Summary
जीभ के भीतर लेबल की कोशिकाओं के बहु photon माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मौखिक कैंसर और ट्यूमर आक्रमण की मात्रात्मक निगरानी की एक माउस मॉडल पैदा करने में शामिल तकनीकों का एक व्यापक सिंहावलोकन प्रस्तुत किया है. इस प्रणाली के आणविक और आक्रामक विरोधी यौगिकों की दवा प्रभावकारिता मूल्यांकन के लिए एक उपयोगी मंच के रूप में सेवा कर सकते हैं.
Abstract
सिर और गर्दन के कैंसर के आक्रमण लोको क्षेत्रीय metastatic जोखिम से जुड़ा हुआ है और डिजाइन और रोगी प्रबंधन रणनीतियों को लागू करने में एक कठिन चुनौती प्रस्तुत है. मौखिक कैंसर के Orthotopic माउस मॉडल कारक है कि अध्ययन की सुविधा के लिए विकसित किया गया है प्रभाव आक्रमण और विरोधी ट्यूमर चिकित्सा विज्ञान के मूल्यांकन के लिए मॉडल प्रणाली के रूप में सेवा. इन पद्धतियों में, मौखिक गुहा के ऊतकों के भीतर फैलाया ट्यूमर कोशिकाओं के दृश्य आम तौर पर या तो पारंपरिक ऊतक विज्ञान के द्वारा या के साथ vivo bioluminescent तरीकों में आयोजित किया गया है. इन तकनीकों का एक प्राथमिक दोष करने के लिए सही कल्पना और जल्दी ट्यूमर कोशिका तीन आयामों में प्राथमिक साइट से उत्पन्न होने वाले आक्रमण यों निहित असमर्थता है. यहाँ हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन है कि दो photon इमेजिंग के साथ एक जीभ के स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (स्काटलैंड का निवासी) के लिए स्थापित मॉडल बहु vectorial बहुभाषी ट्यूमर के प्रसार के दृश्य की अनुमति को जोड़ती है. OSC 19 सिर और गर्दन ट्यूमर कोशिका लाइन stably एफ actin बाध्यकारी पेप्टाइड mCherry फ्लोरोसेंट प्रोटीन (LifeAct mCherry) से जुड़े हुए LifeAct व्यक्त करने के लिए इंजीनियर था. Fox1 / परमाणु परमाणु इन कोशिकाओं के साथ चूहों अंतःक्षिप्त मज़बूती से ट्यूमर है कि जीभ पूर्व vivo दो photon माइक्रोस्कोपी के आवेदन के द्वारा visualized किया जा की अनुमति के रूप में. इस तकनीक ट्यूमर जन के orthotopic दृश्य के लिए और स्थानीय स्तर पर excised जीभ में क्षेत्रीय ट्यूमर microenvironment के विघटन के बिना कोशिकाओं पर हमला करने की अनुमति देता है. इसके अलावा, इस प्रणाली दूरी है कि प्राथमिक ट्यूमर साइट से कोशिकाओं को बढ़ने पर आक्रमण की गणना के द्वारा ट्यूमर सेल आक्रमण की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है. कुल मिलाकर इस प्रक्रिया कारक है कि स्काटलैंड का निवासी आक्रमण और चिकित्सीय उपचार के लिए स्थानीय आक्रमण और दूर metastatic प्रसार को रोकने के अनुरूप करने के लिए योगदान का विश्लेषण करने के लिए एक बढ़ाया मॉडल प्रणाली प्रदान करता है. इस विधि भी अंततः vivo सेटिंग में में अन्य इमेजिंग रूपात्मकता के साथ संयुक्त होने की संभावना है.
Protocol
1. सेल लाइन्स, वेक्टर निर्माण और lentiviral उत्पादन
- मानव सिर और गर्दन ट्यूमर कोशिकाओं लाइनें (OSC19 या UMSCC1) पूरा DMEM के मिलकर मीडिया में सुसंस्कृत थे (Cellgro बिल्ली # 50-003-PB) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (Hyclone बिल्ली # SH30070.03) FBS, 1% पेनिसिलिन के साथ पूरक / स्ट्रेप्टोमाइसिन (Cellgro 30-002-CI # बिल्ली), और 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड (Cellgro 25-025-CI # बिल्ली).
- PLL7.0 lentiviral वेक्टर में LifeAct - mCherry कोडन अनुक्रम हस्तांतरण करने के लिए, Sbf1 माता पिता सीडीएनए mCherry में मान्यता साइट मान्यता साइट निर्देश mutagenesis (Stratagene बिल्ली # 200518-5) का उपयोग कर अनुक्रम में तीन चुप म्यूटेशनों शुरू करने से बदल गया था. परिणामस्वरूप संशोधित अनुक्रम LifeAct mCherry तो पीसीआर था EcoR1/Sbf1 साइटों flanking साथ प्रवर्धित और pLL7.0 में subcloned का निर्माण pLL7.0 LifeAct - mCherry उत्पन्न.
2. pLL7.0 - LifeAct mCherry वायरस उत्पादन
- वायरल उत्पादन lentiviral अभिव्यक्ति सिस्टम पुस्तिका (सिस्टम बायोसाइंस 2-051018 संस्करण) के अनुसार आयोजित किया गया.
- पैकेजिंग सेल लाइन 293T/17 कोशिकाओं (ATCC बिल्ली # CRL - 11,268) ही पूरा HNSCC लाइनों के लिए इस्तेमाल किया मीडिया में 40% का संगम हो गया था.
- कक्ष pLL7.0 - LifeAct mCherry, psPAX2, और एक 03:02:01 के अनुपात में pVSV जी वैक्टर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे, क्रमशः CalPhos का उपयोग (Clontech बिल्ली # 631,312).
- 24 घंटे के बाद, अभिकर्मक से प्रारंभिक मीडिया ताजा मीडिया के साथ बदल दिया गया था.
- मीडिया तब एकत्र किया गया था मंगाया 72 घंटे के लिए हर 12 घंटे और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत
3. सिर और गर्दन के सेल लाइन्स के साथ स्थिर अभिव्यक्ति LifeAct - mCherry उत्पादन
- एकत्र मीडिया के रूप में 10 मिनट के लिए 2000 rpm पर 4 में काता था डिग्री सेल्सियस
- स्पष्ट वायरस युक्त मीडिया के एक मिलीलीटर सीधे 12 घंटे के लिए OSC19 या UMSCC1 कोशिकाओं को जोड़ा गया है. कक्ष फिर, rinsed थे और वायरस के एक अतिरिक्त एक एमएल और 12 घंटे की अवधि के लिए जोड़ा गया है.
- कक्ष को दो सप्ताह के लिए 200mg/ml puromycin युक्त करने के लिए प्रतिरोधी कालोनियों का चयन मीडिया के साथ इलाज किया गया.
- जीवित क्लोन नेत्रहीन LifeAct - mCherry अभिव्यक्ति के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की गई. व्यक्तिगत सकारात्मक कालोनियों बाँझ 3mm क्लोनिंग डिस्क (फिशर बिल्ली # 0790710A) का उपयोग कर typsinized थे.
- सकारात्मक कोशिकाओं 200mg/ml puromycin युक्त जब तक वापस जमे हुए या orthotopic इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया मीडिया में बनाए रखा गया.
4. Orthotopic ट्यूमर xenograft गठन
- सभी जानवरों की प्रक्रियाओं (09-0821) प्रोटोकॉल पश्चिम वर्जीनिया विश्वविद्यालय के पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित के अनुसार में आयोजित की गई.
- LifeAct - mCherry व्यक्त ट्यूमर कोशिकाओं trypsinized centrifuged थे और 2.5 x 4 कोशिकाओं 10 50 μL पूरा मीडिया में resuspended थे.
- ट्यूमर कोशिकाओं एक मिलीलीटर सिरिंज 27 एक संलग्न आधा गेज सुई में भरी हुई थी.
- स्त्री athymic Fox1 / परमाणु परमाणु उम्र के 8 सप्ताह (Harlan लेबोरेटरीज) चूहों ketamine और 10mg/kg xylazine 80mg/kg के संयोजन के साथ anesthetized थे. Anesthetized चूहों 37-40 ° C के बीच एक हीटिंग पैड पर बनाए रखा गया.
- बाँझ संदंश का प्रयोग, जीभ की नोक धीरे और समझा ध्यान से मौखिक गुहा से बाहर निकाला था.
- कक्ष प्रत्येक जीभ के एक पक्ष में धीरे - धीरे इंजेक्शन जीभ केंद्र में एक बल्बनुमा जन बनाने के लिए, बहुभाषी धमनियों से परहेज.
- चूहे 2.1mg/kg Yohimbine के साथ अंतःक्षिप्त थे और जहां वे 2-3 घंटे के लिए संज्ञाहरण से वसूली के दौरान निगरानी की गई हीटिंग पैड को लौट गया.
- एक बार पुनर्जीवित, चूहों बाँझ एक नरम ट्रांसजेनिक आटा आहार (Bioserve बिल्ली # S3472) युक्त पिंजरों में रखा गया.
- चूहे हर 2-3 दिनों में तौला गया और नेत्रहीन ट्यूमर शुरुआत के लिए निगरानी.
5. पूर्व vivo इमेजिंग के लिए माउस जीभ की तैयारी
- कार्बन डाइऑक्साइड साँस लेना द्वारा अलग समय अंक (आमतौर पर 2-4 सप्ताह के बाद इंजेक्शन) में ट्यूमर को शरण चूहे euthanized थे.
- जीभ निकाले थे 1X पीबीएस के साथ rinsed और एक पारंपरिक आयल ऊतक एम्बेडिंग कैसेट (StatLab बिल्ली H104 #) के एक तरफ से जुड़ी एक स्थानीय शौक की दुकान और एक आकार 8 सिलाई सुई से monofilament धागा सिलाई का उपयोग.
- एक बार जीभ immobilized थे, पूरे कैसेट विधानसभा एक 30mm टिशू कल्चर पकवान में रखा गया था और 1X पीबीएस में डूबे.
- प्रसंस्कृत जीभ तुरंत दो photon उत्तेजना माइक्रोस्कोपी के लिए इस्तेमाल किया गया.
6. दो photon माइक्रोस्कोपी के साथ भाषा ट्यूमर के इमेजिंग
- भाषा कैसेट एक 60mm 1X पीबीएस युक्त पकवान एक ले लेने योग्य ब्रैकट (चैंबर के शटल, Siskiyou उपकरणों) हाथ में एक ईमानदार माइक्रोस्कोप (, Sutter उपकरण जंगम (माँ) माइक्रोस्कोप) के उद्देश्य के तहत तैनात पर एक कस्टम डिजाइन धारक में सुरक्षित में डूबे हुए थे.
- एक 40X/0.8NA पानी की सूई उद्देश्य लेंस या अधिक दिखाई तुम सीधे रखा गया थाया घावों. नीलमणि (मीरा, सुसंगत) लेजर 60 मेगावाट और 755 एनएम के इनपुट तरंग दैर्ध्य में तीव्रता mCherry संकेत अनुकूलन: जीभ तिवारी के साथ दो photon माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged थे.
- सीरियल 1mm लेजर स्कैनिंग छवियों 1 कुल 15 और 100 सुक्ष्ममापी (ट्यूमर मात्रा पर निर्भर करता है) के बीच एक ऊतक गहराई से अधिक सुक्ष्ममापी वृद्धिशील गहराई में एकत्र किए गए थे. छवियाँ ScanImage, एक खुला स्रोत MATLAB मंच है कि कैरेल SVOBODA प्रयोगशाला (Janelia फार्म, HHMI) द्वारा विकसित किया गया था पर आधारित कार्यक्रम का उपयोग कर कब्जा कर लिया गया. ScanImage रेखापुंज स्कैन पैटर्न के उत्पादन में दो चैनल एक्स / y galvanometric स्कैन दर्पण नियंत्रण उत्पन्न करता है, और एक ही समय में अधिकतम चार चैनल इनपुट संकेत photomultiplier ट्यूब (PMTs) से एक साथ एक डाटा अधिग्रहण बोर्ड के माध्यम से कब्जा (PCI-6610S , नेशनल इंस्ट्रूमेंट्स). PMT संकेतों कम शोर वर्तमान preamplifiers (SR570, स्टैनफोर्ड अनुसंधान प्रणाली) द्वारा पहले मॉनीटर स्क्रीन पर प्रदर्शित करने के लिए एनआई-DAQ बोर्ड में खिला परिलक्षित कर रहे हैं. ScanImage उद्देश्य की z-अक्ष को नियंत्रित करने के द्वारा Z-ढेर छवियों को इकट्ठा और एक एकल या चक्र मोड में समय चूक छवियों एकत्र. छवियाँ 16 बिट गहराई के साथ एक एकल TIFF फ़ाइल में सहेजा गया.
7. Amira सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवि विश्लेषण
- Amira इमेजिंग ट्यूमर मात्रा का ठहराव के लिए: Aimra सॉफ्टवेयर में, Z-ढेर छवियों के सेट से युक्त झगड़ा फ़ाइल खोलें.
- हाइलाइट फ़ाइल नाम का चयन करें, और Voltex समारोह को लागू करने के लिए एक तीन आयामी प्रतिपादन उत्पन्न. एक बड़े कई छोटे कोशिकाओं के सामूहिक आक्रमण dissociated आक्रामक समूह (आईजी) के साथ प्राथमिक ट्यूमर छवि प्रदान की गई छवि में आम तौर पर स्पष्ट है (देखें चित्र 6A).
- प्राथमिक ट्यूमर जन का चयन करने के लिए, "ओपन डेटा का चयन करें, फिर" लेबल ", तो" लेबल फ़ील्ड ".
- प्राथमिक thresholding सभी z ढेर छवियों ट्यूमर का चयन करें और z विमान में छवियों के माध्यम से स्क्रॉल करने के लिए तीन आयामों के भीतर केवल प्राथमिक ट्यूमर जन के शामिल किए जाने को सुनिश्चित करने. यह आम तौर पर क्षेत्र में सबसे बड़ा आकार छवि है और अक्सर खंडों प्रकट होता है के रूप में imaged z विमान के माध्यम से तय की है.
- जादू समारोह / छड़ी दहलीज का उपयोग करने के लिए पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति सही है और यह ट्यूमर संकेत के किसी भी discarding बिना छवि से को खत्म करने. "के अंदर फाइल" लेबल हाइलाइट और ⊕ बटन क्लिक करें. "सभी स्लाइसें" चेक बॉक्स का चयन करें. यह thresholded हर z ढेर वेतन वृद्धि में प्राथमिक ट्यूमर के आसपास के क्षेत्र एक रंग सीमा पैदा करता है.
- IGS का चयन करने के लिए, "नई" समारोह का चयन करें. एक एकल पुलिस महानिरीक्षक चयन करें और सुनिश्चित करें z विमान के माध्यम से स्क्रॉल द्वारा प्राथमिक ट्यूमर के साथ संबद्ध नहीं है.
- "सभी स्लाइसें" का चयन करें और ⊕ बटन क्लिक करें. फ़ाइल (पूर्व पुलिस महानिरीक्षक 1) का नाम बदलें
- 7.4 में thresholding प्रक्रिया को दोहराएँ और निर्धारित महानिरीक्षक के लिए 7.5 में कदम पर प्रकाश डाला. एक रूपरेखा प्राथमिक ट्यूमर जन निरूपित किया जाता रंग से अलग रंग का चयन करें.
- के रूप में छवि भर में प्रत्येक अतिरिक्त पुलिस महानिरीक्षक के लिए आवश्यक दोहराएँ, z विमान के माध्यम से स्कैनिंग करने के लिए सुनिश्चित करें सभी IGS चिह्नित हैं. प्रत्येक पहचान पुलिस महानिरीक्षक एड्स के लिए छवि पर भविष्य की पहचान करने में अलग अलग रंग का उपयोग करना.
- एक बार प्राथमिक ट्यूमर और सभी IGS का चयन कर रहे हैं, पुलडाउन मेनू से "विभाजन" का चयन करें, तो "सामग्री सांख्यिकी" का चयन करें. यह मात्रा माप के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक्स, वाई और एक्स ट्यूमर कोर प्राथमिक ट्यूमर के लिए निर्देशांक क्रम में केंद्रीय ट्यूमर बिंदु से IGS की दूरी की गणना प्रदान करता है.
- साथ मात्रा की गणना, प्रत्येक पुलिस महानिरीक्षक के लिए प्राथमिक ट्यूमर के केंद्रीय कोर से दूरी का निर्धारण. "विभाजन", तो "सामग्री सांख्यिकी" चुनें. इस कदम पिक्सल में सभी मापन की गणना करता है. खुर्दबीन उद्देश्य के अंशांकन और बढ़ाई में किसी भी अतिरिक्त वृद्धि (, ज़ूम कार्यों IE) पर आधारित micrometers से पिक्सल में कनवर्ट करें. खुर्दबीन और इन प्रयोगों में इस्तेमाल किया सेटिंग्स के लिए, 40x उद्देश्य कोई ज़ूम के साथ इस्तेमाल किया गया था, 1 पिक्सेल = 0.298 सुक्ष्ममापी एक अंशांकन दे. एक एक्सेल स्प्रेडशीट, जो तीन आयामों में प्राथमिक ट्यूमर (X1, Y1, Z1) के लिए और प्रत्येक पुलिस महानिरीक्षक (: X2, Y2, Z2 पहले पुलिस महानिरीक्षक के लिए पूर्व) के लिए पैरामीटर देता है में डेटा आयात करें.
- प्रत्येक पुलिस महानिरीक्षक के लिए प्राथमिक ट्यूमर के केंद्र से microns में आक्रमण दूरी सूत्र √ ((X2-X1) 2 + (Y2-Y1) + 2 (Z2-Z1) 2) का उपयोग कर की गणना है .
- ट्यूमर आक्रामक सूचकांक (टी आई) टी मैं N = टी वी एक्स एक्स डी टी, जहां एन टी = छवि में IGS की कुल संख्या, वी टी = सभी IGS की कुल मात्रा, डी टी सूत्र का उपयोग कर की गणना है प्राथमिक ट्यूमर के केंद्र से सभी आक्रामक समूहों की = कुल दूरी कूच.
8. Nikon सॉफ्टवेयर एनआईएस - तत्वों के साथ तीन आयामी renderings
- अधिक से अधिक स्थलाकृतिक विस्तार के साथ तीन आयामी renderings Nikon सॉफ्टवेयर एनआईएस - तत्वों में मूल 16 - बिट पूरे ट्यूमर छवि के मोनोक्रोम झगड़ा फ़ाइलें आयात द्वारा उत्पन्न किया जा सकता हैपैकेज (Nikon, मेलविल, NY). "फाइल" का चयन करें, फिर "एनडी", फिर "फ़ाइल अनुक्रम से एनडी फ़ाइल बनाएँ". TIFF छवि z-श्रृंखला ढेर का चयन करें और उचित कदम आकार निर्दिष्ट.
- Xy विमान में एनडी दस्तावेज़ जांचना. एक पिक्सेल का उपयोग कर एक मैनुअल अंशांकन के आकार निर्दिष्ट करें.
- "वॉल्यूम देखें" चुनें. "मुख्यालय" समारोह का उपयोग करने के लिए उच्च गुणवत्ता के लिए z विमान में अतिरिक्त स्लाइस की गणना. "3D रेंडरर सेटिंग्स", "अल्ट्रा उच्च विवरण" और "पूर्ण संकल्प" के एक गुणवत्ता के साथ "उन्नत रेंडरर" का उपयोग करें. "अल्फा सम्मिश्रण" चुनें ट्यूमर सतहों दबाव का चिह्न.
- प्रस्तुति के लिए तीन आयामी छवि का अनुकूलन. ट्यूमर और संबद्ध IGS और फसल के रूप में की जरूरत पर में ज़ूम. Xyz विमानों में छवि घुमाएँ और LUTs समायोजित.
- प्रस्तुति के लिए छवि पर कब्जा. "संपादन बनाएँ देखें (8 बिट आरजीबी) स्नैपशॉट" का चयन करें. फ़ाइल का नाम तथा तदनुसार बचाने.
9. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 कुल मिलाकर orthotopic जीभ ट्यूमर के उत्पादन में और स्वस्थानी दो photon इमेजिंग में महत्वपूर्ण कदम illustrating योजनाबद्ध .
चित्रा 2 माउस जीभ में OSC19 कोशिकाओं को व्यक्त LifeAct - mCherry के इंजेक्शन .
चित्रा 3 resected माउस ट्यूमर युक्त जीभ दो photon इमेजिंग के लिए तैयार है.
चित्रा 4 एक दो photon माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए तैयार पर स्थिति में एक ट्यूमर युक्त जीभ का उन्मुखीकरण.
5 चित्रा प्रतिनिधि ScanImage दो photon प्रारंभिक छवि के कच्चे डाटा अधिग्रहण प्रदर्शन से स्क्रीन शॉट.
चित्रा 6 छवि और एक orthotopic OSC19 ट्यूमर में ट्यूमर आक्रमण की मात्रा का ठहराव विश्लेषण. Amira Voltex (A) प्रतिपादन और एक एकल thresholded z-अनुभाग के प्रतिनिधि स्क्रीन शॉट छवियों (बी) प्राथमिक प्राथमिक ट्यूमर के साथ बैंगनी, इनवेसिव समूह 1 (आईजी-1) नीले रंग में उल्लिखित में उल्लिखित, पुलिस महानिरीक्षक-2 लाल और पुलिस महानिरीक्षक में उल्लिखित पहचान की प्रक्रिया का एक उदाहरण के रूप में हरे रंग में उल्लिखित -3. Arrowheads में IGS निरूपित (ए) और (बी). सी. मात्रा के भूखंड बनाम आठ व्यक्ति ट्यूमर आक्रमण सूचकांक (तिवारी) की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया IGS के लिए दूरी पर आक्रमण किया.
7 चित्रा ट्यूमर के प्रतिनिधि छवियों और इस प्रोटोकॉल से ट्यूमर समूहों पर आक्रमण एक पारंपरिक आईएचसी दृष्टिकोण से छवियों के साथ तुलना में एक पूरे माउस एक UMSCC1 orthotopic ट्यूमर शरण जीभ के आयल अनुभाग . Immunohistochemical धुंधला पारंपरिक प्रक्रियाओं का उपयोग HNSCC विशेष सेल मार्कर emmprin (Zymed 34-5600 # बिल्ली) के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ आयोजित किया गया 1:1000 कमजोर पड़ने पर और OmniMap थपका विरोधी आरबी पता लगाने किट (Ventana बिल्ली # 760 का उपयोग करके कल्पना -149) लोहे hematoxylin धुंधला द्वारा पीछा किया. कुल जीभ क्षेत्र शामिल छवियाँ व्यक्तिगत एक Optronics MicroFire सीसीडी कैमरे के साथ एक ओलिंप ZX70 प्रोविस खुर्दबीन पर 4X बढ़ाई पर एकत्र किए गए थे और StereoINvestigator इमेजिंग पैकेज (बायोसाइंस MBF) का उपयोग खंगाला. ट्यूमर जीभ टिप में स्पष्ट है. एक बढ़े हुए आक्रामक सामने और व्यक्तिगत ट्यूमर कोशिका समूह (arrowheads) दिखा क्षेत्र (बी) के एक प्रतिनिधि OSC19 ट्यूमर का सी. Nikon एनआईएस - तत्वों प्रतिपादन में दिखाया गया है. बढ़ी समोच्च विस्तार और IGS का स्पष्ट दृश्य (arrowheads) स्पष्ट है. सभी छवियों में बार्स = 100 सुक्ष्ममापी.
Discussion
Orthotopic माउस मॉडल सिर और गर्दन के कैंसर 1,2 के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए उपयोगी सिद्ध कर दिया है. हम सिर और गर्दन ट्यूमर सेल आक्रमण के प्रारंभिक घटनाओं के अध्ययन के लिए एक प्रणाली के रूप में mCherry लेबल की कोशिकाओं के दो photon माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के साथ एक अच्छी तरह से स्थापित 3 स्काटलैंड का निवासी के orthotopic प्रणाली संयुक्त है. इस प्रक्रिया में, हम उल्लेख किया है कि कोशिकाओं ट्यूमर इंजेक्शन की साइट से छह सप्ताह या छोटी चूहों अपर्याप्त जीभ आकार के कारण में, विशेष रूप से लीक कर सकते हैं. हम बड़े चूहों का उपयोग करने के लिए इस मुद्दे से बचने के. बड़े बड़े चूहों के साथ जीभ आकार भी एक बहुभाषी और जीभ से अत्यधिक ख़ून का बहाव धमनी का टूटना से बचने में एड्स. ट्यूमर ले बहुत बढ़ाया है जब जीभ नाटकीय रूप से प्रारंभिक इंजेक्शन के स्थल पर पहुँच जाती है. इंजेक्शन तरल पदार्थ के रूप में एक - दो घंटे के भीतर यह सूजन उतरे अवशोषित हो जाती है. ट्यूमर के विकास के संकेत इंजेक्शन जीभ की सतह पर एक छोटे सफेद टक्कर के रूप में सेल नंबर के साथ स्पष्ट एक - दो सप्ताह के बाद इंजेक्शन प्रकट होता है. हम यह भी ध्यान रखें कि हमारे यहाँ प्रस्तुत अध्ययन में प्रयोग किया जाता 40x उद्देश्य पर, हम व्यक्तिगत ट्यूमर कोशिकाओं भेद नहीं लेकिन इनवेसिव सेल समूहों कि HNSCC आक्रमण की ठेठ मोड पुनरावृत्ति के रूप में IGS की पहचान कर सकते हैं.
तिथि करने के लिए इस मॉडल बड़े पैमाने पर किया गया है विशेष के अणुओं की भूमिका के रूप में के रूप में अच्छी तरह से स्काटलैंड का निवासी एक आक्रमण विकास पर कई विरोधी ट्यूमर दवाओं गर्भाशय ग्रीवा लिम्फ नोड मेटास्टेसिस निगरानी आईएचसी या bioluminescent 4-7 तरीकों का उपयोग कर से मापा प्रभावकारिता के साथ, परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया. इस प्रणाली जीभ सतह (चित्रा 7) के करीब प्रकट में गठित ट्यूमर, दो photon माइक्रोस्कोपी के आक्रामक बहु सेलुलर समूहों के रूप में स्वस्थानी में छवि पूरे ट्यूमर के लिए आवेदन की अनुमति. प्रक्रिया भी सेलुलर संकल्प के साथ ट्यूमर आक्रमण कल्पना करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. दो photon माइक्रोस्कोपी पहले किया गया है और 8,9 orthotopic और xenograft 8,10 मॉडल में सिर और गर्दन के कैंसर के लिए प्रयोगात्मक उपचार का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया. हालांकि, वहाँ इन रिपोर्टों और हमारे प्रोटोकॉल के बीच दो प्रमुख मतभेद रहे हैं. सबसे पहले, इन अध्ययनों कोशिकी लेबल का उपयोग करने के लिए लक्ष्य / सिर और गर्दन ट्यूमर कोशिकाओं की पहचान, संभवतः संचलन के लिए पर्याप्त का उपयोग के साथ केवल ट्यूमर कोशिकाओं को पता लगाने के सीमित. दूसरा आक्रमण, ट्यूमर प्राथमिक साइट के लिए करीब कोशिकाओं है कि संभावना recapitulates जल्दी metastatic गतिविधि एक प्रयोगात्मक पैरामीटर के रूप में नहीं मूल्यांकन किया गया था. हमारे प्रोटोकॉल की क्षमता को सीधे किसी भी बिंदु पर माउस जीभ में ट्यूमर प्रगति के दौरान ट्यूमर सेल आक्रमण यों प्रदान करता है. जबकि विधि यहाँ वर्णित प्रक्रिया का वर्णन dissected जीभ का उपयोग करते हुए, हम छवि ट्यूमर आक्रमण bioluminescence के साथ संयोजन में उपयोग के लिए जीवित चूहों में इस विधि के लिए एक साथ जल्दी आक्रमण, स्थानीय लसीका नोड भागीदारी और दूर मेटास्टेसिस की निगरानी के लिए आदत डाल की प्रक्रिया में वर्तमान में हैं वही जानवर. Vivo इमेजिंग में के लिए प्रोटोकॉल के लिए बदलाव स्थिति के लिए एक उपयुक्त मंच के डिजाइन की आवश्यकता होती है और बनाए रखने इमेजिंग के दौरान चूहों, के रूप में एक व्यावहारिक प्रणाली के रूप में अच्छी तरह से ठीक इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान anesthetized चूहों के मौखिक गुहा की सिंचाई. एक बार अनुकूलित किया है, इन रूपांतरों संभावित समर्थक आक्रामक अणुओं और स्थानीय आक्रमण और अधिक दूर बढ़ाया समय अवधि से अधिक पशुओं में metastatic भागीदारी पर परीक्षण आक्रामक विरोधी यौगिकों की भूमिका का अध्ययन करने की क्षमता प्रदान करेगा.
Disclosures
लेखकों खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
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