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Biology

एकल जीवित कोशिकाओं में mRNA ट्रांसक्रिप्शन के कैनेटीक्स माप

doi: 10.3791/2898 Published: August 25, 2011

Summary

शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय transcriptional कैनेटीक्स जीवित कोशिकाओं में विशेष जीन पर मापा जाता है. ब्याज की जीन से लिखित mRNAs fluorescently टैग और प्रतिदीप्ति वसूली के बाद photobleaching (FRAP) transcriptional बढ़ाव के vivo कैनेटीक्स में प्राप्त कर रहे हैं का उपयोग कर रहे हैं.

Abstract

शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय (पोल द्वितीय) के transcriptional गतिविधि एक गतिशील प्रक्रिया है और इसलिए vivo में transcriptional प्रक्रिया के कैनेटीक्स को मापने के महत्व का है. पोल द्वितीय कैनेटीक्स जैव रासायनिक या आणविक विधियों का उपयोग कर मापा गया है हाल के वर्षों में. 1-3 नए दृश्य तरीकों के विकास के साथ, यह संभव बन गया है प्रतिलेखन पालन के रूप में यह एक जीवित कोशिकाओं में वास्तविक समय में होता है इस के साथ साथ 4. हम कैसे वर्णन 5 जीवित कोशिकाओं में एक विशेष जीन पर पोल द्वितीय बढ़ाव कैनेटीक्स का विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए, एक सेल लाइन में एक विशेष जीन (डीएनए) बिन्दुपथ, इसके mRNA उत्पाद, और अंतिम प्रोटीन उत्पाद fluorescently हो और लेबल कर सकते हैं, vivo में कल्पना का प्रयोग 6 , यह संभव है ब्याज की जीन पर mRNAs का वास्तविक प्रतिलेखन का पता लगाने के 7, 8 mRNA fluorescently vivo में, जहां mRNA टेप की 3'UTR 24 MS2 स्टेम पाश होते टैगिंग mRNAs लिए MS2 प्रणाली का उपयोग में है टैग. दोहराता है, जो YFP-MS2 कोट प्रोटीन है कि mRNA लेबल के रूप में यह लिखित है के लिए अत्यधिक विशिष्ट बाध्यकारी साइटों प्रदान करते हैं. 9 प्रतिलेखन के कैनेटीक्स हम विधि (FRAP) photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति वसूली का उपयोग की निगरानी करने के लिए. प्रतिलेखन की साइट पर टैग YFP-MS2-नवजात टेप photobleaching और फिर समय पर इस संकेत की वसूली के बाद से, हम दूसरे शब्दों में नव बनाया mRNAs का संश्लेषण की दर प्राप्त करने के 5, YFP MS2 प्रतिदीप्ति वसूली पीढ़ी को दर्शाता है नई MS2 फ्लोरोसेंट मुक्त YFP MS2 अणुओं आसपास के nucleoplasm से प्रवेश करने से नवजात और उनके बंधन टेप में स्टेम छोरों. FRAP वसूली घटता है तो गणितीय यंत्रवत अंतर समीकरणों की एक श्रृंखला के द्वारा औपचारिक रूप मॉडल का उपयोग करते हुए, क्रम में करने के लिए प्रतिलेखन की गतिज समय पैरामीटर प्राप्त करने के लिए विश्लेषण कर रहे हैं.

Protocol

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सेल प्रणाली का इस्तेमाल किया कि MS2 mRNA टैगिंग के लिए जीवित कोशिकाओं में दोहराने दृश्यों शामिल एक एकीकृत जीन का निर्माण होना चाहिए. इस प्रोटोकॉल में हम एक stably एकीकृत जीन β-actin के fluorescently डीएनए, आरएनए और प्रोटीन के स्तर 8 में लेबल प्रकार (चित्रा 1A) के रूप में शरण: जीन के 5 लाख ऑपरेटर शामिल हैं (एक मानव U2OS सेल लाइन का उपयोग LACO) दोहराता - इन जीन (डीएनए) टैग का इस्तेमाल कर रहे हैं और इस तरह के एकीकरण के जीनोमिक बिन्दुपथ की पहचान . Fluorescently टैग लाख repressor प्रोटीन (LacI) laco दोहराता करने के लिए बाध्य डीएनए टैग होगा. mRNAs YFP-MS2 प्रोटीन है कि MS2 दोहराता (स्टेम छोरों) करने के लिए बाध्य के साथ टैग कर रहे हैं. जीन उत्पाद CFP actin है और इसलिए जीन की प्रेरण CFP टैग actin cytoskeleton की उपस्थिति में परिणाम देगा. जीन का निर्माण एक Tet पर U2OS स्थिर सेल लाइन में ट्रांसफ़ेक्ट है और इसकी अभिव्यक्ति Tet transcriptional नियंत्रण के तहत है.

1. सेल चढ़ाना और अभिकर्मक:

  1. 48 घंटे पहले माप, बीज 2 ~ * 10 गिलास तली टिशू कल्चर बर्तन पर 5 कोशिकाओं (एक 14 मिमी गिलास तली (microwell 0.16-0.19 मिमी मोटाई के साथ 35 मिमी पेट्री डिश, बिल्ली सं P35G - 1.5-14 - सी MatTek, Ashland, एमए)). कोशिकाओं को माध्यम के 2ml जोड़ें, क्रम में 50-80% संगम तक पहुँचने के लिए.
  2. 24 घंटे के प्रयोग से पहले, transiently constructs कि टैगिंग डीएनए और mRNA के लिए फ्लोरोसेंट मार्करों व्यक्त के साथ कोशिकाओं transfect. FuGENE6 अभिकर्मक अभिकर्मक (Roche) का उपयोग करें.
    प्रयोग किया जाता constructs:
    1. YFP-MS2-एनएलएस mRNA टेप में MS2 स्टेम छोरों टैग होगा. परमाणु स्थानीयकरण अनुक्रम (NLS) YFP-MS2 प्रोटीन के लिए परमाणु प्रविष्टि अनुक्रम प्रदान करता है.
    2. वैकल्पिक - CFP LacI या आरएफपी LacI कि जीन के 5 'में LACO दोहराता बाँध और जीन ठिकाना लेबल होगा. टैगिंग जीन ठिकाना FRAP प्रयोग के दौरान जीन पर नज़र रखने में मदद करता है, लेकिन आवश्यक नहीं है.
  3. कम से कम 12 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं, क्षणिक ट्रांसफ़ेक्ट प्रोटीन (नोट देखें) की अच्छी अभिव्यक्ति प्राप्त है.
  4. 6 - 12 घंटे पहले प्रयोग Tet-inducible जीन CFP-actin के सक्रिय करने के लिए कोशिकाओं को 1.5 μg / एमएल डॉक्सीसाइक्लिन (सिग्मा) जोड़ने.

नोट:
* यह महत्वपूर्ण है बहुत ही उच्च ट्रांसफ़ेक्ट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर तक पहुँच नहीं इतनी के रूप में मुखौटा प्रतिलेखन साइट, पृष्ठभूमि संकेत के सापेक्ष से विशेष रूप से प्राप्त संकेत नहीं है. ख) promotor की ताकत (जैसे सीएमवी L30 प्रमोटर की तुलना में मजबूत है) को बदलने, ग) एक परमाणु निर्यात संकेत (NES) जोड़ने क) अभिकर्मक और प्रयोग के बीच समय का समायोजन: अभिव्यक्ति के स्तर के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है है YFP-MS2 एनएलएस प्रोटीन है, जो पूरे सेल में YFP संकेत वितरित करने में मदद करेगा.

* माप के लिए इस्तेमाल किया fluorophore अधिमानतः लंबे अधिग्रहण भर photostable होना चाहिए, इसलिए हरी / पीले उत्सर्जन fluorophores लाल fluorophores से बेहतर हैं. विभिन्न fluorophores पर सूचना रेफरी 10 में पाया जा सकता है .

* निर्धारित कि अलग तरह के प्रकाश चैनलों एक दूसरे के लिए नहीं के माध्यम से खून करते हैं. का प्रयोग करें प्रत्येक अलग मार्कर के साथ लेबल नमूनों युक्त स्लाइड, प्रत्येक स्लाइड में दोनों चैनलों की तीव्रता को मापने, और फिर खून के माध्यम से की गणना.

2. FRAP:

किसी भी माइक्रोस्कोप है कि दोनों छवियों को प्राप्त करने और एक लेज़र बीम के साथ photobleaching प्रदर्शन करने में सक्षम है पर प्रयोग किया जा सकता है. आमतौर पर, FRAP प्रयोगों लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग (CLSM) के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं. हालांकि, बाद से हमारे मामले में प्रयोग अपेक्षाकृत लंबे समय (15-30 मिनट) है, और हम एक नाभिक के भीतर छोटे बिन्दुपथ का अनुसरण कर रहे हैं, यह महत्वपूर्ण है को ध्यान में पूरे प्रयोग के दौरान जीन साइट / ठिकाना प्रतिलेखन रखने में सक्षम हो. इस समय (4D) पर 3 आयामों में तेजी इमेजिंग की आवश्यकता है, और इस तरह के अधिग्रहण की दर एक स्कैनिंग confocal खुर्दबीन का उपयोग कर प्राप्त करने के लिए मेहनत कर रहे हैं. इसलिए, हम एक 3D FRAP (Photometrics) प्रणाली के एक व्यापक क्षेत्र ओलिंप IX81 (63X योजना ए पी ओ, 1.4 एनए) खुर्दबीन एक EM सीसीडी (क्वांट-EM, नट) के साथ सुसज्जित है कि उच्च गति पर छवियों को प्राप्त कर सकते हैं पर बनाया का उपयोग (अप करने के लिए 30 छवियों / सेक). प्रणाली 405 एनएम और 491 एनएम लेज़रों कि करने के लिए ब्याज की एक विशिष्ट नमूने के क्षेत्र (आरओआई) पर photobleaching सक्षम कैमरे के साथ सिंक्रनाइज़ किया जा सकता है है. खुर्दबीन एक Lambda डीजी 4 प्रकाश (Sutter) स्रोत और एक XY और जेड (पहले चरण) Z-अक्ष में तेजी से और सही इमेजिंग की अनुमति देता है के साथ सुसज्जित है. सभी उपकरणों और एकीकृत MetaMorph (आण्विक डिवाइसेज) द्वारा नियंत्रित है. 37 में रहते सेल प्रयोगों प्रदर्शन कर रहे हैं 2 डिग्री सेल्सियस सीओ 5% के साथ एक कक्ष रहते सेल प्रणाली (Tokai) का उपयोग.

  1. प्रक्रिया: आधे घंटे के प्रयोग से पहले, हीटिंग डिवाइस माइक्रोस्कोप, और लेजर पर बारी. अनुभव के दौरानजाहिर तापमान स्थिर रहने की जरूरत है, अन्यथा यह लंबी अधिग्रहण के समय के दौरान ध्यान केंद्रित परिवर्तन का कारण हो सकता है. लेजर शक्ति के अनुरूप बिजली उत्पादन के लिए स्थिर होना चाहिए.
  2. कैमरे के साथ लेजर सिंक्रनाइज़:
    1. कि कोशिकाओं (डीआईसी का उपयोग) शामिल नहीं करता है थाली में एक क्षेत्र के लिए खोजें.
    2. ही प्रकाश चैनल कि प्रयोगों के लिए उपयोग किया जाएगा का उपयोग करें. यहाँ हम YFP चैनल के लिए 491 एनएम लेजर का उपयोग करें.
    3. छवि के बीच करने के लिए लेजर प्वाइंट.
    4. बटन सिंक्रनाइज़ (मैक्रो प्रदान) का उपयोग करें.
    5. क्षेत्र में विभिन्न स्थानों करने के लिए सुनिश्चित करें कि लेजर और कैमरा सिंक्रनाइज़ कर रहे हैं की कोशिश करो.
  3. प्रयोग के लिए एक अच्छे उम्मीदवार सेल चुनें. हालांकि हम स्थिर सेल लाइनों के साथ काम करते हैं, हम पाते हैं कि नहीं सभी कोशिकाओं के समान अभिव्यक्ति के स्तर है. अच्छे उम्मीदवारों की कोशिकाओं है कि होगा: क) स्पष्ट YFP MS2-टैग फैलाना YFP-MS2 पृष्ठभूमि ऊपर प्रतिलेखन साइट प्रदर्शन, और ख) काफी मुक्त YFP MS2 कक्ष में प्रोटीन है इतनी के रूप में के बाद पूरी तरह ठीक करने में सक्षम होने के लिए photobleaching (आंकड़ा 1B में उदाहरण - दो कक्षों की तुलना, बाएँ कक्ष विरंजन के लिए एक अच्छे उम्मीदवार नहीं है).
  4. उचित मापने शर्तों चुनें. FRAP प्रक्रिया कई छवियों के प्राप्त करने की आवश्यकता है, और इसलिए यह महत्वपूर्ण है के लिए उचित जोखिम बार और संभव के रूप में कम प्रकाश के रूप में उपयोग के बीच संतुलन है. उच्च प्रकाश के स्तर phototoxicity के कारण सेल प्रभावित हो सकता है, और photobleaching कारण होगा. यह इमेजिंग मापदंडों अलग प्रयोगों के बीच स्थिर रखने की सिफारिश की है.
    कक्ष 150 मिसे जोखिम समय के साथ YFP चैनल में imaged हैं, और CFP lacI (जीनोमिक ठिकाना) का पता लगाने के के लिए CFP चैनल में. CFP - LacI टैग बिन्दुपथ के बाद जीन का पता लगाने की अनुमति देता है जब भी YFP MS2 mRNA संकेत photobleached (वैकल्पिक) है. प्रत्येक अधिग्रहण के लिए, 7 Z-स्लाइस हर 350 एनएम ले रहे हैं. सक्रिय प्रतिलेखन साइट 491 एनएम लेजर का उपयोग करने के लिए प्रक्षालित है.
  5. पूरा प्रयोग निष्पादित लेकिन विरंजन के बिना. FRAP प्रयोग समय यह प्रतिलेखन साइट के लिए ले जाता है स्थिर राज्य के लिए लौटने के उपाय. सबसे पहले, हम सत्यापित करें कि सक्रिय प्रतिलेखन साइट कार्यात्मक और स्थिर अवस्था में स्थिर है चाहता हूँ. इसलिए, हम सुनिश्चित करें कि प्रतिलेखन साइट के मापा तीव्रता प्रयोग समय सीमा के दौरान परिवर्तन नहीं करता है विरंजन के बिना एक पूरा FRAP प्रयोग है, लेकिन प्रदर्शन. हम इस प्रयोग का उपयोग भी कुल पूर्ण इमेजिंग श्रृंखला की वजह से photobleaching को मापने के द्वारा हमारे इमेजिंग शर्तों परीक्षण. अंगूठे का एक नियम के रूप में, पूरी फिल्म photobleach प्रारंभिक तीव्रता का 30% से अधिक नहीं होना चाहिए. यह पिछले छवि से नाभिक में एक ही जगह है, पहली छवि (अनुपात 0.7 की तुलना में बड़ा होना चाहिए) द्वारा विभाजित की तीव्रता के अनुपात का उपयोग करके मापा जा सकता है है.
  6. FRAP: सक्रिय प्रतिलेखन साइट पर संकेत YFP-MS2 491 एनएम लेजर का उपयोग करने के लिए प्रक्षालित है. 6 पूर्व ब्लीच छवियों का अधिग्रहण कर रहे हैं. पोस्ट ब्लीच छवियों 3 समय आवृत्तियों की एक अनुक्रम में अर्जित कर रहे हैं: 15 हर 3 सेकंड छवियों, 15 छवियों हर 6 सेकंड, और 26 (या 45) लंबी प्रयोगों के लिए छवियों हर 30 सेकंड. प्राप्त छवियों की आवृत्ति में परिवर्तन करने के लिए बार है कि उच्चतम तीव्रता (प्रारंभिक वसूली) बदलने के लिए, और अंत की ओर कम छवियों चलता है जब संकेत में परिवर्तन कम प्रमुख हैं के दौरान अधिक छवियों को प्राप्त करने की अनुमति देता है.

नोट: यह प्रयोग उस में "नियमित" FRAP से अलग है:
* प्रतिलेखन साइट पर mRNA की FRAP YFP MS2-प्रोटीन की नवजात mRNA के लिए बाध्य उपाय है, जबकि ठेठ FRAP प्रयोगों कक्ष में विभिन्न प्रोटीन की गतिशीलता को मापने. इसलिए, वहाँ YFP-MS2 प्रोटीन की वाचाल पूल को मापने में कोई दिलचस्पी नहीं है. जब विरंजन और पहले अधिग्रहीत छवि के बीच के समय अपेक्षाकृत लंबा है और यह संभव है मुक्त YFP-MS2 प्रोटीन के इस diffusing पूल उपेक्षा.

* चूंकि YFP-MS2 संकेत की वसूली अपेक्षाकृत लंबे समय (15-30 मिनट) है, यह महत्वपूर्ण है को ध्यान में प्रतिलेखन साइट रखने. यही कारण है कि Z-स्लाइस की एक श्रृंखला हर समय बिंदु पर अधिग्रहण कर लिया है.

3. FRAP डेटा का सामान्यीकरण:

4D FRAP डेटा का उपयोग कर मुक्त छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर ImageJ (, एनआईएच, Bethesda, एमडी करने का विश्लेषण किया जाता है http://rsb.info.nih.gov/ij/) . ImageJ सॉफ्टवेयर के माध्यम से उपलब्ध मैक्रोज़ के साथ प्रदर्शन विश्लेषण है, लेकिन निश्चित रूप से स्वयं लिखा मैक्रोज़ उत्पन्न किया जा सकता है.

  1. Z-ढेर अधिकतम हर समय बिंदु पर पेश कर रहे हैं, आगे के विश्लेषण के लिए एक समय पर 2 डी फिल्म में जिसके परिणामस्वरूप.
  2. प्रत्येक फ्रेम में प्रतिलेखन साइट पर नज़र रखी है और मतलब तीव्रता स्पॉट ट्रैकर उपकरण का उपयोग कर मापा जाता है आगे के विश्लेषण के लिए एक एक्सेल शीट में 11 डेटा सहेजा जाता है ..
  3. हर बार बिंदु के लिए, ब्याज के अन्य क्षेत्रों (आरओआई) पर मतलब तीव्रता के रूप में निम्नानुसार (समय श्रृंखला विश्लेषक का उपयोग प्लग में ImageJ की) मापा जाता है: एक पीठ)जमीन सेल = बी (टी) के बाहर एक रॉय से लिया है. ख) nucleoplasm में रॉय, लेकिन के रूप में के रूप में ब्लीच साइट से जहां तक ​​संभव हो = सी (टी). ग) प्रतिलेखन साइट = एस (टी) (के रूप में मौके पर नजर द्वारा मापा).
  4. इमेजिंग के दौरान कारण photobleaching के लिए डेटा सही: अन्य सभी माप से पृष्ठभूमि घटाना और फिर ब्लीच सही. एससी (टी) समय टी. प्रतिलेखन साइट की तीव्रता सही है

eq. : 1
एक समीकरण

  1. सामान्यकरें डेटा: पहले पूर्व ब्लीच छवियों, जो स्थिर राज्य (= <Sc (pre-bleach)>) प्रतिलेखन साइट की तीव्रता से पता चलता है के औसत की गणना.

फिर डेटा मानक के अनुसार:

eq. 2
2 समीकरण

डेटा कम से कम 10 प्रयोगों के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं. प्रयोगों की औसत और हर बिंदु समय (चित्रा 1C) में त्रुटि सलाखों के लिए मानक विचलन (एसटीडी) की गणना.

नोट:
FRAP विश्लेषण के दौरान YFP-MS2 प्रोटीन के प्रसार के बाद से मुक्त nucleoplasmic YFP-MS2 के प्रसार की दर बहुत तेजी से है अवहेलना था, जबकि MS2-बाध्य YFP mRNA करने के लिए उच्च आत्मीयता के साथ जुड़ा हुआ है, और प्रतिलेखन करने के लिए पुनः अनुलग्न नहीं साइट. यही कारण है कि विरंजन के बाद पहली छवि विश्लेषण से पहले हटा दिया जाना चाहिए.

4. एक गणितीय मॉडल का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण:

के क्रम में डेटा सेट के इस तरह से गतिज मापदंडों पुनः प्राप्त करने के लिए, हम सरलतम मॉडल में वर्णित है कि डेटा की इस तरह फिट कर सकते हैं का उपयोग किया. इस विशिष्ट मॉडल का पूरा विवरण 5 यहाँ पढ़ा जा सकता है. मॉडल निम्नलिखित समीकरण है कि 2A आंकड़ा योजना का वर्णन होता है:

3 समीकरण
4 समीकरण

मॉडल मापदंडों के बाद, यह संभव है बढ़ाव दर की गणना करने के लिए:

5 समीकरण

हम बर्कले मैडोना (का उपयोग वक्र विश्लेषण http://www.berkeleymadonna.com ), के रूप में पहले 5 मॉडलिंग लेकिन अन्य विकल्प उपलब्ध हैं (MatLab, वर्चुअल सेल, COPASI आदि). डाटा मॉडल को फिट किया गया था और दर स्थिरांक निकाले गए थे. हम बर्कले में मैडोना कोड देते हैं. आदेश में सबसे अच्छा डेटा हम स्थिर राज्य की गणना और फिर सामान्यीकृत मॉडल के लिए सामान्यीकृत प्रयोगात्मक डेटा फिट फिट करने के लिए.

5. प्रतिनिधि परिणाम:

हम सक्रिय प्रतिलेखन उच्च लेसर शक्ति का उपयोग कर साइट पर लेबल mRNA संकेत photobleached, और अधिक YFP MS2-संकेत की वसूली. प्रतिलेखन साइट पर फ्लोरोसेंट संकेत स्थिर राज्य mRNA के रूप में के रूप में अच्छी तरह से साइट से जारी mRNA संश्लेषण के कैनेटीक्स के होते हैं. विरंजन के बिना समय पर प्रतिलेखन साइट तीव्रता मापने एक 'लगातार' (आंकड़ा 1C, लाल डॉट्स) संकेत है जिसका अर्थ है कि इस जीन एक रिश्तेदार स्थिर राज्य में वर्तमान में है देता है. इसका मतलब यह है कि संकेत है कि नव लिखित mRNA पर जम जाता है संकेत है कि पत्ते जब एक mRNA प्रतिलेखन साइट से जारी है के बराबर है. जब photobleached, इस प्रणाली को अपने राज्य में स्थिर जारी है, लेकिन अब समय यह संकेत ठीक करने के लिए के लिए लेता है उपाय संभव है. इसलिए, प्रतिदीप्ति की वसूली ज्यादातर पोलीमरेज़ के बढ़ाव के गुणों पर निर्भर करता है. 3D FRAP प्रणाली FRAP वसूली के दौरान पूर्ण 3 डी परमाणु मात्रा के अधिग्रहण की अनुमति दी है, जिससे कोई संकेत प्रयोगों के दौरान खो गया था. डेटा से गतिज मापदंडों की गणना के लिए, सामान्यीकृत वक्र गतिज मॉडल का वर्णन बढ़ाव, कि अंतर समीकरणों पर आधारित है के लिए लगाया गया था 5 एक सरल क़सीदा मॉडल का उपयोग कर के लाभ है कि यह मापदंडों का केवल एक छोटी संख्या के लिए फिट हो सकता है है. . मॉडल (प्रवेश बिंदु) के प्रारंभिक कदम बढ़ाव, अर्थात् नए MS2 बाध्यकारी साइटों synthesizing के लिए जिम्मेदार प्रक्रिया है. अंत कदम (बाहर बिंदु) nucleoplasm में mRNA जारी है. मॉडल वसूली घटता, जो दो kinetically हल घटकों से मिलकर बनता है एक तेजी से और एक धीमी पर आधारित है. तेजी घटक बढ़ाव के लिए संदर्भित करता है, जबकि धीमी घटक बढ़ाव के दौरान रोक पोलीमरेज़ के रूप में modeled गया था. दो पोलीमरेज़ राज्यों रोक के लिए एक stochastic संक्रमण के साथ बढ़ाव के रूप में modeled थे. हम इस मॉडल से अंतर समीकरणों, जो एक धीमी संश्लेषण की दर (2.5 मिनट की एक संचयी समय के लिए रोक) के लिए एक stochastic संक्रमण के साथ 3.3 केबी / मिनट की एक बढ़ाव की गति झुकेंगे अनुकूलित. मॉडलिंग था दिखायाटी बढ़ाव से रोक पोलिमेरासिज़ कि बढ़ाव में प्रवेश के केवल 11% से प्रभावित इस संक्रमण.

बाहर कश्मीर ०.०,११२
कश्मीर pause_in .0015
कश्मीर pause_out ०.०,०६७
बढ़ाव समय -1 (+ K बाहर कश्मीर pause_out) 56 सेकंड
रोकें समय -1 (कश्मीर pause_out) 2.5 मिनट
रोकें प्रायिकता (कश्मीर pause_in) / (कश्मीर pause_in + कश्मीर बाहर) 11%

टेबल 1 मॉडल पैरामीटर तालिका में परिणाम है .

चित्रा 1
चित्रा 1. (ए) प्रयोगात्मक सेल प्रणाली vivo में जीन की अभिव्यक्ति निम्नलिखित के लिए इस्तेमाल किया . CFP-actin जीन की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व का निर्माण. 5'-अंत 256 laco दोहराता है कि आरएफपी LacI (लाल) से बंधे हुए हैं और जीन एकीकरण की साइट निशान की एक श्रृंखला के शामिल हैं. न्यूनतम सीएमवी प्रमोटर से transcriptional प्रेरण रिवर्स टेट्रासाइक्लिन transcriptional उत्प्रेरक (rtTA या Tet-में) के बंधन से Dox की उपस्थिति में Tet उत्तरदायी तत्वों (Tres) हासिल की है. लिखित mRNA CFP-β-actin के लिए कोडन अनुक्रम, और 24 MS2 दोहराता है कि संलयन YFP MS2 प्रोटीन से बंधे हुए हैं शामिल हैं. अंत 3', खरगोश β-ग्लोबिन मॉड्यूल एक्सॉन intron - एक्सॉन के एक हिस्से को एक दरार - Pólya संकेत द्वारा पीछा किया जाता है. योजना भी बढ़ाव फ्लोरोसेंट MS2 प्रोटीन (पीला) नव लिखित आरएनए पोल द्वितीय द्वारा लिखित mRNAs से जुड़ी दिखा परख का वर्णन (बी) एक सक्रिय प्रतिलेखन साइट (YFP-MS2, दाहिने हाथ सेल) photobleached था और प्रतिदीप्ति वसूली लगाया गया था . अधिक समय (फ्रेम के तल पर). हम दोनों (मध्य लाइन) ब्लीच और गैर प्रक्षालित (नीचे पंक्ति) सक्रिय प्रतिलेखन साइटों के प्रतिदीप्ति तीव्रता मापी. नोट: बाएं हाथ सेल एक photobleaching प्रयोग के लिए उपयुक्त नहीं है (सी) प्रयोगात्मक माप CFP actin जीन प्रतिलेखन साइटों पर प्रदर्शन किया. . YFP MS2 FRAP माप के नीले वसूली घटता. लाल, गैर प्रक्षालित ही स्थिर अवस्था में प्रतिलेखन साइट पर YFP-MS2 संकेत दिखा प्रयोग से एक सेल में.

चित्रा 2
चित्रा 2. प्रतिलेखन साइट पर YFP-MS2 अणुओं के साथ चिह्नित mRNAs का प्रवेश और बाहर निकलें कैनेटीक्स का वर्णन मॉडल की योजना (ए) (बी) YFP MS2 FRAP डेटा और फिट अनुकार (दस प्रयोगों के औसत मॉडल के लिए लगाया गया था) . फिट की गणना बच तल पर प्रस्तुत कर रहे हैं.

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Discussion

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जीवित कोशिकाओं में पोलीमर्स गतिज गतिविधि को मापने के लिए विधि को दो भागों में विभाजित किया जा सकता है. पहला भाग 'गीले' प्रक्रिया है जो मापने और mRNA प्रतिलेखन की गतिज डेटा पुन: प्राप्त करने में सक्षम बनाता है, जबकि दूसरे भाग में, डेटा एक क़सीदा मॉडल का उपयोग करते हुए विश्लेषण किया है का वर्णन 5 अध्ययन का एक नंबर निकालने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग किया है. प्रतिलेखन कैनेटीक्स रहने वाले कोशिकाओं 5, 6, 8, 12-14 में. इन अध्ययनों के बीच प्रमुख अंतर जिस तरह से FRAP वसूली वक्र गतिज मापदंडों में परिवर्तित कर दिया गया था. कई मामलों में एक गणितीय मॉडल का इस्तेमाल किया है. एक मॉडल एक सरल तरीके से जैविक प्रक्रिया का वर्णन है और यह तो FRAP डेटा की तुलना में है चाहिए. एक बार वहाँ डेटा और मॉडल के बीच एक अच्छा संबंध है, एक दवा के प्रभाव या विभिन्न जीनों के बीच तुलना की माप के रूप में अतिरिक्त जैविक प्रयोगों द्वारा मॉडल को सत्यापित करना चाहिए.

उपरोक्त विश्लेषण आगे लेने के लिए अतिरिक्त गतिज परिणाम प्राप्त यह संभव है. उदाहरण के लिए, MS2 फ्लोरोसेंट प्रोटीन का एक photoactivatable फार्म का उपयोग करके यह संभव है करने के लिए पहले से ही उत्पन्न mRNA टेप photoactivate और प्रतिलेखन साइट से उनकी रिहाई (तीव्रता बनाम = कमी FRAP द्वारा मापा संकेत की वसूली) का पालन करें 5. इसके अतिरिक्त, जबकि FRAP केवल MS2 टैग mRNAs उपायों बढ़ाव कैनेटीक्स, प्रतिलेखन साइट पर GFP-शाही सेना पोल द्वितीय के FRAP पैदावार पूरे transcriptional प्रक्रिया के कैनेटीक्स, अर्थात् पूर्व दीक्षा, दीक्षा, बढ़ाव और समाप्ति 5, 13, 15, 16.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

वाईएस टी यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी), इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (ISF) (250/06), ISF-Bikura, इसराइल कैंसर रिसर्च फंड (ICRF), वैज्ञानिक अनुसंधान और विकास के लिए जर्मन - इजरायल फाउंडेशन (GIF द्वारा समर्थित है ), संयुक्त राज्य अमेरिका इसराइल Binational विज्ञान फाउंडेशन (बीएसएफ), जर्मन इजरायल परियोजना (डुबकी), सहयोग, और विज्ञान और स्वास्थ्य के इजरायल के मंत्रालयों, और जेन बार इलान विश्वविद्यालय में स्टर्न Lebell लाइफ साइंसेज में परिवार फैलो है. YB Azrieli फाउंडेशन के लिए एक Azrieli फैलोशिप के पुरस्कार के लिए आभारी है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Doxycycline Sigma-Aldrich
FuGENE 6 transfection reagent Roche Group

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References

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एकल जीवित कोशिकाओं में mRNA ट्रांसक्रिप्शन के कैनेटीक्स माप
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Brody, Y., Shav-Tal, Y. Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells. J. Vis. Exp. (54), e2898, doi:10.3791/2898 (2011).More

Brody, Y., Shav-Tal, Y. Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells. J. Vis. Exp. (54), e2898, doi:10.3791/2898 (2011).

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