Multi-photon avbildning av tumörcellen invasion i ett Orthotopic musmodell av oral skivepitelcancer

Summary

En omfattande översikt av de tekniker som är inblandade i att skapa en musmodell av cancer i munhålan och kvantitativ uppföljning av tumör invasion i tungan genom multi-foton mikroskopi av märkta celler presenteras. Detta system kan fungera som en användbar plattform för de molekylära bedömning och drog effekt av anti-invasiva föreningar.

Abstract

Loco-regional invasionen av huvud-och halscancer är kopplat till metastaserande risk och innebär en svår utmaning att utforma och genomföra strategier för patienten. Orthotopic musmodeller för cancer i munhålan har utvecklats för att underlätta studier av faktorer som påverkar invasionen och tjäna som modell för utvärdering av anti-tumör terapi. I dessa system har visualisering av sprids tumör celler i munhålan vävnader vanligtvis gjorts av antingen konventionell histologi eller med in vivo självlysande metoder. En primär nackdel med dessa tekniker är den inneboende oförmåga att korrekt visualisera och kvantifiera tidiga tumörcellen invasion som härrör från den ursprungliga platsen i tre dimensioner. Här beskriver vi ett protokoll som kombinerar en etablerad modell för skivepitelcancer i tungan (SCOT) med två-photon imaging att tillåta flera vectorial visualisering av linguala tumören spridit sig. OSC-19 huvud och hals tumör cellinje var stabilt konstruerad för att uttrycka F-aktin bindande peptid LifeAct smält till mCherry fluorescerande protein (LifeAct-mCherry). Fox1 ^{nu / nu} möss injiceras med dessa celler bildar ett tillförlitligt tumörer som gör att tungan ska visualiseras genom ex vivo tillämpning av två-photon mikroskopi. Denna teknik gör det möjligt att orthotopic visualisering av tumören massa och lokalt invaderande celler i utskurna tungor utan avbrott i det regionala tumör mikromiljö. Dessutom kan detta system för kvantifiering av tumörcellen invasion genom att beräkna avstånd som invaderade celler flytta från den primära tumören platsen. Sammantaget detta förfarande ger en förbättrad modell för att analysera faktorer som bidrar till SCOT invasionen och terapeutiska behandlingar skräddarsys för att förhindra lokal invasion och fjärran metastasering. Denna metod har också potential att bli i slutändan kombineras med andra avbildningsmetoder i en in vivo miljö.

Protocol

1. Cellinjer, vektorns uppbyggnad och Lentiviral Produktion

1. Mänskliga huvud och hals tumörceller linjer (OSC19 eller UMSCC1) odlades i fullständig media bestående av DMEM (Cellgro katt # 50-003-PB) kompletterad med 10% fetalt bovint serum FBS (Hyclone katt # SH30070.03), 1% penicillin / streptomycin (Cellgro katt # 30-002-CI), och 1% icke-essentiella aminosyror (Cellgro katt # 25-025-CI).
2. För att överföra LifeAct-mCherry kodande sekvens i pLL7.0 Lentiviral vektor var Sbf1 erkännande plats i moderbolaget mCherry cDNA förändras genom att införa tre tysta mutationer i erkännandet sekvensen med hjälp av platsspecifika riktad mutagenes (Stratagene katt # 200.518 till 5). Den resulterande modifierade LifeAct-mCherry sekvensen var då PCR amplifieras med flankerande EcoR1/Sbf1 platser och subcloned i pLL7.0 att generera pLL7.0-LifeAct-mCherry konstruktion.

2. pLL7.0-LifeAct-mCherry Virus Produktion

1. Viral produktionen genomfördes enligt Lentiviral Expression Systems manuell (System Bioscience version 2 till 051.018).
2. Förpackningen cellinje 293T/17 celler (ATCC katt # CRL-11.268) var vuxit till 40% confluence i samma kompletta media används för HNSCC linjer.
3. Celler var transfererats med pLL7.0-LifeAct-mCherry, psPAX2 och pVSV-G vektorer i en 03:02:01 förhållande, respektive med hjälp CalPhos (Clontech katt # 631.312).
4. Efter 24 timmar var den ursprungliga materialet från transfektion ersättas med nya medier.
5. Media var då samlas in och fylls på varje 12 timmar under 72 timmar och förvaras vid 4 ° C.

3. Produktion av Head and Neck cellinjer med stabila LifeAct-mCherry Expression

1. De insamlade media knoppades vid 2000 rpm i 10 minuter vid 4 ° C.
2. En ml förtydligas media som innehåller viruset direkt läggs till OSC19 eller UMSCC1 celler i 12 timmar. Celler Därefter sköljdes, och ytterligare ett mL virus inkom ytterligare 12 timmars period.
3. Cellerna behandlades med media som innehåller 200mg/ml puromycin under två veckor att välja resistenta kolonier.
4. Överlevande kloner visades visuellt för LifeAct-mCherry uttryck genom fluorescensmikroskopi. Individuella positiva kolonier typsinized med steril 3mm kloning skivor (Fisher katt # 0790710A).
5. Positiva celler bibehölls i media som innehåller 200mg/ml puromycin tills frysta tillbaka eller används för orthotopic injektion.

4. Orthotopic tumör xenograft Bildning

1. Alla animaliska förfaranden utförts i enlighet med ett protokoll (09-0821) godkänd av West Virginia University Djurvård och användning kommittén.
2. LifeAct-mCherry uttryckande tumörceller var trypsinized, centrifugeras och 2,5 x 10 ⁴ celler suspenderade i 50 mikroliter komplett media.
3. Tumörceller laddades i en ml spruta kopplad till en 27 ½ gauge nål.
4. Kvinna athymic Fox1 ^{nu / nu} möss 8 veckors ålder (Harlan Laboratories) var bedövas med en kombination av 80mg/kg ketamin och 10mg/kg xylazin. Sövda möss hållas mellan 37-40 ° C på en värmedyna.
5. Använda steril tång, var tungspetsen försiktigt förstått och försiktigt dras ut ur munhålan.
6. Celler långsamt injiceras i en sida av varje tungan för att skapa en uppsvällda massa i tungan centrum, undvika linguala artärerna.
7. Möss injicerades med 2.1mg/kg Johimbin och återvände till värmedyna där de övervakas i 2-3 timmar under återhämtning från anestesi.
8. När återupplivade, möss placeras i sterila burar som innehåller en mjuk transgena deg diet (Bioserve katt # S3472).
9. Möss vägdes var 2-3 dagar och kontrolleras visuellt för tumör debut.

5. Beredning av Mouse tungor ex vivo Imaging

1. Möss hysa tumörer vid olika tidpunkter (vanligtvis 2-4 veckor efter injektion) var avlivas med koldioxid inandning.
2. Tungor utvanns, sköljas med 1X PBS och fäst vid ena sidan av en vanlig paraffin vävnad inbäddning kassett (StatLab Katt # H104,) med hjälp av tråd monofilament sy från en lokal hobby butik och en storlek 8 synål.
3. När tungor var orörlig, var hela kassetten församlingen placeras i en 30mm vävnadsodling skålen och nedsänkt i 1X PBS.
4. Bearbetade tungor genast användas för två-photon excitation mikroskopi.

6. Avbildning av Tongue Tumörer med två-photon Mikroskopi

1. Tungan kassetter var nedsänkt i en 60mm maträtt som innehåller 1X PBS fast i en färdig konstruerad hållare på en utdragbar konsol armen (avdelningen Shuttle, Siskiyou instrument) placerad under målet om en upprätt mikroskop (Flyttbar mikroskop (MOM), Sutter instrument).
2. En 40X/0.8NA vatten att doppa objektiv var placeras direkt på eller över synliga tumeller skador. Tungor var avbildade med två foton mikroskopi med Ti: safir laser (Mira, sammanhängande) intensitet på 60 mW och input våglängd på 755 nm för att optimera mCherry signalen.
3. Serial 1mm laserskanning bilder samlades in vid 1 mikrometer inkrementella djup under sammanlagt vävnad djup mellan 15 och 100 ìm (beroende på tumörens volym). Bilderna har tagits med ScanImage, ett open source-program baserade på MATLAB-plattform som utvecklats av Karel Svoboda laboratorium (Janelia Farms, HHMI). ScanImage genererar en två-kanals utgång rasterscan mönster för att styra x / y galvanometric skanna speglar, och samtidigt fångar högst fyra kanaler insignal samtidigt från Fotomultiplikatorrör (PMTs) genom en datainsamling board (PCI-6610S , National Instruments). Den PMT signaler förstärks genom låg ljudnivå nuvarande förförstärkare (SR570, Stanford Research System) innan matas in i NI-DAQ board för visning på skärmen. ScanImage samlar z-stack bilder genom att styra z-axeln i målet och samlar in Time-lapse bilder i en enda eller cyklar. Bilder räddades i en enda TIFF-fil med 16 bitars djup.

7. Bildanalys med hjälp av Amira Software

1. Amira bildhantering för tumör kvantifiering: I Aimra programvara öppnar TIFF-fil som innehåller den uppsättning av z-stack bilder.
2. Markera filnamnet, välja och tillämpa den Voltex funktionen för att skapa en tredimensionell återgivning. En stor primärtumör bild med flera mindre, dissocierade invasiva grupp (IG) i kollektivt invaderade celler är vanligtvis tydligt i den renderade bilden (se figur 6A).
3. För att välja den primära tumören massan, välj "Öppna Data", sedan "märkning", sedan "Label Field".
4. Tröskling den primära tumören välja alla z-stack bilder och bläddra igenom bilderna i z-planet för att säkerställa införandet av enbart den primära tumören massa inom tre dimensioner. Detta är vanligtvis den största bildstorlek på fältet och ofta visas segmenterade som avbildas är passeras genom z-planet.
5. Använd trollspö / tröskel-funktionen för att korrigera bakgrundsfluorescens och eliminera det från bilden utan att kasta någon av tumören signalen. Markera "Inside File" etiketten och klicka på ⊕ knappen. Välj "Alla skivor" kryssrutan. Detta ger en färgad ram runt thresholded primära tumören område i varje z-stack steg.
6. För att välja integrerade riktlinjerna, välj "Nytt"-funktion. Välj en enda IG och se till att den inte är förknippad med den primära tumören genom att bläddra igenom z-planet.
7. Välj "Alla segment" och klicka på ⊕ knappen. Döp om filen (ex: IG 1)
8. Upprepa tröskling förfarandet i 7.4 och lyfta steg 7,5 för de fastställda IG. Välj ett konturfärgen annorlunda än den färg som används för att beteckna den primära tumören massa.
9. Upprepa vid behov för varje ytterligare IG i hela bilden, skanning genom z-planet att säkerställa att alla integrerade riktlinjerna betecknas. Att använda olika färger för varje identifierad IG hjälpmedel i framtiden identifiering på bilden.
10. När den primära tumören och alla integrerade riktlinjerna är valda, välj "Segmentering" från rullgardinsmenyn, välj sedan "Material Statistik". Detta ger volymmätning samt X, Y och X tumör kärna koordinater för den primära tumören för att beräkna avstånd av integrerade riktlinjerna från den centrala tumören punkt.
11. Med de volymer beräknas bestämma avståndet för varje IG från den centrala kärnan av den primära tumören. Välj "segmentering" och sedan "Material Statistik". Detta steg beräknar alla mått i pixlar. Konvertera pixlar mikrometer bygger på kalibrering av mikroskopet mål och eventuella ytterligare höjningar av förstoring (dvs, zoom funktioner). För mikroskop och inställningar som används i dessa experiment var 40X objektiv som används utan zoom, vilket ger en kalibrering av 1 pixel = 0,298 ìm. Importera data till ett Excel-ark, som ger parametrar för den primära tumören i tre dimensioner (X1, Y1, Z1) och för varje IG (ex: X2, Y2, Z2 för första IG).
12. De invaderade avstånd i mikron för varje IG från centrum av den primära tumören beräknas med formeln √ ((X2-X1) ² + (Y2-Y1) ² + (Z2-Z1) ^2).
13. Tumören invasiva index (T _I) beräknas enligt formeln T _I = N _T x V _T x D _T, där N _T = det totala antalet integrerade riktlinjerna i bilden, V _T = den totala volymen av alla integrerade riktlinjerna, D _T = total tillryggalagd sträcka av alla invasiva grupper från mitten av den primära tumören.

8. Tredimensionell renderingar med Nikon NIS-Elements

1. Tredimensionell renderingar med större topografiska detaljer kan genereras genom att importera den ursprungliga 16-bitars monokrom TIFF-filer av hela tumören bilden i Nikons NIS-Elementspaket (Nikon, Melville, NY). Välj "File", sedan "ND", sedan "Skapa ND fil från Sequence". Välj TIFF Z-serien bildstapel och anger lämpliga steg storlek.
2. Kalibrera ND dokumentet i xy-planet. Ange storleken på en pixel med hjälp av en manuell kalibrering.
3. Välj "Volym Visa". Använd "HQ" funktion för att beräkna ytterligare skivor i z-planet för högre kvalitet. I "3D Renderer Inställningar", använd "Avancerad Renderer" med en kvalitet av "Ultra High Detaljer" och "full upplösning". Välj "alfablandning" för att accentuera tumören ytor.
4. Optimera tredimensionell bild för presentation. Zooma in på tumören och tillhörande integrerade riktlinjerna och beskära efter behov. Rotera bilden i XYZ plan och justera LUT.
5. Fånga bilden för presentationen. Välj "Redigera-Skapa vy Snapshot (8 bitars RGB)". Namnge och spara filen därefter.

9. Representativa resultat

Figur 1. Övergripande schematisk illustrerar viktiga steg i orthotopic tungan tumör produktion och på plats två photon avbildning.

Figur 2. Injektion av LifeAct-mCherry uttrycker OSC19 celler i musen tungan.

Figur 3 resekterat tumör som innehåller mus tungan förberett för två photon avbildning.

Figur 4. Orientering av en tumör som innehåller tungan på plats på ett två foton mikroskopi redo för avbildning.

Figur 5. Representant skärmdump från ScanImage visar rådata förvärvet av de första två-photon bild.

Figur 6. Bildanalys och kvantifiering av tumör invasion i ett orthotopic OSC19 tumör. Representant skärmbilder av Amira Voltex rendering (A) och en enda thresholded z-avsnitt (B) med den primära primärtumör beskrivs i lila, invasiva grupp 1 (IG-1) som beskrivs i blått, IG-2 beskrivs i rött och IG -3 beskrivs i grönt som ett exempel på identifiering. Pilspetsar betecknar integrerade riktlinjerna i (A) och (B). C. Tomter volym kontra invaderade avstånd för åtta enskilda integrerade riktlinjerna används för att beräkna tumören invasionen (TI).

Figur 7. Representant bilder av tumörer och invaderade tumör grupper från detta protokoll i jämförelse med bilder från en konventionell IHC strategi. A. Paraffin del av en hel mus tungan hyser en UMSCC1 orthotopic tumör. Immunhistokemisk färgning utfördes med konventionella metoder med en primär antikropp mot HNSCC-specifik cell markör emmprin (Zymed, katt # 34-5600) på 1:1000 utspädning och visualiseras med hjälp av OmniMap DAB anti-Rb Detection Kit (Ventana katt # 760 -149) följt av järn-hematoxylin färgning. Bilder som omfattar den totala tungan området samlades in individuellt till 4x förstoring på en Olympus ZX70 Provis mikroskop med en Optronics MicroFire CCD-kamera och rekonstrueras med hjälp av paketet StereoINvestigator imaging (MBF Bioscience). Tumören är uppenbar på tungan spets. En utvidgad region visar invasiva fronten och enskilda tumör grupper cell (pilspetsar) visas i (B). C. Nikon NIS-element rendering av en representant OSC19 tumör. Förbättrad kontur detaljer och tydlig visualisering av IGS (pilspetsar) är uppenbar. Barer på alla bilder = 100 ìm.

Discussion

Orthotopic musmodeller har visat sig användbart för att studera många aspekter av huvud-och halscancer ^1,2. Vi har kombinerat en väl etablerad orthotopic system av SCOT ³ med två-photon mikroskopi avbildning av mCherry-märkta celler som ett system för att studera de tidiga händelserna i huvud och hals tumörcellen invasion. I detta förfarande har vi noterat att celler kan läcka från platsen för tumören injektion, speciellt i möss sex veckor eller yngre på grund av otillräcklig tungan storlek. Vi använder äldre möss för att undvika detta problem. De större tungan storlek med äldre möss hjälper också till att undvika ruptur av en flerspråkig artär och överdrivna blödningar från tungan. Tumör ta förbättras avsevärt när tungan dramatiskt sväller på platsen för första injektionen. Denna svullnad avtar inom en tre dygn när den injicerade vätskan absorberas. Tumörtillväxt verkar uppenbart 1-2 veckor efter injektion med den injicerade anges antalet celler som en liten vit bula på tungan ytan. Vi noterar också att vid 40X objektiv som används i våra studier som presenteras här kan vi inte urskilja enskilda tumörceller men inte fastställer integrerade riktlinjerna som invasiv cell kluster som rekapitulera det typiska sättet att HNSCC invasion.

Hittills denna modell har i stor utsträckning används för att testa rollen av specifika molekyler samt flera anti-tumör läkemedel på SCOT tillväxten en invasion, med effekt mätt med livmoderhalscancer lymfa övervakas nod metastaser med IHC eller självlysande metoder ^4-7. Tumörer som bildas i detta system manifestet nära tungan ytan (Figur 7), vilket gör att tillämpningen av två-photon mikroskopi för att bilden hela tumörer på plats som invasiv flercelliga kluster. Förfarandet kan också användas för att visualisera tumören invasionen med cellulära upplösning. Två-foton mikroskopi har tidigare utnyttjats för att studera experimentella behandlingar för huvud-och halscancer i orthotopic ^8,9 och xenograft ^8,10 modeller. Det finns dock två stora skillnader mellan dessa rapporter och våra protokoll. Först dessa studier använder extracellulära etiketter för att rikta / identifiera huvud och hals tumörceller, eventuellt begränsa upptäckt bara för att tumörceller med riklig tillgång till cirkulationen. För det andra invasion av tumörceller nära den primära platsen som sannolikt rekapitulerar tidigt metastaserande verksamheten inte bedömdes som en experimentell parameter. Vårt protokoll ger möjlighet att direkt kvantifiera tumörceller invasion när som helst under tumörprogression hos mus tungor. Medan den metod som beskrivs här beskrivs det förfarande med dissekeras tungor, vi är just nu i färd med att anpassa denna metod för att bilden tumör invasion i levande möss för användning i kombination med mareld att samtidigt övervaka tidiga invasion, lokala lymfknutor och fjärrmetastaser i samma djur. Ändringar till protokollet för in vivo-avbildning kräver utformning av en lämplig tidpunkt för placering och underhåll av möss under bildhantering, samt ett praktiskt system för att korrekt vattna munhålan på sövda möss under avbildning förfarandet. När optimerad, kommer dessa anpassningar ger möjlighet att studera vilken roll potentiella pro-invasiv molekyler och testa anti-invasiva föreningar på lokal invasion och mer avlägsna metastaser hos djur under längre tidsperioder.