多光子成像在口腔鳞状细胞癌原位小鼠模型的肿瘤细胞的侵袭

Summary

产生的口腔癌和肿瘤浸润的定量监测的小鼠模型，通过多光子显微镜标记细胞内的舌头所涉及的技术的一个全面的概述。该系统可以作为一个有用的平台和反侵入性化合物的分子评估药物疗效。

Abstract

局部区域的头部和颈部癌症的侵袭与转移风险，并提出了一个艰巨的挑战，在设计和实施病人的管理策略。口腔癌的原位小鼠模型已发展促进因素的研究评估抗肿瘤疗法的影响作为模型系统的入侵和服务。在这些系统中，可视化口腔组织内扩散的肿瘤细胞通常被无论是传统的组织学或在体内的生物发光方法进行。这些技术的主要缺点是固有的无法准确可视化和量化早期肿瘤细胞的侵袭，在三维空间中的主站点所产生的。在这里，我们描述了一个协议，结合舌鳞状细胞癌（SCOT）建立了双光子成像模型允许多矢量舌肿瘤扩散的可视化。 OSC - 19头颈部肿瘤细胞株的稳定设计，来表达的F -肌动蛋白结合肽LifeAct融合mCherry荧光蛋白（LifeAct mCherry）。可靠Fox1 ^{NU / NU}与这些细胞注入小鼠的肿瘤形成，使舌头前体内应用双光子显微镜观察。这种技术可以让肿块原位可视化和本地切除舌头侵略无区域的肿瘤微环境的破坏细胞。此外，这个系统可以让肿瘤细胞的侵袭入侵细胞从原发肿瘤部位移动的距离计算的量化。总体来说，这一过程提供了一个分析SCOT入侵和定制，以防止局部浸润和远处转移扩散的治疗因素，有助于增强型系统。这种方法也有可能最终要与其他成像方式在体内设置相结合的。

Protocol

1。细胞株中，载体的构建及慢病毒生产

1. 在培养人的头部和颈部肿瘤细胞系（OSC19或UMSCC1）组成的完整的媒体的DMEM（Cellgro猫＃50 - 003 - PB）与10％小牛血清胎牛血清（Hyclone公司猫＃SH30070.03），1％青霉素补充/链霉素（Cellgro猫＃30 - 002 - CI），1％非必需氨基酸（Cellgro猫＃25 - 025 - CI）。
2. 要转移到的LifeAct mCherry编码序列的pLL7.0慢病毒载体，在父mCherry的cDNA Sbf1识别位点改变​​引入定点突变（Stratagene公司猫＃200518-5）的识别序列的3个沉默突变。修改LifeAct mCherry序列PCR扩增与侧翼EcoR1/Sbf1网站和亚克隆到pLL7.0产生的pLL7.0 LifeAct mCherry构造。

2。 pLL7.0 - LifeAct mCherry病毒生产

1. 病毒生产慢病毒表达系统手册（系统生物科学版2-051018）。
2. 包装细胞系293T/17细胞（ATCC猫＃CRL - 11268）增长到40％，在头颈部鳞癌线使用相同的完整的媒体合流。
3. 细胞转染的pLL7.0 LifeAct - mCherry，psPAX2，并在3:2:1的比例pVSV - G的载体，分别使用CalPhos（Clontech公司猫＃631312）。
4. 24小时后，从转染的初步媒体与新媒体取代。
5. 媒体当时收集和补充为72小时，每12小时，并保存在4 ° C

3。头颈细胞系的生产与稳定的LifeAct mCherry表达

1. 收集媒体是在2000年的10分钟的转速旋转4 ° C。
2. 一毫升含有病毒的澄清媒体直接添加OSC19或UMSCC1细胞12小时。细胞，然后冲洗干净，并为另外12个小时的时间内增加一个额外的病毒之一毫升。
3. 细胞用含有两个星期200mg/ml嘌呤霉素选择抗性菌落媒体。
4. 尚存的克隆筛选LifeAct mCherry表达直观地通过荧光显微镜观察。个别阳性菌落，用无菌3毫米克隆光盘（费舍尔猫＃0790710A）typsinized。
5. 阳性细胞维持，直到冻结或原位注射含200mg/ml嘌呤媒体。

4。原位肿瘤异种移植形成

1. 按照西弗吉尼亚大学动物护理和使用委员会批准了一项协议（09-0821），所有动物的程序进行。
2. LifeAct - mCherry表达的肿瘤细胞，胰酶消化，离心，2.5 × ¹⁰ 4细胞重悬于50μL完整的媒体。
3. 肿瘤细胞装入一个连接到一个27毫升的注射器半针头。
4. 女裸鼠Fox1 ^{NU / nu}小鼠8周龄（哈伦实验室）80mg/kg氯胺酮和10mg/kg的甲苯噻嗪联合麻醉。加热垫，麻醉小鼠均保持在37-40 ° C之间。
5. 用无菌镊子，舌尖轻轻抓住，小心拉出口腔。
6. 细胞注入每个舌的一侧慢慢在舌中心创建一个球茎质量，避免舌动脉。
7. 小鼠注射2.1mg/kg育亨宾和返回他们在那里为2-3小时监控从麻醉中恢复期间的加热垫。
8. 一旦恢复，小鼠放入含有软转基因面团饮食（S3472＃BioServe公司猫）无菌笼。
9. 小鼠称重，每2-3天，可视化和监测肿瘤发病。

5。 EX -活体成像的小鼠舌头的制备

1. 窝藏在不同时间点（通常注射后2-4周）肿瘤的小鼠吸入二氧化碳安乐死。
2. 提取舌头，用1X PBS漂洗，并连接到一个传统的石蜡组织包埋盒式侧（StatLab猫＃H104）从本地爱好店和一个大小为8缝衣针使用的单丝缝纫线。
3. 一旦被固定的舌头，整个磁带大会被安置在30毫米组织培养皿中，并沉浸在1X PBS。
4. 加工舌头立即用于双光子激发显微镜。

6。双光子显微镜成像舌肿瘤

1. 舌录音带被淹没在一个60毫米含有1X PBS菜定制设计一个可伸缩的悬臂下一个堂堂正正的显微镜（可移动的显微镜（MOM），萨特仪器）目标定位（商会班车，锡斯基尤文书）的持有人担保。
2. 一个40X/0.8NA水浸渍物镜直接放置或以上可见慕尼黑或病变。舌头与钛蓝宝石激光器（MIRA，连贯）优化mCherry信号强度为60兆瓦，输入波长755纳米的双光子显微镜成像。
3. 串行1毫米激光扫描图像采集在1微米的深度超过15和100微米之间（取决于肿瘤体积）共组织深入增量。被抓获的图像使用ScanImage基于MATLAB平台，是由卡雷尔斯沃博达实验室（Janelia农场，HHMI）的开发，开放源码的程序。 ScanImage产生的光栅扫描模式的双通道输出控制X / Y振镜扫描镜，并在同一时间捕捉一个最大的的四通道信号输入，同时通过数据采集板的光电倍增管（光电倍增管）（PCI - 6610S ，美国国家仪器公司）。光电倍增管的信号放大，低噪声电流前置放大器（SR570，斯坦福研究系统），在喂养的NI - DAQ板，显示在监视器屏幕上。 ScanImage收集控制目标的Z轴的Z - Stack的图像，并收集在一个单一的或循环模式的时间推移图像。图像保存在一个单一的TIFF文件，16位深度。

7。使用阿米拉软件进行图像分析

1. 阿米拉成像对肿瘤量化：在Aimra软件中，打开包含Z - Stack的图像的TIFF文件。
2. 突出显示的文件名称，选择和应用Voltex功能生成三维渲染。一个大主与几个较小的，分离侵入组集体入侵细胞（IG）肿瘤形象呈现的图像中通常明显（见图6A）。
3. 要选择主肿块，选择“打开数据”，然后在“标签”，那么“标签字段”。
4. 阈值的原发肿瘤，选择所有的Z - Stack的图像，并通过在z平面的图像，滚动，以确保在三个方面列入只有小学肿块。这通常是该领域最大的尺寸的图像，并常常出现分割的成像是通过z平面走过。
5. 使用魔术棒/阈值的功能，以正确的背景荧光，消除它从没有丢弃任何的肿瘤信号形象。突出显示“内部文件”标签，并单击⊕按钮。选择“所有切片”复选框。这将产生一个大约每Z - Stack的增量的阈值在原发肿瘤区域的彩色边框。
6. 要选择IGS，选择“新建”功能。选择一个IG和确保它不是通过滚动z平面的原发肿瘤相关。
7. 选择“所有切片”，并单击⊕按钮。重命名文件（例如：IG 1）
8. 7.4重复阈值的程序，并在7.5突出确定IG一步。选择一个轮廓的颜色比，用来表示主肿块颜色不同。
9. 重复整个图像的每个额外的中空玻璃的必要，通过Z -平面扫描，以确保所有IGS表示。使用不同的颜色为每个确定的中空玻璃艾滋病在未来的形象识别。
10. 一旦原发肿瘤和所有IGS的选择，从下拉菜单中选择“分割”，然后选择“资料统计”。这提供了体积测量以及X，Y和X肿瘤原发肿瘤的核心坐标，从中央的肿瘤点，以计算距离的IGS。
11. 随着卷计算，确定每个IG的距离从原发肿瘤的核心。选择“分割”，“资料统计”。这一步计算成像素的所有测量。将像素转换基于显微镜物镜的校准和放大倍率任何额外增加（即变焦功能）微米。显微镜，并在这些实验中使用的设置，使用40X的目标是没有变焦，给予1个像素= 0.298微米的校准。数据导入到Excel电子表格，这给在三个方面的主要肿瘤（X1，Y1，Z1），并为每个IG（X2，Y2，Z2为第一IG前）的参数。
12. 从原发肿瘤中心为每个中空微米的入侵距离计算公式√（（X2 - X1的^）2 +（Y2 - ^Y1）2 +（Z2 - ^Z1）2） 。
13. 肿瘤浸润指数_（T）计算公式_T I = _N T x垂直_{T X D} T _N T = IGS在图像的总数_，V T =所有IGS的总_体积 ， D T =总行驶距离从原发肿瘤中心的所有侵入组。

8。三与尼康的NIS - Elements软件的三维效果图

1. 三尼康NIS - Elements软件导入原来的16位单色TIFF整个肿瘤图像文件，可以产生更大的地形细节的三维渲染包（尼康，梅尔维尔，纽约州）。选择“文件”，然后“ND”，然后“创建文件序列的Nd文件”。选择TIFF Z系列的形象栈，并指定相应的步骤大小。
2. 校准在XY平面ND文件。指定的一个像素使用手动校准的大小。
3. 选择“卷视图”。使用“总部”的功能，更高的质量来计算z平面的其他片。在“3D渲染设置”，使用“高级渲染”与“超详细”和“全分辨率”的质量。选择“Alpha混合”，以突出肿瘤表面。
4. 优化用于演示的三维图像。在肿瘤和相关的IGS和作物需要放大。在XYZ平面旋转的图像和调整的LUT。
5. 捕捉演示的图像。选择“编辑创建视图快照（8位RGB）”。相应的名称和保存文件。

9。代表性的成果

图1。整体示意图，说明原位舌肿瘤的生产和原位双光子成像的关键步骤。

图2。LifeAct - mCherry OSC19细胞注射到老鼠的母语表达。

图3切除肿瘤含小鼠舌准备两个光子成像。

图4。定位在位置上的双光子显微镜成像肿瘤含舌。

图5代表屏幕上拍摄的，从ScanImage展示最初的双光子图像采集原始数据。

图6：在原位OSC19肿瘤，肿瘤侵袭的图像分析和定量。代表屏幕上拍摄的图像阿米拉Voltex渲染（A）和一个单一的阈值的Z -第（二）与主要的原发肿瘤紫色，侵入在蓝组1概述（IG - 1）概述，概述了红色和IG IG - 2 -3概述了绿色的识别过程中的一个例子。箭头表示IGS在（A）和（B）卷 C图与八个单独用来计算肿瘤侵袭指数（TI）IGS入侵距离。

图7。肿瘤的代表图像，并从本议定书入侵肿瘤组与常规免疫组化方法的图像相比 。A.鼠标整个舌头，窝藏UMSCC1原位肿瘤的石蜡切片。免疫组织化学染色是使用常规程序进行对特定的头颈部鳞癌细胞标记EMMPRIN（Zymed公司;猫＃34-5600）的主要抗体，1:1000稀释和使用OmniMap民建联反RB检测试剂盒（Ventana公司的猫＃760的可视化-149），其次是铁苏木素染色。包括舌头总面积的图像单独收集奥林巴斯ZX70 Provis光电MicroFire CCD相机显微镜放大4X和重建使用StereoINvestigator成像包（医疗保险基金生命科学）。肿瘤是显而易见的，在舌尖。扩大区域入侵前和个人的肿瘤细胞群（箭头）（B）C.尼康NIS元素渲染的具有代表性的OSC19肿瘤。增强的轮廓细节和清晰的可视化的IGS（箭头）是显而易见的。所有图像酒吧= 100微米。

Discussion

原位小鼠模型为研究的头部和颈部癌症^1,2许多方面已证明是有益的。我们结合双光子显微成像mCherry标记的细胞，作为一个系统来研究的头部和颈部肿瘤细胞浸润的早期事件以及建立原位系统的^SCOT 3 。在此过程中，我们注意到，细胞可以从肿瘤注射部位泄漏，尤其是在小鼠的6个星期或以下由于没有足够的舌头大小，。我们用年纪较大的老鼠，以避免这个问题。与年纪较大的老鼠的舌头的大小，也有助于避免了舌动脉和舌过度出血破裂。肿瘤采取的是大大提高时，舌头在初始注射部位急剧膨胀。这种肿胀消退注入流体一两个小时内被吸收。肿瘤的生长出现明显的一两个星期注射后表示注入细胞数作为一个小舌头表面上的白色凹凸。我们还注意到，在这里介绍我们的研究中使用的40X目标，我们可以不区分个别的肿瘤细胞，但也确定为侵入性的细胞团，总结头颈部鳞癌侵袭的典型模式IGS。

迄今为止，这种模式已被广泛用于特定分子的作用，以及一些抗肿瘤的药物SCOT增长入侵，疗效监测颈部淋巴结转移，采用免疫组化^或发光的方法4-7测量与测试。这个系统清单接近舌面上（图7）在肿瘤形成，使双光子显微镜的应用程序在侵入性的多细胞集群形象整个肿瘤原位。该程序也可以利用可视化与肿瘤细胞的决议的入侵。双光子显微镜先前已经利用原位^8,9和异种移植^8,10模型的头部和颈部癌症的研究试验性治疗。然而，这些报告和我们的协议之间的主要区别有两个。首先，这些研究使用外的标签，以目标/确定头部和颈部肿瘤细胞，可能限制与检测肿瘤细胞获得充足的流通。二，入侵肿瘤细胞接近到主站点，可能重演早期转移性活动是不是作为一个实验参数进行评估。我们的协议提供了在任何时候直接量化鼠标舌头肿瘤的进展过程中肿瘤细胞的侵袭能力。虽然这里介绍的方法使用解剖舌头描述的过程，我们目前在适应这种方法结合使用生物发光的活体小鼠的图像肿瘤的侵袭，同时监测早期的入侵，当地的淋巴结转移和远处转移的过程相同的动物。改建为活体成像的协议需要设计一个适当的定位阶段和维护过程中成像小鼠，以及作为一个实用的系统，以适当的灌溉口腔麻醉小鼠，在成像过程。一旦优化，这些适应化修改，将提供的学习能力，潜在的亲创分子和抗侵袭，局部浸润和更遥远的参与更长的时间内，在动物身上转移化合物的测试的作用。