganglios linfáticos periféricos (PLN) o pequeños trozos de bazo son incubadas con o sin cóctel de enzimas durante 1 hora a 37 ° C. Después de 1 hora, la expresión de antígenos está determinada por citometría de flujo. El cóctel de enzimas no tiene efecto en varios antígenos de superficie (Fig. 2) ^7. En otros casos, el tratamiento enzimático como resultado una pérdida significativa de la expresión del antígeno. Este problema puede evitarse mediante el uso de marcadores alternativos celular.
   • Nota: tinción de viabilidad celular en vivo / muerto puede ser realizado después del paso 4, si lo desea. Suelen utilizar Live / Dead kit Corregir Dead Cell Stain (Invitrogen, Molecular Probes). Para la tinción de las células con medio de contraste en vivo / muerto, crear una solución 1x Live / Dead añadiendo 1μl de re-disuelto en vivo / muerto de colorante en 1 ml de PBS y agitar para mezclar. Añadir 100-200 l de 1x tinte Live / Dead en vivo a los / muertos cóctel único, FMO y las muestras de control de isotipo. Incubar las muestras con el colorante a temperatura ambiente durante 10 minutos en la oscuridad. El tubo de control único para Live / Dead deben ser incubados a 56 ° C en la oscuridad durante 10 minutos para matar las células por el choque térmico. Se lavan las células con 1 ml de PBS y el pellet de las células por centrifugación. Reanudar el protocolo en el paso 5.
   • Nota: tinción intracelular de antígenos intracelulares y las citocinas es compatible con este protocolo. En pocas palabras, la tinción intracelular se puede realizar utilizando la fijación de células / reactivos permeabilización de BD Pharmingen, eBioscience, o laboratorios Caltag - dependiendo de los antígenos de interés. Para fijar y permeabilizar las células para la tinción intracelular, realizar la etapa de fijación / permeabilización, siguiendo las instrucciones del fabricante, después del paso de tinción extracelular (sección 3 punto 5). Después de la etapa de lavado intracelular, reanudar el protocolo en el paso 6 (sección 3 el paso 6).

4. Análisis de flujo de citometría de aislamiento alrededor de la adventicia y la pared del vaso

Como los leucocitos pueden migrar a la adventicia aórtica, así como las placas de ateroma en la pared de la aorta, para examinar los leucocitos y la adventicia aórtica por citometría de flujo de un protocolo para el aislamiento y la realización de la citometría de flujo en estos dos sitios anatómicos se ha desarrollado. ⁹ En resumen, antes de las aortas todo se digieren con ADES (Sección 2, paso 2) la adventicia aórtica es parcialmente digerido y alejada del resto del buque. Una vez que se elimina la adventicia y dejar de lado, el resto de la aorta se digiere con ADES para liberar a los leucocitos de la pared del vaso.

• Adventicia aórtica aislamiento Protocolo

1. Después de la preparación de 1X ADES (sección 2 paso 1), preparar 2,5 ml / aorta de 1X aórtica solución enzimática adventicia de digestión (AADES) (781,25 U colagenasa II y 14.0625 U elastasa en 2.5mls PBS (Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NJ )). ⁹ Coloque la solución madre en hielo hasta su uso.
2. Retire el PBS del tubo de colección que contiene la aorta. Añadir 2,5 ml de 1X a cada AADES aorta. No corte las aortas en trozos pequeños. Incubar las aortas con la solución de la enzima 1X adventicia durante 10-20 minutos a 37 ° C.
3. Después de la digestión de 10-20 minutos, la transferencia de la aorta parcialmente digeridos de la 1X AADES a una placa de Petri con PBS. Con mucho cuidado, con dos pares de pinzas curvas, la cáscara de la capa adventicia de distancia from la aorta como una sola unidad.
   • Nota: más largos de digestión sea más fácil para eliminar la adventicia, sin embargo, si la adventicia es más de digerir que se rompa.
4. Cuando la adventicia se ha eliminado por completo, la transferencia de la adventicia y la aorta a los tubos de FACS separado. Añadir 1 ml de PBS al tubo de la adventicia, y colocar el tubo en hielo. Añadir 2,5 ml de solución 1X aorta enzima disociación en el tubo de la aorta y la aorta se incuban durante 40 minutos a 37 ° C.
   • Nota: Para facilitar la digestión enzimática, la aorta se puede dividir en partes más pequeñas en este momento.
5. Después de la digestión de 40 minutos, coloque el tubo de la aorta en el hielo y preparar suspensiones de células individuales de la aorta y la adventicia de corte de la aorta y la adventicia de distancia y que pasa a través de un filtro de 70 micras de células en 5 ml de polipropileno FACS tubos (BD Falcon). Precipitar las células por centrifugación (400xg, a 5 minutos, 4 ° C). Volver al paso 4 sección 2 y reanudar el protocolo.

5. Resultados representante

Aquí les presentamos una serie de cifras que demuestran la citometría de flujo tinción para analizar la composición inmune de toda aortas, la pared del vaso aórtico y la adventicia aórtica alrededores. En primer lugar, demostrar un representante FACS trama que muestra un TER-119 manchado de la sangre y la suspensión de células aisladas de aorta (Fig. 1). TER-119 células rojas de la sangre positivos representaron el 18% de las células en la suspensión de células de aorta, lo que indica que sólo el 0,014% de las células aisladas a partir de suspensiones celulares aórtica son derivados de la sangre. Este es un experimento de control importante que demuestra claramente que los buques digerido, pero no circulación de la sangre periférica es la fuente de la mayoría de los leucocitos analizados en la suspensión de células de aorta. Además, para validar el método, se evaluaron los efectos de la aorta cóctel de enzimas disociación de los antígenos de superficie de esplenocitos (Fig. 2). El cóctel de enzimas no tiene ningún efecto sobre la expresión de varios antígenos, incluyendo, CD45, CD19, CD3, otros antígenos TCRαβ, TCRγδ y varios superficie ^7.

Tinción CD45 en combinación con colorantes viabilidad Live / Dead y controles apropiados isotipo se utilizan para detectar y sub-poblaciones de la puerta principal de interés y de excluir a los desechos celulares durante el análisis. En la figura 3, la aorta viven los leucocitos CD45 ⁺ fueron cerradas para determinar el porcentaje de IFN _Υ + células T en las aortas agrupado de dos jóvenes ApoE ^{- / -} ratones. Hacer hincapié en la versatilidad de este método, utilizando el esquema de gating presentado en la figura 3, se presenta en la Fig. 4 tinción intracelular representante de CD68 + CD11b + macrófagos y las células IFN + TCRαβ + a partir de dos ApoE ^{- / -} ratones alimentados con la dieta occidental durante 12 semanas. Como era de esperar, en el oeste de la dieta alimentar ApoE ^{- / -} aortas, la mayoría de los leucocitos en la aorta son los macrófagos (40% CD68 + CD11b +) o de otras células mieloides (CD11b + ^bajo + CD68 y CD68-CD11b). Además, las células Th1 constituyen una parte importante de la infiltración de la aorta TCRαβ las células T (Fig. 4). A medida que el porcentaje total de leucocitos aórtica y subconjuntos de leucocitos varía en función de la edad del ratón y la severidad de la aterosclerosis, la estrategia de gating óptima para las principales poblaciones de interés debe ser determinada empíricamente

Para demostrar la viabilidad de aislar adventicia aórtica para la tinción de citometría de flujo, que presente un representante de leucocitos CD45 ⁺ tinción de células en suspensión y la adventicia aórtica (Fig. 5). Resumen, tres ApoE edad mediana ^{- / -} aortas ratón se digiere y se agruparon como se describió anteriormente (secciones 2 y 4). Infiltración de leucocitos CD45 ⁺ fueron detectadas tanto en la adventicia (18% de la suspensión celular) y el resto de la aorta (11% de la suspensión celular).

Figura 1. TER-119 tinción de células en suspensión digerida aórtica. Aorta fue perfundido por punción cardiaca con PBS que contenía 2% de la heparina. A continuación, la aorta se digirió con la enzima de cócteles durante 1 hora a 37 ° C. Suspensión de células de la aorta y la muestra de sangre (como un control positivo) fueron teñidas con anti-TER-119-PE Abs y analizadas por citometría de flujo. TER-119-positivas las células rojas de la sangre representan el 18% de todas las células en la suspensión de células de aorta que indica que sólo el 0,014% de todos los leucocitos aislados de aorta es probable que sean derivados de la sangre leucocitos.

Figura 2. Enzyme-cóctel tratamiento no tiene efectos sobre CD45 (arriba) o CD19 (abajo) la expresión de los linfocitos. + / CD19 ⁺ linfocitos. Los perfiles son separadas en leucocitos CD45 ^+.

Figura 3 La estrategia de apertura de puerta para el análisis de los leucocitos aórtica dos aortas fueron aislados y agrupados de ApoE ateroscleróticas propensas ^{-.. / -} Ratones y suspensiones aórtica celulares se prepararon como se describió anteriormente. Las suspensiones celulares fueron teñidas con CD45 (PerCP), TCRαβ (FITC), IFN (eFluor 450), y Aqua Live / Dead, y se analizaron mediante un Cytek DXP 8 Color actualizado BD FACS Calibur. En pocas palabras, leucocitos CD45 ⁺ fueron cerradas (B) y seguirá analizando (CF). Las células muertas fueron retirados del análisis basado en la tinción de Aqua Live / Dead (D) y las parcelas del FSC (E). Viven los leucocitos aórtica fueron examinados para TCRαβ y IFN expresión (F).

.. La figura 4 tinción intracelular de antígenos intracelulares y citoquinas suspensiones celulares fueron preparados a partir de un conjunto ApoE ^{- / -} aorta y el bazo como se describe. Aórtica (A) y las suspensiones de células del bazo (B, C) fueron teñidas con CD45, CD11b, CD68 y un control de isotipo o utilizando BD Cytofix / Cytoperm Kit ™ (BD Biosciences). Las células fueron separadas en leucocitos CD45 ⁺ y los escombros fue excluido en base a los perfiles de dispersión frontal y lateral. Para la tinción intracelular de IFN, las suspensiones de células del bazo y la aorta se cultivaron durante cinco horas en RPMI 1640 complementado con un deje de Golgi, PMA, y C Ionomycin, como se describió anteriormente. ⁹ Estimulado aórtica sola (D) y esplénica (E, F) suspensiones celulares fueron posteriormente teñidas con CD45 (PerCP), TCRαβ (FITC), CD3 (APC-Cy7), Live Aqua muertos, y IFN (eFluor 450, E) o un isotipo (IgG1-eF450, F). Las células T (DF) fueron cerradas a partir de vivir CD45 + CD3 + leucocitos (CD45 + Live / Dead Aqua-) y se examina para TCRαβ y IFN.

.. Figura 5 imagen representativa de la aorta aislada murino adventicia y vasos pared de la aorta flujo Representante complot contra citometría demuestra la presencia de CD45 ⁺ células T en la adventicia y la pared aórtica de edad ApoE ^{- / -} ratones. SSC-lado de dispersión. Para eliminar la autofluorescencia de los desechos y los tejidos necróticos, las parcelas fueron cerradas por el FSC> 750. Para evitar la autofluorescencia adicionales de los dobletes de las puertas también se establecieron como FSC <3500, SSC <3500. Los porcentajes indican las células CD45 ⁺ en las puertas.

Discussion

A continuación, presentamos un método de la citometría de flujo basado en la investigación de la composición de las células inmunes de aortas murino. La principal ventaja de este método es la capacidad de analizar la aorta células del sistema inmune en un nivel de células individuales y para caracterizar el estado de activación de los leucocitos aórtica. Este método no se limita a aortas murino y nosotros (datos no publicados) y otras ^{10 personas} utiliza este enfoque para analizar las muestras humanas, como la arteria mamaria interna, las válvulas aórtica y las arterias coronarias. Una limitación de este método es el número relativamente bajo de leucocitos murinos aórtica recuperado aortas sola. Mientras que el número de leucocitos se recuperó de una aorta aterosclerótica sola es suficiente para un experimento de citometría de flujo, las células que son bajos en abundancia puede ser difícil de detectar en una suspensión aórtica sola célula. Si es necesario, este problema puede evitarse mediante el uso de muestras combinadas 2-4 aortas para la tinción de citometría de flujo. Además, dado que el tratamiento enzimático puede afectar la expresión de antígenos de superficie, la resistencia al tratamiento con la enzima debe ser determinado para todos los antígenos de interés. Hemos validado previamente varios marcadores de antígenos, que se ven afectados por la digestión enzimática ^7. Sin embargo, los clones de anticuerpos no probados deben ser validados por el investigador antes de ser utilizados en los experimentos de citometría de flujo ^7.

Ensayo competitivo transferencia adoptiva homing es un poderoso método para analizar la cinética y los mecanismos de reclutamiento de leucocitos en un sitio de la inflamación. Hemos aplicado con éxito el análisis de citometría de flujo de aortas de los ratones receptores para investigar el mecanismo de migración de los leucocitos a las aortas. ⁷ Para analizar las células proliferado recientemente, la incorporación de bromodesoxiuridina (BrdU) en vivo puede ser utilizado como un excelente marcador para la proliferación de las células. Hemos aplicado esta técnica con el siguiente análisis de citometría de flujo para detectar antígenos específicos de células T en las aortas de los ratones receptores. ⁷

Hay un creciente cuerpo de evidencia que sugiere que la adventicia aórtica juega un papel importante en la aterogénesis. Tinción inmunohistoquímica de aortas con la adventicia rodean proporcionan datos esenciales sobre la localización de leucocitos en los tejidos analizados, pero tiene algunos límites en la caracterización detallada de las subpoblaciones de leucocitos. Hemos desarrollado un método basado en citometría de flujo que permite el análisis de la aorta y sus alrededores adventicia por separado ⁹ Esta emocionante nueva técnica de citometría de flujo basado en conjunto con la histología bien establecidas y las técnicas moleculares basadas, ayudará a identificar las posibles diferencias en las características fenotípicas y características funcionales de los leucocitos residentes de la adventicia y la pared vascular.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase XI	Sigma-Aldrich	C7657
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506
DNase I, type 2	Sigma-Aldrich	D4527
Collagenase I	Sigma-Aldrich	C0130
Collagenase II	Worthington Biochemical	LS004174
Elastase	Worthington Biochemical	LS002292