Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

قياس حركية النسخ مرنا في الخلايا الحية واحدة

doi: 10.3791/2898 Published: August 25, 2011

Summary

ويتم قياس الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني حركية النسخي على جينات معينة في الخلايا الحية. والموسومة fluorescently mRNAs مستنسخة من الجينات ذات الاهتمام به والانتعاش بعد الإسفار Photobleaching (FRAP) يتم الحصول على الحركية في الجسم الحي من استطالة النسخي.

Abstract

النشاط الترانسكربتي من الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني (بول الثاني) هو عملية دينامية وحركية قياس ذلك من عملية الترانسكربتي في الجسم الحي هو من الأهمية. وقد تم قياس حركية بول الثاني باستخدام طرق كيميائية حيوية أو الجزيئي. 1-3 في السنوات الأخيرة ، مع تطور أساليب التصور الجديد ، فقد أصبح من الممكن متابعة النسخ كما يحدث في الوقت الحقيقي في الخلايا الحية واحد. 4 هنا ونحن تصف كيفية لإجراء تحليل للبول حركية استطالة الثاني على جينات معينة في الخلايا الحية. 5 و 6 عن طريق خط الخلية التي يمكن أن تكون موضع جين معين (DNA) ، ناتجها مرنا ، والمنتج النهائي من البروتين fluorescently المسمى وتصور في الجسم الحي ، فمن الممكن للكشف عن النسخ الفعلية للmRNAs على الجينات في المصالح. fluorescently المفتاحية هي 7 و 8 ومرنا باستخدام نظام MS2 mRNAs للعلامات في الجسم الحي ، حيث 3'UTR من النصوص مرنا يحتوي على 24 حلقة MS2 الجذعية يكرر ، والتي توفر مواقع محددة للغاية ملزمة للبروتين معطف YFP - MS2 أن التسميات مرنا كما هو كتب 9 رصد حركية النسخ نستخدم الاسترداد بعد الإسفار Photobleaching (FRAP) الأسلوب. بواسطة photobleaching النصوص YFP - MS2 الموسومة الوليدة في موقع النسخ ثم بعد استرداد هذه الإشارة على مر الزمن ، ونحن الحصول على معدل تجميعي للmRNAs أدلى حديثا. 5 وبعبارة أخرى ، YFP - MS2 مضان يعكس الانتعاش الجيل من جديد MS2 الجذعية الحلقات في محاضر الوليدة وملزم من قبل الفلورسنت YFP - MS2 الجزيئات الحرة من دخول nucleoplasm المحيطة بها. ثم يتم تحليل المنحنيات الانتعاش FRAP باستخدام نماذج رياضية رسمية الآلي من خلال سلسلة من المعادلات التفاضلية ، من أجل استرداد المعلمات الوقت الحركية من النسخ.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يجب أن تستخدم نظام خلية تحتوي على جينات بناء متكامل يتضمن تكرار متواليات MS2 لوضع علامات على مرنا في الخلايا الحية. في هذا البروتوكول نستخدم خلايا بشرية U2OS خط ايواء ستابلي متكاملة β - أكتين الجين ، وهذا هو fluorescently المسمى في الحمض النووي ، والجيش الملكي النيبالي ، ومستويات بروتين 8 ، على النحو التالي (الشكل 1A) : 5 'من الجين يحتوي لبن المشغل ( lacO) يكرر -- تستخدم هذه العلامة لهذا الجين (DNA) وتحديد مكان وبالتالي الجينومية التكامل. وسوف الموسومة fluorescently بروتين لبن كاظمة (اسي) ربط يكرر lacO وعلامة ال DNA. والموسومة في mRNAs مع YFP - MS2 البروتينات التي تربط ليكرر MS2 (الجذعية الحلقات). المنتج الجين CFP - أكتين وبالتالي تحريض الجينات سيؤدي إلى ظهور CFP الموسومة الهيكل الخلوي أكتين. وبناء على transfected الجين الى تيت ، وفي خط U2OS الخلية مستقرة والتعبير عنها هي تحت السيطرة الترانسكربتي تيت.

1. طلي الخلية وترنسفكأيشن :

  1. قبل 48 ساعة من القياسات ، والبذور * ~ 2 10 5 الخلايا على القاع الزجاجي أطباق زراعة الأنسجة (35 ملم أطباق بتري مع microwell القاع الزجاجي 14 ملم (0،16-0،19 مم سمك ؛ القط رقم P35G - 1.5 - 14 - C ، ماتيك ، آشلاند ، MA)). إضافة 2ml من متوسطة إلى الخلايا ، من أجل التوصل إلى نقطة التقاء 50-80 ٪.
  2. قبل 24 ساعة من التجربة ، transfect عابر الخلايا مع البنى التي تعبر عن علامات الحمض النووي للنيون للعلامات ومرنا لل. FuGENE6 استخدام كاشف ترنسفكأيشن (روش).
    ويبني المستخدمة :
    1. سوف YFP - MS2 - NLS العلامة MS2 الجذعية الحلقات في محاضر مرنا. تسلسل توطين النووي (NLS) على تسلسل دخول النووي للبروتين YFP - MS2.
    2. اختياري -- CFP ، اسي أو طلب تقديم العروض لاسي من شأنها أن تربط بين يكرر lacO في "(5) والجينات ، وسوف تسمية موضع الجينات. علامات بموضع الجين يساعد في تتبع الجينات خلال التجربة FRAP ولكن ليس ضروريا.
  3. احتضان خلايا لا يقل عن 12 ساعة ، للحصول على التعبير جيدة من البروتينات transfected عابرة (انظر الحاشية).
  4. 6-12 ساعة قبل التجربة إضافة 1.5 ميكروغرام / مل الدوكسيسيكلين (سيغما) إلى الخلايا لتفعيل هذا الجين CFP - أكتين تيت ، محرض.

ملاحظات :
* ومن المهم عدم التعبير للوصول إلى مستويات عالية جدا من البروتينات transfected حتى لا تحجب الإشارات التي تم الحصول عليها من الموقع على وجه التحديد النسخ ، وبالنسبة للإشارة الخلفية. ويمكن التحكم في مستويات التعبير من خلال : أ) ضبط الوقت بين ترنسفكأيشن والتجربة ؛ ب) تغيير قوام promotor (مثل CMV أقوى من المروج L30) ج) إضافة إشارة الصادرات النووية (NES) إلى YFP - MS2 - NLS البروتين ، مما سيساعد على توزيع إشارة YFP في الخلية بأكملها.

* ينبغي أن fluorophore المستخدمة في القياسات يفضل اقتناء صامد للضوء في جميع أنحاء الطويل ؛ fluorophores الأخضر بالتالي انبعاث / الصفراء هي أفضل من fluorophores الحمراء. ويمكن الاطلاع على معلومات عن fluorophores مختلفة في المرجع 10.

* تحديد القنوات التي لا ضوء مختلف ينزف من خلال لبعضها البعض. استخدام الشرائح التي تحتوي على عينات المسمى مع كل من علامات على حدة ، في كل شريحة قياس كثافة كل من القنوات ، وحساب ثم تنزف من خلال.

2. FRAP :

يمكن إجراء التجربة على أي المجهر قادر على الحصول على الصور وعلى حد سواء أداء photobleaching مع شعاع الليزر. عادة ، يتم تنفيذ التجارب FRAP مع مجهر المسح الضوئي ليزر متحد البؤر (CLSM). ومع ذلك ، نظرا لأنه في حالتنا هذه التجربة طويلة نسبيا (15-30 دقيقة) ، ونحن على بعد واحد موضع صغيرة داخل النواة ، فمن المهم أن تكون قادرة على الحفاظ على مكان الجين / النسخ الموقع في التركيز طوال التجربة برمتها. وهذا يتطلب التصوير السريع في 3 أبعاد على مر الزمن (4D) ، ومعدلات اقتناء مثل هذه يصعب الحصول عليها باستخدام مجهر المسح مبائر. ولذلك ، فإننا نستخدم نظام 3D - FRAP (Photometrics) مبنية على المجهر واسعة المجال IX81 أوليمبوس (63X بخطة آبو ، 1.4 NA) مجهزة EM - CCD (كوانت - EM ، روبر) التي يمكن الحصول على صور بسرعة عالية (ما يصل إلى 30 صورة / ثانية). النظام لديه 405 نانومتر ، والليزر 491 نانومتر التي يمكن أن تكون متزامنة مع الكاميرا لتمكين photobleaching على منطقة محددة من الاهتمام (ROI) من العينة. وقد تم تجهيز المجهر مع مصدر امدا DG - 4 الخفيفة (سوتر) ومرحلة XY و Z (السابقة) التي تسمح بسرعة ودقة التصوير في Z - المحور. تم دمج جميع المعدات والتي تسيطر عليها MetaMorph (الأجهزة الجزيئية). وتجرى التجارب الحية الخلية عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2 باستخدام نظام الغرفة تعيش خلايا (توكاي).

  1. الإجراء : قبل نصف ساعة من التجربة ، بدوره على المجهر التدفئة ، وجهاز ليزر. خلال التجاربمنة يحتاج إلى درجة حرارة لا تزال مستمرة ، وإلا فإنه قد يسبب تغيرات التركيز خلال اقتناء مرات طويلة. يجب أن تكون مستقرة ليزر الطاقة لانتاج الطاقة متسقة.
  2. مزامنة الليزر مع الكاميرا :
    1. البحث عن مساحة في اللوحة التي لا تحتوي على خلايا (باستخدام DIC).
    2. استخدام قناة الخفيفة نفسها التي سيتم استخدامها في التجارب. هنا نستخدم الليزر 491 نانومتر للقناة YFP.
    3. نقطة الليزر لمنتصف الصورة.
    4. استخدام الزر مزامنة (شريطة الماكرو).
    5. محاولة مناطق مختلفة في هذا المجال لضمان تزامن الليزر والكاميرا.
  3. اختيار خلية مرشح جيد للتجربة. على الرغم من أننا نعمل مع خطوط الخلية مستقرة ، فإننا نجد أنه ليس كل الخلايا لديها مستويات مماثلة التعبير. سيكون مرشحا جيدا أن الخلايا ما يلي : أ) يحمل YFP - MS2 الموسومة موقع النسخ واضحة فوق منتشر YFP - MS2 الخلفية ، وب) YFP - MS2 حرة كافية من البروتين في الخلية بحيث تكون قادرة على استرداد تماما بعد photobleaching (على سبيل المثال في الشكل 1B -- مقارنة بين خليتين ، خلية اليسار ليس مرشحا جيدا للتبييض).
  4. اختيار المناسبة ظروف القياس. الإجراء FRAP يتطلب الحصول على العديد من الصور ، وبالتالي فإنه من المهم تحقيق التوازن بين أوقات التعرض معقولة واستخدام الضوء في أدنى مستوى ممكن. قد تؤثر على ضوء المستويات العالية الخلية بسبب الضيائية ، وسوف يسبب photobleaching. فمن المستحسن أن تبقي المعلمات التصوير المستمر بين التجارب المختلفة.
    يتم تصوير الخلايا في قناة YFP مع 150 مرات التعرض ميللي ثانية ، وفي القناة CFP للكشف عن CFP - اسي (موضع الجينومية) بعد موضع CFP - اسي الموسومة يسمح للكشف عن الجين حتى عند الإشارة YFP - MS2 مرنا هو photobleached (اختياري). لكل حيازة وZ - 7 شرائح تؤخذ كل نانومتر 350. غير المقشور في موقع النسخ النشطة باستخدام الليزر 491 نانومتر.
  5. إجراء تجربة كاملة ولكن دون التبييض. التجربة FRAP يقيس الوقت الذي يستغرقه لموقع النسخ للعودة إلى حالة مستقرة. أولا ، نريد للتحقق من أن موقع النسخ نشطة ومستقرة وظيفية في حالة مستقرة. ولذلك ، فإننا إجراء تجربة FRAP كاملة ولكن من دون تبييض لضمان قياس كثافة من موقع النسخ لا يتغير أثناء التجربة الإطار الزمني. نحن نستخدم هذه التجربة لاختبار أيضا لدينا ظروف التصوير عن طريق قياس photobleaching إجمالي الناتج عن سلسلة التصوير الكامل. وكقاعدة عامة ، ينبغي أن photobleach الفيلم كاملا وليس أن يكون أكثر من 30 ٪ من كثافة الأولي. ويمكن قياس ذلك باستخدام نسبة كثافة نفس المكان في النواة من الصورة الأخيرة ، مقسوما على الصورة الأولى (نسبة يجب أن تكون أكبر من 0.7).
  6. FRAP : غير المقشور إشارة YFP - MS2 في موقع النسخ النشطة باستخدام الليزر 491 نانومتر. يتم الحصول على 6 قبل التبييض الصور. يتم الحصول بعد التبييض الصور في تسلسل ترددات الساعة 3 : 15 صورة كل ثانية 3 ، 15 صورة كل ثانية 6 ، و 26 (أو 45 للتجارب طويلة) صور كل ثانية 30. التغيرات في تواتر الصور اكتساب يسمح للحصول على مزيد من الصور خلال الأوقات التي تظهر أعلى كثافة التغيير (الانتعاش الأولي) ، وأقل الصور في نهاية عندما يتغير في إشارة هي أقل وضوحا.

ملاحظات : هذه التجربة يختلف FRAP "العادية" في ذلك :
* FRAP من مرنا في موقع النسخ التدابير الملزمة للبروتينات MS2 YFP إلى مرنا الوليدة ، في حين أن التجارب النموذجية FRAP قياس الحركة من مختلف البروتينات في الخلية. لذا ، ليس هناك مصلحة في قياس تجمع ناشر من YFP - MS2 البروتينات. عندما يكون الوقت بين التبييض والصورة الأولى المكتسبة طويلة نسبيا فمن الممكن تجاهل هذه المجموعة من البروتينات نشرها YFP - MS2 الحرة.

* ومنذ استعادة إشارة YFP - MS2 طويلة نسبيا (15-30 دقيقة) ، فمن المهم للحفاظ على موقع النسخ في التركيز. هذا هو السبب يكتسب سلسلة من شرائح - Z في كل نقطة زمنية.

3. تطبيع البيانات FRAP :

يتم تحليل البيانات باستخدام FRAP 4D تحليل صورة البرمجيات الحرة ImageJ (المعاهد الوطنية للصحة في بيثيسدا ، دكتوراه في الطب ؛ http://rsb.info.nih.gov/ij/ ). فيما يلي تحليل أداء مع وحدات الماكرو المتوفرة من خلال برنامج ImageJ ، ولكن بالطبع يمكن أن تتولد ذاتيا كتابة وحدات الماكرو.

  1. Z - المداخن هي الحد الأقصى المتوقع في كل نقطة في الوقت ، مما يؤدي في فيلم 2D بمرور الوقت لمزيد من التحليل.
  2. يتم تعقب موقع النسخ في كل إطار ويتم قياس كثافة يعني استخدام أداة تعقب بقعة يتم حفظ البيانات في 11 ورقة اكسل لمزيد من التحليل.
  3. على كل نقطة في الوقت ، وتقاس شدة يعني في مناطق أخرى من الفائدة (ROI) على النحو التالي (باستخدام محلل السلاسل الزمنية في المكونات من ImageJ) : أ) إن الظهرأخذ أرض الواقع من عائد الاستثمار خارج الخلية B = (ر). ب) عائد الاستثمار في nucleoplasm ، ولكن بقدر الإمكان من موقع التبييض = C (ر). ج) موقع النسخ = S (ر) (مقاسا تعقب البقعة).
  4. تصحيح البيانات الخاصة photobleaching يحدث أثناء التصوير : طرح الخلفية من جميع القياسات الأخرى ومن ثم تصحيح التبييض. SC (ر) هو تصحيح للكثافة موقع النسخ في الوقت T.

مكافئ. 1 :
المعادلة 1

  1. تطبيع البيانات : أولا حساب متوسط ​​من الصور قبل التبييض ، مما يدل على شدة موقع النسخ في الحالة المستقرة ((pre-bleach)><Sc=).

ثم تطبيع البيانات :

مكافئ. 2
المعادلة 2

تم تطبيع البيانات لا يقل عن 10 تجارب. حساب متوسط ​​التجارب والانحراف المعياري (STD) لأشرطة الخطأ في كل نقطة في الوقت (الشكل 1C).

ملاحظات :
وقد تجاهلت نشر من البروتين YFP - MS2 خلال تحليل FRAP حيث أن معدل انتشار الخطوط النواة للMS2 - YFP سريعا جدا ، في حين يرتبط ملزمة YFP - MS2 مع تقارب عالية لمرنا ، ولا أعد إلى النسخ الموقع. هذا هو السبب يجب إزالة الصورة الأولى بعد التبييض قبل التحليل.

4. تحليل البيانات باستخدام نموذج رياضي :

استخدمنا من أجل استرداد المعلمات الحركية من هذا النوع من مجموعة البيانات ، ونموذج أبسط وصف يمكن أن تناسب هذا النوع من البيانات. يمكن قراءة شرحا وافيا لهذا نموذج معين هنا 5. نموذج يحتوي على المعادلات التالية التي تصف المخطط في الشكل 2A :

المعادلة 3
المعادلة 4

وجود المعلمات النموذج ، فمن الممكن لحساب معدل الاستطالة :

المعادلة 5

قمنا بتحليل منحنى باستخدام بيركلي مادونا ( http://www.berkeleymadonna.com ) ، وعلى غرار سابقا 5 ولكن هناك خيارات أخرى متاحة (MATLAB ، خلية الظاهري ، COPASI الخ). وتناسب البيانات إلى النموذج وانتزعت ثوابت المعدل. نعلق رمز مادونا في بيركلي. لكي تناسب أفضل بيانات حسبنا حالة مستقرة وتناسب ثم تطبيع البيانات التجريبية لنموذج تطبيع.

5. ممثل النتائج :

نحن photobleached إشارة مرنا في الموقع المسمى النسخ النشطة باستخدام الليزر عالية الطاقة ، وتلت انتعاش إشارة YFP - MS2 مع مرور الوقت. إشارة الفلورية في موقع النسخ يتكون من حركية الدولة المطرد للتوليف مرنا وكذلك مرنا صدر من الموقع. قياس كثافة موقع النسخ مع مرور الوقت من دون تبييض يعطي 'ثابت' إشارة (الشكل 1C ، النقط الحمراء) مما يعني أن هذا الجين هو حاليا في حالة من الثبات النسبي. وهذا يعني أن الإشارة التي تتراكم على مرنا كتب حديثا تساوي إشارة إلى أن يترك حين تطلق مرنا من موقع النسخ. عندما photobleached ، فإن هذا النظام لا يزال في حالة مستقرة ، ، ولكن من الممكن الآن لقياس الوقت الذي يستغرقه للإشارة إلى التعافي. ولذلك ، فإن الانتعاش من مضان تعتمد في معظمها على خصائص استطالة للبوليميريز. يسمح نظام FRAP 3D اقتناء حجم نووية كاملة 3D FRAP أثناء الاسترداد ، وبالتالي فقد أي إشارة خلال التجارب. لحساب المعلمات الحركية من بيانات ، تم تركيب المنحنى تطبيع للاستطالة نموذج الحركية التي تصف ، وهذا هو أساس المعادلات التفاضلية. (5) الاستفادة من استخدام نموذج بسيط ODE هو أن يكون لائقا لعدد قليل فقط من المعلمات . الخطوة الأولى من طراز (نقطة الدخول) هو استطالة ، وهي المسؤولة عن عملية توليف جديدة MS2 ملزم المواقع. الخطوة نهاية (نقطة الخروج) هو الافراج مرنا في nucleoplasm. ويستند هذا النموذج على منحنيات الانتعاش ، والتي تتكون من عنصرين هما حل kinetically ، وبسرعة أبطأ واحد واحد. عنصر سريع يشير إلى استطالة ، في حين كان على غرار ما أبطأ مكون بوليميريز التوقف أثناء استطالة. وعلى غرار الدول بوليميريز هما استطالة مع الانتقال إلى التوقف العشوائية. نحن الأمثل المعادلات التفاضلية من هذا الطراز ، والتي أسفرت عن سرعة استطالة 3.3 كيلو بايت / دقيقة مع انتقال العشوائية إلى معدل أبطأ التوليف (التوقف لفترة تراكمية من 2.5 دقيقة). وأظهرت النمذجة ثار هذا الانتقال من الاستطالة إلى التوقف تتأثر سوى 11 ٪ من polymerases التي دخلت استطالة.

K خارج 0.0112
K pause_in 0.0015
K pause_out 0.0067
استطالة الوقت (K + خارج pause_out ك) -1 56 ثوانى
توقف الزمن pause_out) -1 2.5 دقيقة
احتمال توقف (K pause_in) / (K + pause_in خارج ك) 11 ٪

الجدول 1. النموذج النتائج في جدول المعلمة.

الشكل 1
الشكل 1. (أ) نظام الخلية التجريبية المستخدمة لمتابعة التعبير الجيني في الجسم الحي. التمثيل التخطيطي للجين CFP - أكتين بناء. في نهاية 5' يحتوي على سلسلة من يكرر lacO 256 التي هي ملزمة RFP - اسي (الحمراء) ، وعلامة من موقع التكامل الجينات. ويتحقق تحريض الترانسكربتي من المروج CMV الحد الأدنى من الملزم للمنشط عكس الترانسكربتي التتراسيكلين (rtTA أو على تيت) تيت لتستجيب للعناصر (TRES) في حضور دوكس. وكتب مرنا يحتوي على تسلسل الترميز لأكتين - CFP - β ، و 24 MS2 يكرر أن لا بد من انصهار بروتين YFP - MS2. في نهاية 3' ، يليه جزء من وحدة اكسون الأرنب - إنترون اكسون - β - غلوبين بإشارة تشطر - polyA. مخطط يصف أيضا مقايسة استطالة تظهر البروتينات الفلورية MS2 (الصفراء) التي تعلق على mRNAs كتب حديثا كتب من قبل الجيش الملكي النيبالي بول الثاني (B) وكان موقع على النسخ photobleached النشط (YFP - MS2 ، والحق الخلية اليد) وكانت تتبع الانتعاش مضان مع مرور الوقت (إطارات في القاع). قمنا بقياس كثافة مضان كل من المبيض (خط الوسط) وغير المقشور (الخط السفلي) النسخ المواقع النشطة. لاحظ الخلية اليسرى ليست مناسبة لإجراء تجربة photobleaching (C) والقياسات التجريبية التي أجريت على مواقع الجينات النسخ CFP - أكتين. في منحنيات الانتعاش الزرقاء من القياسات FRAP YFP - MS2. في الحمراء ، وخلايا غير المقشور من نفس التجربة تظهر إشارة YFP - MS2 في موقع النسخ في حالة مستقرة.

الشكل 2
الشكل 2. (أ) مخطط للنموذج يصف حركية دخول وخروج ملحوظ مع mRNAs YFP - MS2 الجزيئات في موقع النسخ (ب) بيانات FRAP YFP - MS2 ومحاكاة المجهزة (تم تركيبها في المتوسط ​​من عشر تجارب لنموذج) . تعرض البقايا لتناسب محسوب في القاع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويمكن تقسيم طريقة لقياس النشاط بوليميريز الحركية في الخلايا الحية إلى قسمين. الجزء الأول يصف "الرطب" الإجراء الذي يتيح للقياس واسترجاع البيانات من النسخ الحركية مرنا ، بينما في الجزء الثاني ، ويتم تحليل البيانات باستخدام نموذج ODE 5 هناك عدد من الدراسات التي استخدمت هذا النهج الآن لاستخراج حركية النسخ في الخلايا الحية 5 ، 6 ، 8 ، 12-14. كان الفارق الرئيسي بين هذه الدراسات من الطريقة التي تم تحويلها إلى منحنى الانتعاش FRAP المعلمات الحركية. في كثير من الحالات تم استخدام النموذج الرياضي. وينبغي أن يكون نموذجا تصف عملية بيولوجية بطريقة بسيطة ومقارنة ثم إلى البيانات FRAP. مرة واحدة هناك علاقة جيدة بين البيانات والنموذج ، ينبغي للمرء أن تحقق هذا النموذج من قبل التجارب البيولوجية إضافية مثل قياسات آثار المخدرات أو مقارنة بين جينات مختلفة.

فمن الممكن أن يتخذ مزيد من التحليل أعلاه للحصول على نتائج إضافية الحركية. على سبيل المثال ، باستخدام نموذج photoactivatable من البروتين MS2 الفلورسنت فمن الممكن photoactivate النصوص مرنا ولدت بالفعل ومتابعة الإفراج عنهم (= انخفاض في كثافة مقابل استرداد إشارة يقاس FRAP) من موقع النسخ. 5 بالإضافة إلى ذلك ، في حين FRAP من MS2 الموسومة mRNAs حركية استطالة التدابير فقط ، FRAP الثاني بول GFP - RNA في موقع النسخ تعطي حركية عملية الترانسكربتي كله ، ألا وهي مرحلة ما قبل البدء ، بدء ، وإنهاء استطالة 5 ، 13 ، 15 ، 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ويدعم YS - T من قبل مجلس البحوث الأوروبي (ERC) ، ومؤسسة العلوم اسرائيل (ISF) (250/06) وقوى الأمن الداخلي Bikura ، صندوق أبحاث السرطان في إسرائيل (ICRF) والألمانية الإسرائيلية مؤسسة للبحوث العلمية والتنمية (GIF ) ، الولايات المتحدة الأمريكية وإسرائيل مؤسسة العلوم ثنائية القومية (BSF) ، والألمانية الإسرائيلية مشروع التعاون (DIP) ، والوزارات الإسرائيلية للعلوم والصحة ، وأسرة جين Lebell ستيرن زميل في علوم الحياة في جامعة بار ايلان. YB ممتن للمؤسسة أزريلي لنيل الجائزة لزمالة أزريلي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Doxycycline Sigma-Aldrich
FuGENE 6 transfection reagent Roche Group

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wada, Y. A wave of nascent transcription on activated human genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18357-18361 (2009).
  2. Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nat Struct Mol Biol. 16, 1128-1133 (2009).
  3. Brody, Y., Shav-Tal, Y. Visualizing transcription in real-time. Cent Eur J Biol. 3, 11-18 (2008).
  4. Lamond, A. I., Swedlow, J. R. RNA polymerase II transcription in living color. Nat Struct Mol Biol. 14, 788-790 (2007).
  5. Darzacq, X. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nat Struct Mol Biol. 14, 796-806 (2007).
  6. Boireau, S. The transcriptional cycle of HIV-1 in real-time and live cells. J Cell Biol. 179, 291-304 (2007).
  7. Janicki, S. M. From silencing to gene expression; real-time analysis in single cells. Cell. 116, 683-698 (2004).
  8. Ben-Ari, Y. The life of an mRNA in space and time. J Cell Sci. 123, 1761-1774 (2010).
  9. Shav-Tal, Y. Dynamics of single mRNPs in nuclei of living cells. Science. 304, 1797-1800 (2004).
  10. Kremers, G. J., Gilbert, S. G., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Piston, D. W. Fluorescent proteins at a glance. J. Cell Sci. 124, 157-160 (2011).
  11. Sage, D., Neumann, F. R., Hediger, F., Gasser, S. M., Unser, M. Automatic tracking of individual fluorescence particles: application to the study of chromosome dynamics. IEEE Trans Image Process. 14, 1372-1383 (2005).
  12. Yunger, S., Rosenfeld, L., Garini, Y., Shav-Tal, Y. Single-allele analysis of transcription kinetics in living mammalian cells. Nat Methods. 7, 631-633 (2010).
  13. Brody, Y. The in vivo kinetics of RNA polymerase II elongation during co-transcriptional splicing. PLoS Biol. 9, e1000573-e1000573 (2011).
  14. Munoz, M. J. DNA damage regulates alternative splicing through inhibition of RNA polymerase II elongation. Cell. 137, 708-720 (2009).
  15. Hieda, M., Winstanley, H., Maini, P., Iborra, F. J., Cook, P. R. Different populations of RNA polymerase II in living mammalian cells. Chromosome Res. 13, 135-144 (2005).
  16. Kimura, H., Sugaya, K., Cook, P. R. The transcription cycle of RNA polymerase II in living cells. J Cell Biol. 159, 777-782 (2002).
قياس حركية النسخ مرنا في الخلايا الحية واحدة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brody, Y., Shav-Tal, Y. Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells. J. Vis. Exp. (54), e2898, doi:10.3791/2898 (2011).More

Brody, Y., Shav-Tal, Y. Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells. J. Vis. Exp. (54), e2898, doi:10.3791/2898 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter