RNA-polymeras II transkriptionell kinetik mäts på specifika gener i levande celler. mRNA transkriberas från genen av intresse är fluorescerande taggade och med hjälp av fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) in vivo kinetiken av transkriptionell töjning erhålls.
Den transkriptionell aktiviteten av RNA-polymeras II (Pol II) är en dynamisk process och därför mäta kinetiken av transkriptionell process in vivo är av betydelse. Pol II kinetik har mätts med hjälp av biokemiska och molekylära metoder. 1-3 Under de senaste åren med utveckling av nya visualiseringsmetoder, har det blivit möjligt att följa transkription som det sker i realtid i enskilda levande celler. 4 Häri beskriver vi hur att utföra analyser av Pol II töjning kinetik på en specifik gen i levande celler. 5, 6 Använda en cellinje där en specifik gen lokus (DNA), dess mRNA produkt, och den slutliga proteinprodukter kan fluorescerande och visualiseras in vivo är det möjligt att upptäcka den verkliga transkriptionen av mRNA för genen av intresse. 7, 8 mRNA fluorescerande är taggade med MS2 systemet för märkning mRNA in vivo, där 3'UTR av mRNA transkript innehåller 24 MS2 stam-loop upprepar, som ger mycket specifika bindningsställen för YFP-MS2 päls protein som etiketter mRNA som det är transkriberas. 9 För att övervaka kinetik transkriptionen vi använder fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP)-metoden. Genom fotoblekning den YFP-MS2-märkta gryende avskrifter på platsen för transkription och sedan följa återvinning av denna signal över tiden, vi får syntesen graden av de nygjorda mRNA. 5 Med andra ord speglar YFP-MS2 fluorescens återhämtning generering av nya MS2 Stem-loopar i den framväxande avskrifter och deras bindande genom fluorescerande gratis YFP-MS2 molekyler kommer in från de omgivande nucleoplasm. Den FRAP återhämtning kurvorna analyseras sedan med hjälp av matematiska mekanistiska modeller formaliseras genom en serie av differentialekvationer, för att hämta den kinetiska tidsparametrar för transkription.
Metoden för mätning av polymeras kinetisk aktiviteten i levande celler kan delas in i två delar. Den första delen beskriver den "våta" förfarande som gör det möjligt att mäta och hämta den kinetiska data av mRNA transkriptionen, medan den andra delen är data analyseras med en ODE-modellen. 5 Ett antal studier har nu utnyttjat denna metod för att extrahera transkription kinetik i levande celler 5, 6, 8, 12-14. Den stora skillnaden mellan dessa studier var hur FRAP återhämtnin…
The authors have nothing to disclose.
YS-T stöds av Europeiska forskningsrådet (ERC), Israel Science Foundation (ISF) (250/06), ISF-Bikura, Israel Cancer Research Fund (ICRF), tysk-israeliska stiftelse för vetenskaplig forskning och utveckling (GIF ), USA-Israel binationella Science Foundation (BSF), tysk-israeliska Projekt Samarbete (DIP), och den israeliska ministerier för vetenskap och hälsa, och är den Jane Stern Lebellska Familj Fellow i livsvetenskaper vid Bar-Ilan University. YB är tacksam för Azrieli Stiftelsen för tilldelning av ett Azrieli gemenskap.
Name of the reagent | Company |
---|---|
Doxycycline | Sigma |
FuGENE 6 transfection reagent | Roche |