ويتم قياس الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني حركية النسخي على جينات معينة في الخلايا الحية. والموسومة fluorescently mRNAs مستنسخة من الجينات ذات الاهتمام به والانتعاش بعد الإسفار Photobleaching (FRAP) يتم الحصول على الحركية في الجسم الحي من استطالة النسخي.
Abstract
النشاط الترانسكربتي من الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني (بول الثاني) هو عملية دينامية وحركية قياس ذلك من عملية الترانسكربتي في الجسم الحي هو من الأهمية. وقد تم قياس حركية بول الثاني باستخدام طرق كيميائية حيوية أو الجزيئي. 1-3 في السنوات الأخيرة ، مع تطور أساليب التصور الجديد ، فقد أصبح من الممكن متابعة النسخ كما يحدث في الوقت الحقيقي في الخلايا الحية واحد. 4 هنا ونحن تصف كيفية لإجراء تحليل للبول حركية استطالة الثاني على جينات معينة في الخلايا الحية. 5 و 6 عن طريق خط الخلية التي يمكن أن تكون موضع جين معين (DNA) ، ناتجها مرنا ، والمنتج النهائي من البروتين fluorescently المسمى وتصور في الجسم الحي ، فمن الممكن للكشف عن النسخ الفعلية للmRNAs على الجينات في المصالح. fluorescently المفتاحية هي 7 و 8 ومرنا باستخدام نظام MS2 mRNAs للعلامات في الجسم الحي ، حيث 3'UTR من النصوص مرنا يحتوي على 24 حلقة MS2 الجذعية يكرر ، والتي توفر مواقع محددة للغاية ملزمة للبروتين معطف YFP – MS2 أن التسميات مرنا كما هو كتب 9 رصد حركية النسخ نستخدم الاسترداد بعد الإسفار Photobleaching (FRAP) الأسلوب. بواسطة photobleaching النصوص YFP – MS2 الموسومة الوليدة في موقع النسخ ثم بعد استرداد هذه الإشارة على مر الزمن ، ونحن الحصول على معدل تجميعي للmRNAs أدلى حديثا. 5 وبعبارة أخرى ، YFP – MS2 مضان يعكس الانتعاش الجيل من جديد MS2 الجذعية الحلقات في محاضر الوليدة وملزم من قبل الفلورسنت YFP – MS2 الجزيئات الحرة من دخول nucleoplasm المحيطة بها. ثم يتم تحليل المنحنيات الانتعاش FRAP باستخدام نماذج رياضية رسمية الآلي من خلال سلسلة من المعادلات التفاضلية ، من أجل استرداد المعلمات الوقت الحركية من النسخ.
Protocol
يجب أن تستخدم نظام خلية تحتوي على جينات بناء متكامل يتضمن تكرار متواليات MS2 لوضع علامات على مرنا في الخلايا الحية. في هذا البروتوكول نستخدم خلايا بشرية U2OS خط ايواء ستابلي متكاملة β – أكتين الجين ، وهذا هو fluorescently المسمى في الحمض النووي ، والجيش الملكي النيبالي ، و?…
Discussion
ويمكن تقسيم طريقة لقياس النشاط بوليميريز الحركية في الخلايا الحية إلى قسمين. الجزء الأول يصف "الرطب" الإجراء الذي يتيح للقياس واسترجاع البيانات من النسخ الحركية مرنا ، بينما في الجزء الثاني ، ويتم تحليل البيانات باستخدام نموذج ODE 5 هناك عدد من الدراسات الت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم YS – T من قبل مجلس البحوث الأوروبي (ERC) ، ومؤسسة العلوم اسرائيل (ISF) (250/06) وقوى الأمن الداخلي Bikura ، صندوق أبحاث السرطان في إسرائيل (ICRF) والألمانية الإسرائيلية مؤسسة للبحوث العلمية والتنمية (GIF ) ، الولايات المتحدة الأمريكية وإسرائيل مؤسسة العلوم ثنائية القومية (BSF) ، والألمانية الإسرائيلية مشروع التعاون (DIP) ، والوزارات الإسرائيلية للعلوم والصحة ، وأسرة جين Lebell ستيرن زميل في علوم الحياة في جامعة بار ايلان. YB ممتن للمؤسسة أزريلي لنيل الجائزة لزمالة أزريلي.