High Throughput Screening van Fungal endoglucanase activiteit in Escherichia coli</em
Summary
Beschrijven we een low cost, high throughput methode voor het screenen op schimmels endoglucanase activiteit in<em> E. coli.</em> De methode is gebaseerd op een eenvoudige visuele uitlezing van substraat degradatie, vereist geen enzymen zuivering, en is zeer schaalbaar. Dit maakt het mogelijk om een snelle screening van grote bibliotheken van enzym varianten.
Abstract
Cellulase enzymen (endoglucanasen, cellobiohydrolasen, en β-glucosidase) hydrolyseren cellulose in de component suikers, die op zijn beurt kan worden omgezet in brandstof alcoholen 1. Het potentieel voor enzymatische hydrolyse van cellulosehoudende biomassa om duurzame energie te bieden heeft op meer inspanningen om cellulasen engineer voor een economische productie van brandstoffen 2. Van bijzonder belang zijn schimmel cellulasen 3-8, die al industrieel gebruikt voor voedingsmiddelen en textiel verwerken.
Het identificeren van actieve varianten onder een bibliotheek van mutant cellulasen is cruciaal voor het engineeringproces, actief mutanten kan verder worden getest op verbeterde eigenschappen en / of onderworpen aan extra mutagenese. Efficiënte engineering van schimmel cellulasen werd belemmerd door een gebrek aan genetische tools voor inheemse organismen en door de moeilijkheden in de uiting van de enzymen in heterologe gastheer. Onlangs Morikawa en collega's ontwikkelden een methode voor het uitdrukken in E. coli de katalytische domeinen van endoglucanasen uit H. jecorina 3,9, een belangrijke industriële schimmel met de capaciteit om cellulasen in grote hoeveelheden afscheiden. Functionele E. coli expressie is ook gemeld voor cellulasen van andere schimmels, waaronder Macrophomina phaseolina 10 en Phanerochaete Chrysosporium 11-12.
We presenteren een methode voor high throughput screening van schimmels endoglucanase activiteit in E. coli. (Fig 1) Deze methode maakt gebruik van de gemeenschappelijke microbiële kleurstof Congo rood (CR) te visualiseren enzymatische afbraak van carboxymethylcellulose (CMC) door de cellen kweken op vast medium. De activiteit test vereist goedkoop reagentia, minimale manipulatie, en geeft eenduidige resultaten zones van afbraak ('halo') op de kolonie site. Hoewel een kwantitatieve meting van de enzymatische activiteit kan niet worden bepaald door deze methode, hebben we ontdekt dat Halo grootte correleert met een totale enzymatische activiteit in de cel. Verdere karakterisering van de individuele positieve klonen zal bepalen, ten opzichte van eiwitten fitness.
Traditionele bacteriële hele cel CMC / CR-activiteit assays 13 te betrekken gieten agar met CMC op kolonies, die onderworpen is aan kruisbesmetting, of incuberen culturen in CMC agar putten, die minder vatbaar is voor grootschalige experimenten. Hier hebben we melding van een verbeterde protocol dat de bestaande wassen methoden 14 voor cellulase activiteit verandert: de cellen gekweekt op CMC agar platen zijn voorafgaand aan de CR vlekken verwijderd. Ons protocol vermindert kruisbesmetting en is zeer schaalbaar, waardoor de snelle screening van duizenden klonen. Naast de H. jecorina enzymen, hebben we uitgesproken en gescreend endoglucanase varianten uit de Thermoascus aurantiacus en Penicillium decumbens (getoond in Figuur 2), wat suggereert dat dit protocol is van toepassing op enzymen uit een reeks van organismen.
Protocol
Discussion
Het protocol hier beschreven staat stelt snel en high throughput identificatie van actieve enzymen, met een minimum aan manipulatie. Activiteit detectie is vrij gevoelig, en kwalitatief weerspiegelt de hoeveelheid activiteit in de cel. Het gebruiksgemak maakt deze methode geschikt voor een breed scala van enzym bibliotheken, slechts beperkt door de functionele expressie in E. coli. Bovendien is de activiteit van dit soort screening niet beperkt tot schimmel cellulasen, maar kan worden aangepast voor elke endogl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de Gordon en Betty Moore Foundation, en door de UNCF / Merck Science Initiative.
Materials
| Reagent | Company | Product number |
|---|---|---|
| IPTG | Sigma | I1284 |
| Congo Red | Sigma | C6277 |
| Carboxymethyl Cellulose | Sigma | 360384 |
| NaCl | Sigma | S1679 |
| Bacto-agar | BD Biosciences | 214030 |
| Bioassay plates | Thermo Scientific | 240845 |
References
- Atsumi, S., Hanai, T., Liao, J. C. Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels. Nature. 451, 86-89 (2008).
- Wilson, D. B. Cellulases and biofuels. Curr Opin Biotechnol. 20, 295-299 (2009).
- Qin, Y. Engineering endoglucanase II from Trichoderma reesei to improve the catalytic efficiency at a higher pH optimum. J Biotechnol. 135, 190-195 (2008).
- Nakazawa, H. Directed evolution of endoglucanase III (Cel12A) from Trichoderma reesei. Appl Microbiol Biotechnol. 83, 649-657 (2009).
- Heinzelman, P. A family of thermostable fungal cellulases created by structure-guided recombination. Proc Natl Acad Sci. 106, 5610-5615 (2009).
- Heinzelman, P. SCHEMA recombination of a fungal cellulase uncovers a single mutation that contributes markedly to stability. J Biol Chem. 284, 26229-26233 (2009).
- Lantz, S. E. Hypocrea jecorina CEL6A protein engineering. Biotechnol Biofuels. 8, 3-20 (2010).
- Mahadevan, S. A. Site-directed mutagenesis and CBM engineering of Cel5A (Thermotoga maritima). FEMS Microbiol Lett. 287, 205-211 (2008).
- Nakazawa, H. Characterization of the catalytic domains of Trichoderma reesei endoglucanase I, II, and III, expressed in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 81, 681-689 (2008).
- Wang, H., Jones, R. W. Properties of the Macrophomina phaseolina endoglucanase (EGL 1) gene product in bacterial and yeast expression systems. Appl Biochem Biotechnol. 81, 153-160 (1999).
- Howard, R. L. Enzyme activity of a Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase (CBHI.1) expressed as a heterologous protein from Escherichia coli. Afr J Biotechnol. 2, 296-300 (2003).
- Howard, . Characterisation of a chimeric Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase expressed from Escherichia coli. Afr J Biotechnol. 3, 349-352 (2004).
- Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Appl Env Microbiol. 43, 777-780 (1982).
- Gilkes, N. R. Mode of action and substrate specificities of cellulases from cloned bacterial genes. J Bio Chem. 259, 10455-10459 (1984).
