미생물 매트에서 높은 분자량의 DNA의 추출
Summary
우리는 hypersaline 미생물 매트에서 높은 분자량의 DNA를 추출하기위한 개선된 프로토콜을 제공합니다. 미생물 세포는 DNA 추출 및 정화하기 전에 매트 매트릭스에서 분리됩니다. 이것은 농도, 품질 및 DNA의 크기를 향상시킵니다. 프로토콜은 다른 내화물 샘플에 사용할 수 있습니다.
Abstract
metagenomic 데이터의 성공적인 정확한 분석과 해석은 고품질, 높은 분자량 (HMW) 커뮤니티 DNA의 추출 효율에 의존적일 수 밖에 없습니다. 그러나, 환경 매트 샘플은 종종 높은 품질 HMW DNA의 큰 농도를 구하기 위해 어려움을 제기. Hypersaline의 미생물 매트 높은 세포외 고분자 물질의 양의 (EPS) 1 추출한 DNA의 다운 스트림 애플 리케이션을 억제 수 염분이 포함되어 있습니다. 직접적이고 거친 방법은 자주 내화물 샘플에서 DNA 추출에 사용됩니다. 매트, 접착제 매트릭스에 EPS 직접 용해하는 동안 DNA 2,3를 바인딩하기 때문에 이러한 방법은 일반적으로 사용됩니다. 엄격한 추출 방법의 결과로, DNA되고 작은 크기 4,5,6으로 조각.
DNA 따라서 대형 삽입 벡터 복제에 대한 부적 절한됩니다. 이러한 제한을 우회하기 위해, 우리는 hypersaline 미생물 매트에서 좋은 품질과 수량의 HMW DNA를 추출하는 개선된 방법을보고합니다. 우리는 혼합 및 차동 원심 분리를 통해 배경 매트 매트릭스에서 미생물 세포의 분리와 관련된 간접적인 방법을 고용. 기계적 및 화학적 절차 조합이 추출된 미생물 세포에서 DNA를 추출하고 정화하는 데 사용되었다. 우리 프로토콜 1.6 280분의 260의 비율로, 매트 샘플 g 당 HMW DNA (35~50킬로바이트)의 약 2 μg을 산출. 또한, 16 rRNA 유전자 7 증폭이 프로토콜은 오염 물질의 억제 효과를 최소화하거나 제거할 수 있다고 제안합니다. 우리의 결과는 기능 metagenomic 연구 미생물 매트에서 HMW의 DNA의 추출을위한 적절한 방법을 제공하고 DNA 추출이 어려운있는에서 다른 환경 시료에 적용할 수 있습니다.
Protocol
Discussion
복잡하고 매우 다양한 미생물 매트 샘플에서 전체 세포 제거 실용적 아니라는 것을 감안할 때, 기본 우려가 추출된 세포가 전체 미생물 매트 커뮤니티를 대표하는 얼마나 잘됩니다. 이전 연구에서는 미생물의 유전자 16 rRNA의 PCR – DGGE 분석이 프로토콜에 사용되는 다섯 셀 제거 단계를 전체 미생물 매트 커뮤니티 7 대표하는 세포를 추출 것으로 나타났다. 세포 추출의 실제 번호는 전체 미?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 환경 게놈 프로그램 (그랜트 번호 EF – 0723707)에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Promega | V3011 | 20% in 1.2 M NaCl |
| Potassium acetate | Fisher Scientific | Fisher Scientific | |
| Quant-iT dsDNA Assay kit | Invitrogen | Q33130 | |
| RNase | Epicentre | MRNA092 | |
| Sodium Chloride | BDH Chemicals | BDH8014 | Appropriate conc. |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | 03-500-509 | 10% in water |
| sodium hexametaphosphate | EMD Chemicals | SX0583-3 | 2% in water |
| TBE | Fisher Scientific | BP1333-1 | |
| CHEF Mapper XA System | Bio-Rad Laboratories | 170-3670 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Vortexer | Scientific Industries Inc. | ||
| Ultraviolet Crosslinker | UVP | ||
| Waring blender | Waring laboratory | LB10S |
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