Beschrijven we een low cost, high throughput methode voor het screenen op schimmels endoglucanase activiteit in<em> E. coli.</em> De methode is gebaseerd op een eenvoudige visuele uitlezing van substraat degradatie, vereist geen enzymen zuivering, en is zeer schaalbaar. Dit maakt het mogelijk om een snelle screening van grote bibliotheken van enzym varianten.
Cellulase enzymen (endoglucanasen, cellobiohydrolasen, en β-glucosidase) hydrolyseren cellulose in de component suikers, die op zijn beurt kan worden omgezet in brandstof alcoholen 1. Het potentieel voor enzymatische hydrolyse van cellulosehoudende biomassa om duurzame energie te bieden heeft op meer inspanningen om cellulasen engineer voor een economische productie van brandstoffen 2. Van bijzonder belang zijn schimmel cellulasen 3-8, die al industrieel gebruikt voor voedingsmiddelen en textiel verwerken.
Het identificeren van actieve varianten onder een bibliotheek van mutant cellulasen is cruciaal voor het engineeringproces, actief mutanten kan verder worden getest op verbeterde eigenschappen en / of onderworpen aan extra mutagenese. Efficiënte engineering van schimmel cellulasen werd belemmerd door een gebrek aan genetische tools voor inheemse organismen en door de moeilijkheden in de uiting van de enzymen in heterologe gastheer. Onlangs Morikawa en collega's ontwikkelden een methode voor het uitdrukken in E. coli de katalytische domeinen van endoglucanasen uit H. jecorina 3,9, een belangrijke industriële schimmel met de capaciteit om cellulasen in grote hoeveelheden afscheiden. Functionele E. coli expressie is ook gemeld voor cellulasen van andere schimmels, waaronder Macrophomina phaseolina 10 en Phanerochaete Chrysosporium 11-12.
We presenteren een methode voor high throughput screening van schimmels endoglucanase activiteit in E. coli. (Fig 1) Deze methode maakt gebruik van de gemeenschappelijke microbiële kleurstof Congo rood (CR) te visualiseren enzymatische afbraak van carboxymethylcellulose (CMC) door de cellen kweken op vast medium. De activiteit test vereist goedkoop reagentia, minimale manipulatie, en geeft eenduidige resultaten zones van afbraak ('halo') op de kolonie site. Hoewel een kwantitatieve meting van de enzymatische activiteit kan niet worden bepaald door deze methode, hebben we ontdekt dat Halo grootte correleert met een totale enzymatische activiteit in de cel. Verdere karakterisering van de individuele positieve klonen zal bepalen, ten opzichte van eiwitten fitness.
Traditionele bacteriële hele cel CMC / CR-activiteit assays 13 te betrekken gieten agar met CMC op kolonies, die onderworpen is aan kruisbesmetting, of incuberen culturen in CMC agar putten, die minder vatbaar is voor grootschalige experimenten. Hier hebben we melding van een verbeterde protocol dat de bestaande wassen methoden 14 voor cellulase activiteit verandert: de cellen gekweekt op CMC agar platen zijn voorafgaand aan de CR vlekken verwijderd. Ons protocol vermindert kruisbesmetting en is zeer schaalbaar, waardoor de snelle screening van duizenden klonen. Naast de H. jecorina enzymen, hebben we uitgesproken en gescreend endoglucanase varianten uit de Thermoascus aurantiacus en Penicillium decumbens (getoond in Figuur 2), wat suggereert dat dit protocol is van toepassing op enzymen uit een reeks van organismen.
Het protocol hier beschreven staat stelt snel en high throughput identificatie van actieve enzymen, met een minimum aan manipulatie. Activiteit detectie is vrij gevoelig, en kwalitatief weerspiegelt de hoeveelheid activiteit in de cel. Het gebruiksgemak maakt deze methode geschikt voor een breed scala van enzym bibliotheken, slechts beperkt door de functionele expressie in E. coli. Bovendien is de activiteit van dit soort screening niet beperkt tot schimmel cellulasen, maar kan worden aangepast voor elke endogl…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door de Gordon en Betty Moore Foundation, en door de UNCF / Merck Science Initiative.
Reagent | Company | Product number |
---|---|---|
IPTG | Sigma | I1284 |
Congo Red | Sigma | C6277 |
Carboxymethyl Cellulose | Sigma | 360384 |
NaCl | Sigma | S1679 |
Bacto-agar | BD Biosciences | 214030 |
Bioassay plates | Thermo Scientific | 240845 |