Summary
En modifierad 3-D för in vitro-system presenteras där tillväxt egenskaper av flera tumörcellinjer i rekonstituerade basalmembranet korrelerar med den vilande eller proliferativ beteende tumörceller med spridning sekundär plats
Abstract
Återfall av bröstcancer följer ofta en lång latent period då det inte finns några tecken på cancer och metastaser kan inte bli kliniskt uppenbar förrän många år efter avlägsnande av den primära tumören och adjuvant behandling. En trolig förklaring till detta fenomen är att tumörcellerna har seedade metastaser, är resistent mot konventionell behandling, och förblir vilande under lång tid 1-4.
Förekomsten av vilande cancerceller på gymnasienivå platser har tidigare beskrivits som vilande ensamma celler som varken föröka sig eller genomgå apoptos 5-7. Dessutom har dessa ensliga celler visat att sprida från den primära tumören i ett tidigt skede av 8-10 sjukdomsutveckling och uppehålla tillväxt greps i patienternas benmärg, blod och lymfkörtlar 1,4,11. Därför att förstå mekanismer som reglerar dvala eller byta till en proliferativ tillstånd är kritiskt för att upptäcka nya mål och insatser för att förhindra återfall i sjukdomen. Har dock reda ut mekanismer som reglerar övergången från tumören dvala av metastaserande tillväxten hämmats av bristen på tillgängligt modellsystem.
in vivo och ex vivo modellsystem för att studera metastaserande utvecklingen av tumörceller har beskrivits tidigare 1,12-14. Men dessa modellsystem har inte lämnat i realtid och i en hög genomströmning sätt mekanistiska insikter i vad som utlöser uppkomsten av solitära vilande tumörceller att föröka sig som metastaserad sjukdom. Vi har nyligen utvecklat en 3D in vitro-system för att modellera in vivo-tillväxten egenskaper hos celler som uppvisar antingen vilande (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) eller proliferativ (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastaserande beteende in vivo. Vi visade att tumörceller som uppvisar dvala in vivo vid en metastatisk plats förblir vilande vid odling i en 3-dimension (3D) basalmembranet extrakt (BME), medan celler mycket metastaserande in vivo lätt förökar sig i 3D-kulturen efter variabel, men relativt korta perioder av inaktivitet. Viktigt genom att utnyttja 3D in vitro modellsystem vi visade för första gången att ECM sammansättning spelar en viktig roll i regleringen om vilande tumörceller kommer att byta till en proliferativ stat och har bekräftat detta i in vivo-studier 15-17. Därför ger den modell som beskrivs i denna rapport ett in vitro-metod för att modellera tumör dvala och studera övergången till proliferativ tillväxt framkallas av mikromiljö.
Protocol
1. Cellodling underhåll av vilande och metastaserande tumör cellinjer
- Grow vilande (D2OR / MCF7/K7M2-AS.46) och metastaserande tumörceller (D2A1 / MDA-MB-231 / K7M2) i 10 plattor cm kulturen innehåller Dulbecco ändrade Eagles Medium (DMEM) höga glukos-och 10% fetalt bovint serum ( FBS) och antibiotika. När cellerna når 70-80% sammanflödet, fortsätta med följande analyser.
2. Celltillväxt analys av vilande (vilande) och metastaserande (förökar sig) tumörceller odlade i en 3D-BME-system
Odling vilande / metastaserande celler i 3D-systemet
- Tina Cultrex tillväxtfaktor-reducerad Basement Membrane Utdrag (BME) i 4 ° C kylskåpet en natt innan de utför analysen. Notera BME bör hanteras på is hela tiden.
- Dagen efter, placera en 96 brunnar på en bricka av is inuti ett laminärt huva. Coat varje brunn med 50-100μl av iskall BME med hjälp av en automat med en spruta. Se till att inga bubblor bildas i brunnarna. Placera 96 brunnar belagda med BME i en fuktig kuvös med 5% CO 2 vid 37 ° C i 30 minuter.
- Under tiden sug media från vilande och eller metastaserande tumörceller (upprättad i avsnitt 1). Skölj odlingsplattor med 10 ml fosfatbuffrad saltlösning, pH 7,4 (PBS). Aspirera PBS och tillsätt 2 ml trypsin förvärmas vid 37 ° C, till odlingsplattor. Inkubera plattorna i en fuktig 5% CO 2 vid 37 ° C, i 5 min.
- Överför celler till ett 15 ml koniskt rör som innehåller 5 ml DMEM höga glukos kompletteras med 10% FCS och antibiotika och räkna cellerna.
- Spinn ner det totala antalet celler som ska odlas i en vävnadsodling centrifug med en hastighet av 1500g, i rumstemperatur i 5 minuter. I våra analyser vi förbereda 2x10 3 celler / brunn för varje cellinje eller tidpunkt som skall undersökas. Detta kan dock variera beroende på den använda cellinjer.
- Försiktigt aspirera supernatanten. Obs, i de flesta fall pelleten inte syns. Därför lämnar vissa medier bakom. Knacka på botten av 15ml koniska röret med fingrarna så att en suspension av enskilda celler erhålls. Återsuspendera pelleten med DMEM låga glukos med antibiotika kompletteras med 2% FCS + 2% BME (assay media). 100 l av analysen media bör läggas till för varje 2x10 3 celler. Mal sönder cellerna många gånger med en 5 ml pipett för att säkerställa att en enskild cellsuspension bibehålls.
- Plate en 100μl av cellens blandningen per brunn uppe på 96 och BME plåt. För bakgrund utvärdering (avsnitt 2,8) plattan förutom 100μl per brunn av endast media analys på toppen av 96 väl BME plåt. Inkubera odlade 96 brunnar i en fuktig 5% CO 2 inkubator vid 37 ° C. Celler bör åter matas var 4 dagar med analysen media.
Spridning analysen:
- Spridning analys av cellerna: Lägg till brunnarna vid önskad tidpunkt punkterna 20 ìl av Cell titern 96 Vattenlösning En standardlösning Cell Proliferation assay kit. Inkubera i en fuktig 5% CO 2 inkubator vid 37 ° C i 2h. Använda en Elisa rekord plattläsaren absorbansen vid 490nm. För bakgrund utvärdering och subtraktion, lägg 20μl av Cell titern 96 Vattenlösning En standardlösning Cell Proliferation assay kit för att brunnar före belagda med BME och endast överlagras med analys media. Använda en Elisa rekord plattläsaren absorbansen vid 490 nm.
3. Immunofluorescerande färgning för cell signalmolekyler i vilande (vilande) tumörceller och / eller metastaserad (förökar sig) tumörceller
Odling vilande / metastaserande celler i 3D-system för immunfluorescence färgning
* Följande protokoll är en modifiering av en 3D-kultur protokoll publiceras av Debnath J et al 18.
- Förbered BME som beskrivs i avsnitt 2.1. Följande dag: Placera en 8-kammare systemet glasskiva på en bricka av is inne i ett laminärt huva. Coat varje brunn med 50ul iskallt BME med en 200μl pipetman. Se BME sprids jämnt och inga bubblor bildas i brunnarna. Placera 8 bilden kammaren glas belagda med BME i en fuktig 5% CO 2 vid 37 ° C i 20 minuter.
- Harvest vilande och eller metastaserande celler från avsnitt 1 och förbereda till kulturen som beskrivs i avsnitt 2,3 till 2,4. Samla totala antalet celler som odlas i ett 15 ml koniskt rör. Vi förbereder 5 x10 3 celler / brunn för varje cell linje och tidpunkt som skall undersökas. Snurra ned cellerna i en vävnad kultur centrifug med en hastighet av 1500g, i rumstemperatur i 5 minuter. Aspirera supernate noggrant. Observera att pellets inte är synlig, därför lämna vissa medier bakom. Knacka på botten av 15ml koniska röret med fingrarna för att säkerställa att en enda cell suspension.Återsuspendera pelleten med analysen medier. 400μl av analysen media bör läggas till för varje 5x10 3 celler. Mal sönder cellerna många gånger med 5 ml pipett. Detta steg är mycket viktigt att se till att den gemensamma cellsuspension bibehålls.
- Plate 400μl av cellen blandningen per brunn på toppen av varje 8 kamrarna belagd med BME. Inkubera odlade 8 kamrarna systemet glasskiva i en fuktig 5% CO 2 inkubator vid 37 ° C. Celler bör åter matas var 4 dagar med analysen media.
Immunofluorescens färgning:
- Vid önskad tid punkter, aspirera det övre skiktet av media och lägga 200μl av fixeringsmedel innehållande 4% Paraformaldehyd (PFA), 5% sackaros och 0,1% Triton X-100 och inkubera vid rumstemperatur i 5 minuter. Aspirera fixativ och lägga 200μl på 4% PFA innehåller 5% sackaros och inkubera vid rumstemperatur i 25 minuter.
- Aspirera fixativ, tillsätt 400 l av fosfat saltlösning (PBS) i varje brunn. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur. Aspirera PBS och tillsätt 400 μ PBS som innehåller 0,05% Tween-20 i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Blockera fast cellerna vid rumstemperatur med 200μl av antingen 10% åsna serum eller med 3% BSA för 1 timme (blockerande lösningen ska användas bör bestämmas empiriskt för varje primär antikropp).
- Sug den blockerande lösningen och tillsätt 200μl av den primära antikroppen (spädning bör bestämmas empiriskt för varje primär antikropp som ska användas). Späd den primära antikroppen i 10% åsna serum om 10% åsna serum användes för att blockera eller utspädd primär antikropp hos 3% BSA om 3% BSA blockerande lösningen användes. Inkubera med den primära antikroppen över natten vid 4 ° C.
- Aspirera antikroppen, tvätta brunnarna med 400μl PBS i 15 minuter och upprepa två gånger. Aspirera PBS och tillsätt 200μl av åsna anti-respektive-IgG konjugerad till Rhodamine röd (spädning bör fastställas empiriskt), täck över 8 kammaren bilden med aluminiumfolie och inkubera i 1 timme i rumstemperatur.
- Tvätta brunnarna med 400μl PBS (3x15 minuter varje tvätt). Aspirera PBS. Monteras med VECTASHIELD monteringsmedel med DAPI. Torka objektglasen i 40 minuter vid rumstemperatur i mörker. Diabilder kan hållas under 1 vecka vid 4 ° C. Förvara bilderna i mörker. Bild diabilder av konfokalmikroskopi.
4. Representativa resultat:
Ett exempel på en spridning analys av den vilande D2.0R och metastaserande D2A1 tumörceller i 3D-kulturen visas i Figur 1A. D2.0R celler är vilande (vilande) genom hela experimentella 14 dagars kultur perioden medan den mycket metastaserande D2A1 celler vilande enbart i fyra till sex dagar varefter de börjar föröka sig. Under den inledande vilande fas, många celler kvar ensamma i 3-D kultur (Figur 1B, dag 4) medan andra icke-celler som förökar bildar flercelliga spheroids. Övergång D2A1 celler från ett vilande till proliferativ stat i 3-D kultur (Figur 1B, dag 12) är associerad med dramatiska förändringar i cellernas morfologi. Därför kan detta test användas för att testa vad faktor / s kan utlösa vilande D2.0R celler att ta sig ur sitt vilande tillstånd och vilka faktorer / s kan förhindra D2A1 celler till övergång från sitt vilande tillstånd. Figur 2 är ett exempel på en agent förhindra D2A1 celler övergång från vilande till en proliferativ stat. Som illustreras i figur 2, underhålls behandling av D2A1 celler med en specifik hämmare av myosin lätta kedjan kinas (ML-7) D2A1 celler i ett vilande tillstånd.
Cellsignalering i vilande och förökar tumörceller odlade i 3D-systemet kan studeras genom immunofluorescens färgning för cell signalmolekyler. Som illustreras i figur 3 en betydande ökning av myosin lätta kedjan fosforylering i D2A1 celler (röd färgning) följt av omorganisation av F-aktin filament bildar fibrer aktin stress (grön färgning) inträffar under sin övergång från dvala (1-4 dagar) spridning (dag 7). Men blockera myosin ljus aktivitet kedja kinas i D2A1 celler genom shRNA eller specifika läkemedel (ML-7) behåller D2A1 celler i ett vilande tillstånd och resulterar i hämning av myosin lätta kedjan fosforylering och F-aktin stressen fiber organisation (Figur 4).
Figur 1. In vitro-modell för att studera isoleringscell dvala tumörcellen och byta till metastaserande tillväxt. A) spridning av vilande D2.0R och metastaserande D2A1 i 3-D Cultrex BME, n = 8 (medelvärde ± SE). Representativa resultat av tre försök (* p ≤ 0,05). B) ljusmikroskopi bilder av D2.0R och D2A1 celler odlade i 3-D Cultrex BME förstoring x20.Figur modifierad från Barkan et al 17.
Figur 2. Förhindra byte av D2A1 celler från dvala (inaktivitet) till spridning i 3D-kulturen systemet genom hämning av myosin lätta kedjan kinas (MLCK). Tid under D2A1 cellproliferation odlade i 3-D Cultrex BME, n = 8 (medelvärde ± SE). Cellerna var obehandlade (kontroll), eller behandlas med en specifik hämmare av MLCK (ML-7, 5 M) under 48 tim början på kultur dag 5. Figur modifierad från Barkan et al 17.
Figur 3. Myosin lätta kedjan fosforylering följt av F-aktin omorganisation under byte av D2A1 celler från dvala till proliferativ tillväxt. D2A1 cellerna odlades i 3-D Cultrex BME den 8 kammare glasplatta. Celler har fastställts och färgas med DAPI (blå) för kärntekniska lokalisering, phalloidin (grön) för F-aktin och med en antikropp mot fosforylerade form av myosin lätt kedja (MLC-p) (röd), som anges vid olika tidpunkter. Merge av F-aktin och MLC-p färgning (gul). Redovisning av MLC-P ökade under övergången av D2A1 celler från dvala (dagar1-4) till proliferativ tillväxt (dag 7) följt av aktin stressen fiber formation (pilar). Konfokalmikroskopi, förstoring x63. Vit bar uppgår till 20 mikrometer. Figur modifierad från Barkan et al 17.
Figur 4. . Hämning av myosin lätta kedjan kinas (MLCK) medierad F-aktin stressen fibrer bildas i D2A1 celler D2A1 Celler var obehandlade (kontroll), eller som behandlas med hämmare för MLCK (ML-7, 5 M), för 48 h börjar den kulturen dag 5, eller behandlas med äggröra eller MLCK shRNA och färgas för fosforylerade form av myosin lätt kedja (MLC-p) (röd), F-aktin (grön) och kärnor (blå). Merge av F-aktin och MLC-p färgning (gul). Konfokalmikroskopi, förstoring x63. Vit bar uppgår till 20 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den underliggande mekanismer som upprätthåller sprids tumörceller i ett vilande tillstånd eller resultera i övergången till metastaserande tillväxt fortfarande till stor del okända. Detta fenomen har varit extremt svårt att studera hos människor 4,12 och några prekliniska modeller har utvecklats för att lösa detta problem. Ändå har några in vivo och ex vivo modellsystem för tumör dvala präglats (över 1,12). Kan dock in vivo-modeller för tumör dvala i första hand användas för att validera potentiella mekanismer som reglerar tumör dvala, men är inte mottagliga för att utforska i realtid biologi som sprids enda vilande tumörceller.
3-D-systemet presenteras här modeller för första gången ensamma tumör dvala och byta till metastaserande tillväxt i en in vitro modellsystem. Spridningen analys för modellering tumör dvala (paus) och övergången till spridning i 3D-systemet kan följas över tid. Denna analys kan utnyttjas för att studera i en hög genomströmning sätt och i en relativt kort tid potentiella faktorer / gener som upprätthåller vilande tumörceller i sin vilande fas eller kan aktivera dem att föröka sig. Dessutom kan spridning-analysen utnyttjas som en hög genomströmning plattform för att skärmen för mer tumörcellinjer som kan ha en vilande fenotyp.
Att studera de molekylära mekanismer som styr tumör dvala eller byta till metastaserande tillväxt i 3D-system som med konventionella biokemiska metoder (RT-PCR / western blotting) är svårt med tanke på den låga mängden RNA / protein som kan utvinnas för biokemiska studier från vilande tumörceller. Däremot kan immunofluorescens färgning av cellsignalering molekyler av vilande och outbreaking tumörceller i 3D-modellen systemet, som presenteras i figurerna 3 och 4 tillämpas. Därför kan modellen systemet presenteras här fungera som ett effektivt verktyg för att börja utforska de molekylära mekanismer som reglerar isoleringscell dvala tumörcellen och övergången till metastaserande tillväxt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna forskning stöds delvis av Interna forskningsprogram National Cancer Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high glucose | Invitrogen | 11965-118 | |
| DMEM low glucose | Invitrogen | 11885-092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10091-148 | |
| Growth factor-reduced 3-D Cultrex Basement Membrane Extract | Trevigen Inc. | Protein concentration between 14-15mg/ml | |
| D2.0R and D2A1 cell lines | 5,19 | ||
| K7M2 and K7M2AS1.46 cells | 20 | ||
| MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | ||
| An 8 chamber glass slide system | Lab-Tek | 177402 | |
| Cell Titer 96 AQueous One Solution cell proliferation assay kit | Promega Corp. | G3580 | |
| VECTASHIELD mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Elisa Plate Reader | Bio-Tec | Record 490nm | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | Magnification x63 |
References
- Aguirre-Ghiso, J. A. Models, mechanisms and clinical evidence for cancer dormancy. Nat Rev Cancer. 7, 834-846 (2007).
- Pantel, K., Woelfle, U. Micrometastasis in breast cancer and other solid tumors. J Biol Regul Homeost Agents. 18, 120-125 (2004).
- Naumov, G. N. Ineffectiveness of doxorubicin treatment on solitary dormant mammary carcinoma cells or late-developing metastases. Breast Cancer Res Treat. 82, 199-206 (2003).
- Klein, C. A. Framework models of tumor dormancy from patient-derived observations. Curr Opin Genet Dev. , (2010).
- Naumov, G. N. Persistence of solitary mammary carcinoma cells in a secondary site: a possible contributor to dormancy. Cancer Res. 62, 2162-2168 (2002).
- Townson, J. L., Chambers, A. F.
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Pantel, K. Differential expression of proliferation-associated molecules in individual micrometastatic carcinoma cells. J Natl Cancer Inst. 85, 1419-1424 (1993).
- Demicheli, R. Tumour dormancy: findings and hypotheses from clinical research on breast cancer. Semin Cancer Biol. 11, 297-306 (2001).
- Braun, S. A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer. N Engl J Med. 353, 793-802 (2005).
- Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S.
- Goss, P. E., Chambers, A. F. Does tumour dormancy offer a therapeutic target. Nat Rev Cancer. 10, 871-877 (2010).
- Mendoza, A. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120, 2979-2988 (2010).
- Naumov, G. N. A model of human tumor dormancy: an angiogenic switch from the nonangiogenic phenotype. J Natl Cancer Inst. 98, 316-325 (2006).
- Barkan, D. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70, 5706-5716 (2010).
- Barkan, D., Green, J. E., Chambers, A. F. Extracellular matrix: A gatekeeper in the transition from dormancy to metastatic growth. Eur J Cancer. , (2010).
- Barkan, D. Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton. Cancer Res. 68, 6241-6250 (2008).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
- Morris, V. L. Mammary carcinoma cell lines of high and low metastatic potential differ not in extravasation but in subsequent migration and growth. Clin Exp Metastasis. 12, 357-367 (1994).
- Khanna, C. The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis. Nat Med. 10, 182-186 (2004).
