وصفنا منخفضة التكلفة ، وأسلوب إنتاجية عالية للكشف عن النشاط endoglucanase الفطرية في<em> E. القولونية.</em> الأسلوب يعتمد على قراءات بصرية بسيطة من تدهور الركيزة ، لا يتطلب تنقية الإنزيم ، وتدرجية عالية. وهذا يسمح للفحص السريع للمكتبات واسعة من المتغيرات الانزيم.
الانزيمات سلولاز (endoglucanases ، cellobiohydrolases وglucosidases β) يتحلل السيليلوز إلى سكريات عنصر ، والتي بدورها يمكن تحويلها إلى وقود الكحول 1. كثفت احتمالات الإنزيمية من الكتلة الحيوية السليلوزية لتوفير الطاقة المتجددة الجهود الرامية إلى مهندس السليلوزات اقتصادية لإنتاج وقود 2. ذات أهمية خاصة هي السليلوزات 3-8 الفطرية ، والتي هي بالفعل قيد الاستخدام الصناعي للأغذية وتجهيز المنسوجات.
تحديد المتغيرات النشطة بين مكتبة السليلوزات متحولة أمر بالغ الأهمية في عملية الهندسة ، ويمكن اختبار المزيد من المسوخ نشطة لتحسين خصائص و / أو تعرضوا لالطفرات إضافية. وقد أعاق الهندسة كفاءة السليلوزات الفطرية بسبب نقص الأدوات الوراثية للكائنات الحية المحلية والصعوبات في التعبير عن الانزيمات في يستضيف مغاير. في الآونة الأخيرة ، وضعت موريكاوا وزملاء العمل وسيلة للتعبير في E. القولونية المجالات الحفاز endoglucanases من jecorina H. 3،9 ، وهو فطر الصناعية المهمة التي لديها القدرة على إفراز السليلوزات بكميات كبيرة. وظيفية E. كما تم الإبلاغ عن التعبير القولونية السليلوزات من الفطريات الأخرى ، بما في ذلك Macrophomina phaseolina 10 و Phanerochaete ذهبية الأبواغ 11-12.
نقدم طريقة لفحص إنتاجية عالية من النشاط endoglucanase الفطرية في E. القولونية. (الشكل رقم 1) يستخدم هذا الأسلوب المشترك الميكروبية صبغ أحمر الكونغو (CR) لتصور تدهور الأنزيمية من السليلوز carboxymethyl (CMC) التي تنمو على الخلايا المتوسطة الصلبة. ويتطلب فحص النشاط الكواشف غير مكلفة ، والتلاعب الحد الأدنى ، ويعطي نتائج لا لبس فيها كمناطق التدهور ("هالات") في موقع مستعمرة. على الرغم من عدم تدبير كمية من النشاط الأنزيمي يحددها هذا الأسلوب ، وجدنا أن حجم الهالة يرتبط النشاط الأنزيمي الكلي في الخلية. وتوصيف مزيد من الحيوانات المستنسخة إيجابية تحديد الفرد ، نسبة البروتين للياقة البدنية.
البكتيرية كله نشاط الخلية المقايسات التقليدية CMC / 13 CR تنطوي صب CMC آغار تحتوي على المستعمرات ، والتي هي عرضة للتلوث العرضي ، أو الثقافات تفرخ في الآبار آغار اللجنة العسكرية المركزية ، التي هي أقل قابلية لتجارب على نطاق واسع. نحن هنا التقرير تحسن وضع بروتوكول بتعديل أساليب غسل القائمة 14 لنشاط سلولاز : تتم إزالة الخلايا المزروعة في أطباق أجار CMC قبل CR تلطيخ. بروتوكول لدينا يقلل بشكل ملحوظ عبر تلوث وتدرجية عالية ، والسماح للفحص السريع للآلاف من الحيوانات المستنسخة. بالإضافة إلى H. الانزيمات jecorina ، أعربنا عن وفرزهم من المتغيرات endoglucanase aurantiacus Thermoascus والبنسليوم decumbens (كما هو موضح في الشكل 2) ، مما يوحي بأن هذا البروتوكول تنطبق على انزيمات من مجموعة من الكائنات الحية.
بروتوكول الموصوفة هنا يمكن تحديد سرعة سريعة وعالية من الأنزيمات نشطة ، مع الحد الأدنى من التلاعب. الكشف عن نشاط حساس جدا ، ويعكس نوعيا كمية النشاط داخل الخلية. سهولة استخدامه يجعل هذه الطريقة مناسبة لمجموعة واسعة من المكتبات الانزيم ، وقلة فقط من التعبير الوظيفي في <e…
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل غوردون وبيتي مور مؤسسة ، ومبادرة العلوم UNCF / ميرك.
Reagent | Company | Product number |
---|---|---|
IPTG | Sigma | I1284 |
Congo Red | Sigma | C6277 |
Carboxymethyl Cellulose | Sigma | 360384 |
NaCl | Sigma | S1679 |
Bacto-agar | BD Biosciences | 214030 |
Bioassay plates | Thermo Scientific | 240845 |