Biz hypersaline mikrobiyal paspaslar yüksek molekül ağırlıklı DNA ayıklamak için geliştirilmiş bir protokol sağlar. Mikrobiyal hücrelerin DNA ekstraksiyonu ve saflaştırma mat matris önce ayrılır. Bu konsantrasyonları, kalite ve DNA boyutunu artırır. Bu protokol, diğer refrakter numuneler için kullanılabilir.
Metagenomic veri Başarılı ve doğru analiz ve yorumlama, yüksek kaliteli, yüksek molekül ağırlığı (HMW) topluluk DNA verimli çıkarma bağımlı. Ancak, çevre mat örnekleri, genellikle yüksek kalite, HMW DNA yüksek konsantrasyonlarda elde etmek için zorluklar teşkil. Hypersaline mikrobiyal paspaslar, yüksek miktarda ekstraselüler polimerik maddelerin (EPS) 1. ve çıkarılan DNA alt uygulamalar inhibe edebilir tuzları içerir. Doğrudan ve sert yöntemleri genellikle refrakter örneklerinden DNA ekstraksiyonu kullanılır. Bu yöntemler, paspaslar, yapışkan bir matris, EPS direkt lizis sırasında DNA 2,3 bağlar, çünkü genellikle kullanılır . Sert ekstraksiyon yöntemlerinin bir sonucu olarak, küçük boyutları 4,5,6 parçalanmış DNA olur.
DNA, bu nedenle büyük eklemek vektör klonlama için uygun olur. Bu sınırlamaları aşmak için, biz hypersaline mikrobiyal paspaslar iyi kalite ve kantite HMW DNA ayıklamak için geliştirilmiş bir yöntem rapor. Biz karıştırma ve diferansiyel santrifüj yoluyla arka plan mat matris mikrobiyal hücrelerin ayrılması içeren dolaylı bir yöntem kullandı. Ayıklanan mikrobiyal hücrelerin DNA özü ve arındırmak için mekanik ve kimyasal işlemler bir arada kullanıldı. Bizim protokol 1,6 A 260/280 oranı, HMW DNA (35-50 kb) mat örnek gram başına yaklaşık 2 mikrogram verir. Ayrıca, 16S rRNA genleri 7 amplifikasyonu protokol bulaşanların herhangi bir inhibitör etkilerini en aza indirmek veya ortadan kaldırmak mümkün olduğunu göstermektedir . Bizim sonuçlarımız Fonksiyonel metagenomic çalışmalar için mikrobiyal paspaslar HMW DNA ekstraksiyonu için uygun bir yöntem sağlar ve diğer çevre örnekleri DNA ekstraksiyonu zorlu olduğu için geçerli olabilir.
Given that total cell removal from complex and highly diverse microbial mat samples is not practical, the primary concern is how well the extracted cells represent the overall microbial mat community. In a previous study, PCR-DGGE analysis of microbial 16S rRNA genes showed that the five cell removal steps used in this protocol extracts cells that are representative of the overall microbial mat community7. The actual number of cell extraction steps required to provide a cell pellet that is representative of th…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı Çevre Genomik Programı (Hibe No EF-0.723.707) tarafından finanse edildi.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Polyethylene glycol 8000 | Promega | V3011 | 20% in 1.2 M NaCl |
Potassium acetate | Fisher Scientific | Fisher Scientific | |
Quant-iT dsDNA Assay kit | Invitrogen | Q33130 | |
RNase | Epicentre | MRNA092 | |
Sodium Chloride | BDH Chemicals | BDH8014 | Appropriate conc. |
Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | 03-500-509 | 10% in water |
sodium hexametaphosphate | EMD Chemicals | SX0583-3 | 2% in water |
TBE | Fisher Scientific | BP1333-1 | |
CHEF Mapper XA System | Bio-Rad Laboratories | 170-3670 | |
NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
Vortexer | Scientific Industries Inc. | ||
Ultraviolet Crosslinker | UVP | ||
Waring blender | Waring laboratory | LB10S |