Descriviamo un basso costo, metodo elevato throughput per lo screening per l'attività endoglucanase fungine in E. coli. Il metodo si basa su una semplice lettura visiva di degradazione del substrato, non necessita di purificazione degli enzimi, ed è altamente scalabile. Questo consente lo screening rapido di grandi biblioteche di varianti dell'enzima.
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Articolo metodologico
Throughput Screening elevati di attività Endoglucanase fungine in Escherichia coli
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cellulasi enzimi (endoglucanases, cellobiohydrolases e β-glucosidasi) idrolizzare cellulosa in zuccheri componente, che a sua volta può essere convertito in alcol carburante 1. Il potenziale per idrolisi enzimatica di biomasse cellulosiche per fornire energia rinnovabile ha intensificato gli sforzi per ingegnere cellulasi per 2 economiche di produzione di combustibile. Di particolare interesse sono cellulasi fungine 3-8, che sono già in uso industriale per i cibi e la lavorazione tessile.
Identificare varianti attivo tra una libreria di cellulasi mutante è fondamentale per il processo di progettazione; mutanti attivo può essere ulteriormente testato per migliorare le proprietà e / o sottoposti a mutagenesi aggiuntivi. Ingegneria efficiente delle cellulasi fungine è stata ostacolata dalla mancanza di strumenti genetici per gli organismi nativi e dalla difficoltà di esprimere gli enzimi in ospiti eterologhi. Recentemente, Morikawa e collaboratori sviluppato un metodo per esprimere in E. coli i domini catalitici di endoglucanases da H. jecorina 3,9, un fungo importante industriale con la capacità di secernere cellulasi in grandi quantità. Funzionale E. espressione coli è stato anche segnalato per la cellulasi da altri funghi, compresi Macrophomina phaseolina 10 e Phanerochaete chrysosporium 11-12.
Vi presentiamo un metodo per lo screening ad alto rendimento di attività endoglucanase fungine in E. coli. (Fig. 1) Questo metodo utilizza il comune microbica colorante Rosso Congo (CR) per visualizzare la degradazione enzimatica della carbossimetilcellulosa (CMC) di cellule in crescita su terreno solido. Il dosaggio attività richiede reagenti poco costosi, la manipolazione minima, e dà risultati inequivocabili come zone di degrado ("aloni") sul sito colonia. Anche se una misura quantitativa di attività enzimatica non può essere determinato con questo metodo, abbiamo trovato che le dimensioni alone si correla con l'attività enzimatica totale nella cella. Un'ulteriore caratterizzazione dei singoli cloni positivi determinerà, fitness relativa proteina.
Tradizionale batterica a cellule intere, CMC / CR saggi attività 13 coinvolgere versando CMC colonie su agar contenente, che è soggetto a contaminazione incrociata, o culture incubazione in pozzetti agar CMC, che è meno suscettibile di sperimentazione su larga scala. Qui riportiamo un protocollo che modifica migliorato i metodi esistenti lavare 14 per attività cellulasi: le cellule coltivate su piastre di agar CMC sono stati rimossi prima della colorazione CR. Il nostro protocollo riduce notevolmente la contaminazione crociata ed è altamente scalabile, permettendo un rapido screening di migliaia di cloni. Oltre ad H. enzimi jecorina, abbiamo espresso e proiettato varianti endoglucanase dal aurantiacus Thermoascus e Penicillium decumbens (Figura 2), suggerendo che questo protocollo è applicabile agli enzimi da una serie di organismi.
Protocollo
1. Screening piastra preparazione
- Aggiungere 25g terreno di coltura LB, agar 15g, e 1,5 g carbossimetil cellulosa (CMC) substrato di 1L di acqua distillata, e autoclave per la sterilizzazione.
- Dopo la sterilizzazione in autoclave, permette raffreddare e aggiungere antibiotici appropriati, e IPTG ad una concentrazione finale di 100μM.
- Versare 200 mL in media ogni 5 piatti grandi Petri piazza / vassoi biologico (240 x 240 x 20mm o più grandi). Lasciare le piastre ad asciugare completamente.
2. Endoglucanase generazione biblioteca e schermo
- Generare una libreria di endoglucanase dominio catalit....
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Discussione
Il protocollo qui descritto consente una rapida identificazione e ad alta velocità di enzimi attivi, con la manipolazione minima. Rilevamento di attività è abbastanza sensibile, e riflette qualitativamente la quantità di attività all'interno della cellula. La sua facilità d'uso rende questo metodo adatto per una vasta gamma di librerie enzima, limitato solo dalla espressione funzionale in E. coli. Inoltre, lo screening attività di questo genere non è limitato a cellulasi fungine, ma può essere adattato .......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dalla Gordon and Betty Moore Foundation, e dal UNCF / Merck Iniziativa Scienza.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagente | Azienda | Prodotto numero | |
| IPTG | Sigma | I1284 | |
| Rosso Congo | Sigma | C6277 | |
| Carbossimetilcellulosa | Sigma | 360384 | |
| NaCl | Sigma | S1679 | |
| Bacto-agar | BD Biosciences | 214030 | |
| Bioassay piastre | Thermo Scientific | 240845 |
Riferimenti
- Atsumi, S., Hanai, T., Liao, J. C. Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels. Nature. 451, 86-89 (2008).
- Wilson, D. B. Cellulases and biofuels. Curr Opin Biotechnol. 20, 295-299 (2009).
- Qin, Y.
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Ristampe e permessi
