نحن نقدم بروتوكول محسنة لاستخراج الحمض النووي عالية الوزن الجزيئي من الحصير الجرثومية الشديدة الملوحة. يتم فصل الخلايا الميكروبية من مصفوفة حصيرة قبل استخراج الحمض النووي وتنقيتها. هذا من شأنه أن يعزز تركيز ، والجودة ، وحجم الحمض النووي. ويمكن استخدام بروتوكول الحرارية للعينات أخرى.
تحليل ناجحة ودقيقة ، وتفسير البيانات metagenomic يعتمد على استخراج كفاءة عالية الجودة ، وارتفاع الوزن الجزيئي المجتمع الحمض النووي (HMW). ومع ذلك ، والعينات البيئية تشكل حصيرة غالبا ما يواجهون صعوبات في الحصول على تجمعات كبيرة عالية الجودة HMW الحمض النووي. الحصير الجرثومية الشديدة الملوحة تحتوي على كميات عالية من المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS) (1) والأملاح التي قد تمنع التطبيقات المصب من الحمض النووي المستخرج. وغالبا ما تستخدم أساليب مباشرة وقاسية في استخراج الحمض النووي من عينات الحرارية. وعادة ما تستخدم هذه الأساليب لأن العائد على السهم في الفرش ، ومصفوفة لاصقة ، تربط الحمض النووي 2،3 أثناء تحلل المباشر. نتيجة لأساليب أشد قسوة الاستخراج ، والحمض النووي أصبحت مجزأة إلى أحجام صغيرة 4،5،6.
الحمض النووي وهكذا يصبح مناسبة لاستنساخ ناقلات كبيرة إدراج. من أجل الالتفاف على هذه القيود ، ونحن التقرير منهجية محسنة لاستخراج الحمض النووي HMW من نوعية جيدة وكمية من الحصير الجرثومية الشديدة الملوحة. استخدمنا أسلوب غير المباشرة التي تنطوي على فصل الخلايا الميكروبية من الخلفية مصفوفة حصيرة من خلال المزج والطرد المركزي المغاير. وكان استخدام مجموعة من الإجراءات الميكانيكية والكيميائية لاستخلاص وتنقية من الحمض النووي للخلايا الجرثومية المستخرجة. بروتوكول لدينا ما يقرب من 2 ميكروغرام الغلة من الحمض النووي HMW (35-50 كيلوبايت) في كل غرام من العينة حصيرة ، مع نسبة 260 / 280 ألف من 1.6. وعلاوة على ذلك ، والتضخيم من جينات الرنا الريباسي 16S 7 تشير إلى أن البروتوكول هو قادر على تقليل أو القضاء على أي آثار المثبطة من الملوثات. نتائجنا توفر منهجية ملائمة لاستخراج الحمض النووي من الحصير HMW الميكروبية للدراسات الفنية وmetagenomic يمكن أن تنطبق على غيرها من العينات البيئية التي استخراج الحمض النووي هو التحدي.
نظرا إلى أن مجموع إزالة الخلية من المعقدة والمتنوعة للغاية العينات الجرثومية حصيرة ليس عمليا ، فإن القلق الأساسي هو مدى الخلايا المستخرجة تمثل حصيرة الميكروبية الشاملة المجتمع. في دراسة سابقة ، أظهرت PCR – DGGE تحليل الجينات الميكروبية 16S الرنا الريباسي أن إزالة الخلاي?…
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل هذا العمل من خلال برنامج المؤسسة الوطنية للعلوم البيئية جينوم (رقم المنحة EF – 0723707).
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Polyethylene glycol 8000 | Promega | V3011 | 20% in 1.2 M NaCl |
Potassium acetate | Fisher Scientific | Fisher Scientific | |
Quant-iT dsDNA Assay kit | Invitrogen | Q33130 | |
RNase | Epicentre | MRNA092 | |
Sodium Chloride | BDH Chemicals | BDH8014 | Appropriate conc. |
Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | 03-500-509 | 10% in water |
sodium hexametaphosphate | EMD Chemicals | SX0583-3 | 2% in water |
TBE | Fisher Scientific | BP1333-1 | |
CHEF Mapper XA System | Bio-Rad Laboratories | 170-3670 | |
NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
Vortexer | Scientific Industries Inc. | ||
Ultraviolet Crosslinker | UVP | ||
Waring blender | Waring laboratory | LB10S |