Summary
En metod beskrivs för att mäta biokemiska markörer för neonatal hypoxi-ischemi. Den metod som använder höga kromatografi Vätskekromatogram (HPLC) och gaskromatografi-masspektrometri (GC / MS).
Abstract
Neonatal hypoxi ischemi kännetecknas av otillräcklig blod perfusion av en vävnad eller en systemisk syrebrist. Detta villkor är tänkt att orsaka / förvärra väl dokumenterade neonatala sjukdomar, inklusive neurologisk försämring 1-3. Minskad adenosintrifosfat produktionen uppstår på grund av brist på oxidativ fosforylering. För att kompensera detta berövas molekyler energitillstånd med hög obligationer energi fosfat bryts ned 2. Detta leder till ökade nivåer av adenosin, som därefter bryts ned till inosin, hypoxantin, xantin, och slutligen till urinsyra. De två sista stegen i denna nedbrytande process utförs av xantin oxidoreductase. Detta enzym finns i form av xantin dehydrogenas i normoxic förhållanden men omvandlas till xantinoxidas (XO) under hypoxi-reperfusion omständigheter 4, 5. Till skillnad från xantin dehydrogenas, genererar XO väteperoxid som en biprodukt av purin nedbrytning 4, 6. Detta väteperoxid i kombination med andra reaktiva syreradikaler (ROS) som produceras under hypoxi, oxiderar urinsyra att bilda allantoin och reagerar med lipid membraner att generera malondialdehyd (MDA) 7-9. De flesta däggdjur, människan undantagna, har enzymet uricase, som omvandlar urinsyra till allantoin. Hos människa kan dock allantoin endast bildas av ROS-medierad oxidation av urinsyra. På grund av detta är allantoin anses vara en markör för oxidativ stress hos människor, men inte i däggdjur som har uricase.
Vi beskriver metoder för att anställa högt kromatografi Vätskekromatogram (HPLC) och gaskromatografi masspektrometri (GCMS) för att mäta biokemiska markörer av neonatal hypoxi ischemi. Människoblod används för de flesta tester. Djurens blod kan också användas samtidigt som potentialen för uricase genererade allantoin. Purin metaboliter var kopplade till hypoxi så tidigt som 1963 och tillförlitligheten på hypoxantin, xantin och urinsyra som biokemiska indikatorer på neonatal hypoxi bekräftades av flera utredare 10-13. HPLC-metod som används för kvantifiering av purin föreningar är snabb, pålitlig och reproducerbar. GC / MS-metod för kvantifiering av allantoin, en relativt ny markör för oxidativ stress, var anpassad från Gruber et al 7. Denna metod undviker vissa artefakter och kräver små mängder av provet. Metoder som används för syntes av MMDA beskrevs någon annanstans 14, 15. GC / MS kvantifiering av MDA anpassades från Paroni et al. och Cighetti et al. 16, 17. Xantinoxidas aktivitet mättes med HPLC genom att kvantifiera omvandlingen av pterin till isoxanthopterin 18. Detta tillvägagångssätt visade sig vara tillräckligt känsligt och reproducerbar.
Protocol
1. Provtagning och bearbetning
- Samla blodprov i en 6 ml K3E EDTA K3 tub som hålls på is.
- Inom 2 minuter för insamling, centrifugera provet vid 4 ° C vid 1500 g under 10 minuter.
- Överför supernatanten (plasma) till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Centrifugera vid 4 ° C vid 18 tusen gi 30 min.
- Avlägsna supernatanten alikvoter och överföra dem i separata mikrocentrifugrör för purin (200μl), allantoin (50μl), MDA (100μl) och XO (120μl) analys. Var noga med att inte förorena prover med röda blodkroppar. Du kan behöva justera mängden plasma för MDA, XO och puriner baserat på den totala volymen av plasma som finns.
2. Förbereda intern standard, 2-Aminopurine (2-AP), för purin och XO Analys
- Väg upp 0.01351g 2-AP och lägga till det 8ml av vatten som har försurade med 2-5 droppar HCl. Om 2-AP inte löser du behöver lägga mer syra. Justera den slutliga volymen till 10 ml.
- Använd UV-Vis spektrofotometer för att fastställa verkliga koncentrationen hos ditt lager 2-AP lösning. (Λmax 315, ε 4000).
- När koncentrationen av beståndet 2-AP lösningen bestäms, beräkna de volymer som krävs för att innehålla 1x10 -7 mol 2-AP intern standard för purin mätningar och 1x10 -8 mol 2-AP intern standard för XO mätningar.
- Alikvotera den beräknade volymer i separata mikrocentrifugrör och indunsta till torrhet i en SpeedVac.
Ekvation 1: 
Ekvation 2: 
3. HPLC Mätning av purines
- Överföring plasma (200μl) till en Microcon YM-10 centrifugal filterapparat och centrifugera vid 4 ° C vid 14 tusen g för 1,5 timmar.
- Ta bort filtratet och överför till en mikrocentrifugrör innehåller 1x10 -7 mol 2-AP. Var noga med att registrera volym filtrat läggs till mikrocentrifugrör som innehåller 2-AP. Vortex proverna i 10-20 sek.
- Analysera prov med en HPLC. Tre 50 l injektioner används för varje prov. Prover sprutas in i ett Supelcosil LC-18-S, 15 cm x 4,6 mm, 5 ìm kolumn utrustad med en Supelguard LC-18-S kolumnen vakt. Lutningen villkor som beskrivs i tabell 1 bör användas för att få lämplig topp separation: lösningsmedel A-vatten, lösningsmedel B-metanol, lösningsmedel C-50mm ammonium formiat buffert, pH 5,5.
| Tid | Flöde (ml / min) | % A | % B | % C | |
| 1 | 1,00 | 0,0 | 0,0 | 100,0 | |
| 2 | 16,00 | 1,00 | 0,0 | 0,0 | 100,0 |
| 3 | 17,00 | 1,00 | 100,0 | 0,0 | 0,0 |
| 4 | 22,00 | 1,00 | 100,0 | 0,0 | 0,0 |
| 5 | 27,00 | 1,00 | 0,0 | 100,0 | 0,0 |
| 6 | 32,00 | 1,00 | 0,0 | 100,0 | 0,0 |
| 7 | 33,00 | 1,00 | 100,0 | 0,0 | 0,0 |
| 8 | 38,00 | 1,00 | 100,0 | 0,0 | 0,0 |
| 9 | 39,00 | 1,00 | 0,0 | 0,0 | 100,0 |
| 10 | 45,00 | 1,00 | 0,0 | 0,0 | 100,0 |
Tabell 1. Lösningsmedel förändringar för HPLC mätning av purin föreningar.
- Bestäm koncentrationen av purines i provet. Kvantifiera hypoxantin, xantin och urinsyra genom att få toppareor på bevarande och våglängder som beskrivs i tabell 2. Bestäm toppytan av 2-AP. Bestäm areaförhållanden på hypoxantin, xantin och urinsyra till 2-AP och konvertera nyckeltal för att μmolar koncentrationer med standard kurvor.
| Uppehållstid * | Observerade λ max * | Rapporterade λ max 19 | Rapporterade ε max 19 | |
| URIN-Acid | ~ 3,5 min | 288 | 283 [2] | 11.500 [2] |
| Hypoxantin | ~ 7,0 min | 248 | 248 [1] | 10.800 [1] |
| Xanthine | ~ 9,5 min | 267 | 267 [2] | 10.200 [2] |
| 2-Aminopurine | ~ 12,5 min | 305 | 314 [2] | 4000 [2] |
Tabell 2. Typiska retentionstiderna och λ max för puriner och intern standard. * Bestäms på HPLC med isokratisk 50 mM buffert ammonium formiat (pH 5,5) med ett flöde 1mL/min. pH är [].
- Analysera alla prover i tre exemplar, men bara innehåller värden för senare analyser om variationskoefficienten är mindre än 10%.
4. GC / MS Mätning av Allantoin
- Lägg 50μl 10μM DL-Allantoin-5-13 C, 1 - 15 N (intern standard) till 50 l plasma som avsatts för allantoin analysen under provtagning och bearbetning.
- Tillsätt 100 l acetonitril till denna plasma lösning.
- Vortexa blandningen i 10-20 sek centrifugera därefter vid 4 ° C på 20.000 gi 10 min.
- Avlägsna supernatanten, placera den i ett GC / MS flaskan och torka under N 2.
- Efter torkning, tillsätt 50 ìl derivatizing agent N-tert-Butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoroacetamide (MTBSTFA) i pyridin (1:1 vol / vol), mössa rören och inkubera dem vid 50 ° C i 2 h. Detta derivatisering ger genomgående kvantifierbara m / z toppar 398,0 och 400,0 för allantoin och DL-allantoin-5-13 C, 1 - 15 N respektive 20.
- Analysera prover på Agilent Technologies GC 6890N och MS 5973 utrustad med en automatisk provtagare. Utför sammansatta åtskilda på ett Agilent 122-5532G kapillärkolonn (25.7m längd, 0,25 mm innerdiameter). Använd helium som bärgas med en flödeshastighet av 1,5 ml / min. Injicera derivatiserade produkt (1 l) i delat läge (delningsfaktorn 20:01, dela flödet 29,4 ml / min, totalt flöde 33,8 ml / min). Ställ in den första kolumnen temperaturen vid 100 ° C och håll denna temperatur i 2 minuter för att sedan öka den till 180 ° C med en hastighet på 10 ° C / min. Håll temperaturen i 4 min och sedan öka den till 260 ° C vid en hastighet av 20 ° C / min. Behåll denna temperatur tills slutet av loppet. Efter varje prov, rengör kolumn med två injektioner av hexan.
- Kvantifiera allantoin använder välja läge jon övervakning medan övervakningen av 398,0 m / z-jon för allantoin och 400,0 m / z-jon för DL-allantoin-5-13 C, 1 - 15 N. Konvertera ion överflöd förhållandet mellan allantoin / (tung allantoin) till mikromolära koncentrationer av allantoin med hjälp av en förberedd standardkurvan.
- Alla prover analyseras i tre exemplar, men endast värden med en variationskoefficient mindre än 10% används i vidare analyser.
5. Förbereda intern standard, Metyl malondialdehyd (MMDA), för MDA analys
- Tillsätt 523μl 3-ethoxymethacrolein att 1477μl 7M NaOH i en 100 ml rund botten kolv. Lägg till en stirbar.
- Placera kolven i ett vattenbad vid 45 ° C och rör tills reaktionen har gått till färdigställande. Detta bör ta ca 140 min. Följa hur reaktionen genom att ta bort ett 10μl alikvot av vätskan med jämna mellanrum med 10 min mellanrum. Späd varje prov som samlas in med en faktor 10 5 med 50 mM buffert kaliumfosfat (pH 7) och mätning av absorbansen med UV-Vis. När absorbansen vid 275nm når ungefär 0,658 reaktionen är klar. Som reaktion fortskrider kommer lösningen bli gul då orange.
- Låt reaktionen framsteg för ytterligare 15 min.
- Tillsätt 5 ml destillerat avjoniserat vatten till rund botten kolv och överför lösningen till en separationstratt. Använda ytterligare 3 ml vatten för att tvätta kolven in i kanalen. Lägg till ytterligare 2 ml vatten för att tratten.
- Extrahera lösning 3 gånger med 5 ml diklormetan. Efter varje extraktion slänga det organiska skiktet.
- Efter den tredje utvinning, Överför vattenskiktet till en rund botten kolv och rotovap till torrhet.
- Resuspendera produkten i 3 ml etanol och överför till en pre-vägs 15ml koniska rör. Skölj kolven med ytterligare 2 ml etanol och tillsätt skölj i koniska röret.
- Tillsätt 5ml bensen och inkubera röret i varmt vatten tills produkten löses sedan omedelbart placera röret på is i 10 min. Centrifugera i 5 min vid 15000 g och avlägsna supernatanten.
- Tillsätt 5ml etanol och 5 ml isopropyl etern till nederbörditant. Lös fällningsmedel genom att inkubera röret i varmt vatten och regelbundet luta röret mycket försiktigt. När fällning löses upp, placera röret på is i 10 min. Utför denna omkristallisering 2 gånger med etanol och isopropylalkohol eter. Vissa olösliga vita bitar av produkten kan bildas.
- Efter sista omkristallisering steget bort så mycket supernatanten som möjligt och torka den resulterande produkten i en Speedvac. Väg koniska röret med syntetiserade produkten.
- Tillsätt 5 ml vatten till röret, virvel, och filtrera bort eventuella återstående torrsubstans.
- Använd UV-VIS spektrofotometer för att fastställa den slutliga koncentrationen MMDA. Den λmax för MMDA i 50 mm kalium fosfatbuffert (pH 7) är 274 nm med extinktionskoefficienten för 29.900 M -1 cm -1 14.
6. GC / MS Mätning av MDA
- Bered en lösning av 0,5 mm butylerad hydroxyl toluen (BTH) i etanol genom att lägga till 0,11 g BTH till 9 ml etanol och justera den slutliga volymen till 10 ml. Utför sedan en utspädning genom att lägga 10μl av koncentrerad lösning 990μl etanol.
- Bered en lösning av 50 mM fenyl hydrazin genom att lägga 4.92μl av Phenyl hydrazin till 995μl vatten i en mörk mikrocentrifugrör. Vortex lösningen.
- Lägg 5μl 10μM MMDA till 100μl plasma som avsatts för MDA-analysen under provtagning och bearbetning.
- Tillsätt sedan 10μl 0,5 mm BTH till MMDA / plasma blandning följt av tillsats av 200μl 1M natriumcitrat vid pH 4. Denna pH är avgörande för korrekt derivatisering av provet. En högre eller lägre pH kommer att resultera i skeva MDA nivåer.
- Späd den slutliga blandningen genom att tillsätta destillerat avjoniserat vatten till en slutlig volym av 480μl.
- Derivatize lösningen genom att tillsätta 20μl 50 mM fenyl hydrazin, tak rören och ruva lösning vid 25 ° C i 30 min på en skakapparat.
- Tillsätt 1 ml hexan, virvel under 1 minut och centrifugera vid 3000 rpm i 10 min.
- Överför det organiska skiktet en GC / MS flaskan och koncentrera lösningen på 100μl av N 2 ström.
- Analysera prover på en GC / MS med den automatiska provtagaren. Utför sammansatta åtskilda på ett Agilent 122-5532G kapillärkolonn (25,7 m längd, 0,25 mm innerdiameter). Använd helium som bärgas med en flödeshastighet på 0,6-0,8 ml / min. Injicera derivatiserade produkt (2 l) i delat läge (delningsfaktorn 20:01, dela flödet 23,0 ml / min, totalt flöde 27,1 ml / min). Ställ in den första kolumnen temperaturen vid 110 ° C och håll denna temperatur under 1 minut för att sedan öka den till 250 ° C med en hastighet på 40 ° C / min. Behåll denna temperatur tills slutet av loppet. Efter varje prov, rengör kolumn med två injektioner av hexan.
- Kvantifiera MDA använder välja läge jon övervakning med 144,00 m / z för MDA och 158,00 m / z för MMDA. Konvertera MDA / MMDA jon överflöd nyckeltal som mikromolära koncentrationer med en vanlig kurva.
- Analysera prover i tre exemplar och endast använda värden med en variationskoefficient mindre än 10%.
7. HPLC Mätning av xantinoxidas
- Upptäckten av xantinoxidas funktion är beroende av möjligheten att känsligt mäta nivån av ett lämpligt substrat (pterin) samt dess produkt (isoxanthopterin). Plasma inkuberas med substrat antingen för 0 min (kontroll) eller i 4 h, och inkuberingen beroende substrat till produkt konvertering bestäms.
- Lägg 240μl 0,2 M Tris-HCl buffert (pH 9,0) och 4.63μl 7.083x10 -3 M pterin till varje rör (0 och 4 timmar) och preincubate dem vid 37 ° C i 5 min.
- Initiera enzymet reaktionen genom att tillsätta 60μl av plasma till varje rör.
- Omedelbart lägga 300μl 4% HClO 4 till kontroll röret (0 min) men tillåter den andra blandningen inkubera 4 timmar innan härdning reaktionen med 300μl 4% HClO 4.
- Efter tillsats av HClO 4, Skaka röret och centrifugera sedan vid 4 ° C vid 15000 g under 15 min.
- Avlägsna 500μl av supernatanten och neutralisera genom att lägga 20μl av 5M K 2 CO 3. Skaka röret och centrifugera sedan vid 4 ° C vid 15000 g under 15 min.
- Tillsätt 350μl av neutraliserad lösning till ett mikrocentrifugrör innehåller 1x10 -8 mol 2-AP.
- Analysera prover på en HPLC försedd med en skanning fluorescens detektor. Tre 50 l injektioner används för varje prov. Prover kommer att sprutas in i ett Wacosil 5C-18-200 250 mm x 6,0 mm, 5 ìm kolumn utrustad med en Supelguard LC-18-S kolumnen vakt. Följande isokratisk villkor bör användas för att få lämplig topp separeras och identifieras: 95% 20mm KPO 4 buffert (pH 2,2) och 5% metanol med en flödeshastighet 1ml/min. Ställ excitationsvåglängden för fluorescens detektorn på 345 nm och utsläpp vågenlängd vid 410 nm.
- Bestäm förhållandet mellan pterine och isoxanthopterine till 2-AP genom att få toppareor från fluorescens detektor spektrumet. Den första toppen i spektrumet, ~ 5 minuter, motsvarar 2-AP. Den andra och största topp kommer att pterine. Isoxanthopterine topp eluerar sist.
- Skaffa skillnaden i isoxanthopterine/2-AP nyckeltal topp området mellan 0 och 4 h inkubering punkter tid. Använd detta värde för att beräkna XO aktiviteten från standard kurvor.
- Analysera prover i tre exemplar, men använder endast värden med en variationskoefficient mindre än 10%.
8. Representativa resultat:
Ett exempel på HPLC kvantifiering av purin föreningar visas i Figur 1A. De specifika retentionstiderna och våglängder utsläpp av hypoxantin, xantin och urinsyra tillåter samtidig kvantifiering av purin ämnen (tabell 2). När analysen är att fungera korrekt, kommer de föreningar tillräckligt avskilda och toppen formen kommer att vara skarp och unimodal. Dessa toppar omvandlas sedan till koncentration, områden som visas i tabell 3, genom användning av standard kurvor. Eftersom prov behandling för denna analys är minimal, skulle den enda urval som byggde problem som kan uppstå vara lysering av röda blodkroppar. Om de röda blodkropparna lyseras innan proverna centrifugeras, kommer plasma ta på en orange / röd färg och kan inte användas för att utvärdera hypoxisk ischemi. De andra frågor som kan uppstå vid mätning purines innebär HPLC-systemet och kolumn (Figur 1B). Om det finns luftbubblor i HPLC-systemet retentionstiderna kommer att flytta och HPLC trycket kommer att fluktuera kraftigt. Om vakten patronen behöver bytas, kommer trycket att öka och toppar kommer att öka och bli bi-eller tri-modal.
| Hypoxantin (M) | Xanthine (M) | Urinsyra (M) | Xantinoxidas ((nmol produkt) / min) | Malondialdehyd (M) | Allantoin (M) | |
| Term Normoxic | 1.13-19.3 (64) | 0.02-3.69 (61) | 107.20-726.12 (63) | 2.47x10 -6 - 3.92x10 -3 (20) | 0.44-3.76 (53) | NA |
| Term andnödssyndrom | 1.78-12.59 (27) | 0.07-11.8 (24) | 225.40-653.32 (27) | 0 - 1.03x10 -5 (8) | 0.82-2.73 (24) | NA |
| Term hypoxisk | 0.38-31.80 (13) | 0.11-2.88 (13) | 235.65-1348.13 (13) | 1.20x10 -5 -236,44 (9) | 0.95-2.15 (7) | NA |
| Prematura Normoxic | 1.54-4.39 (9) | 0.03-1.77 (9) | 178.92-593.49 (9) | 2.46x10 -5 - 5.44x10 -4 (2) | 0.95-2.74 (8) | 2.30-5.26 (67) |
| Prematura andnödssyndrom | 3.04-8.04 (2) | NA | 327.56-365.11 (2) | NA | 2.40-3.46 (3) | NA |
Min-Max (n)
Tabell 3. Representant intervall för puriner, xantinoxidas, malondialdehyd och allantoin.
Ett exempel på GC / MS kvantifiering av Allantoin visas i Figur 2. Eftersom massan av derivitized allantoin och derivitized tunga allantoin är känd, välj jon-läget kan användas för att identifiera dessa föreningar på massan spec. Om analysen görs korrekt, kommer två toppar observeras vid samma retentionstid. Ett motsvarande allantoin (398,00 m / z) och den andra till tunga allantoin (400,00 m / z). Dessa toppar omvandlas sedan till koncentration, områden som visas i tabell 3, med hjälp av en standardkurva. Om analysen körs felaktigt, och proverna var inte derivitized ordentligt kan topparna inte vara närvarande eller inte får kvantitativt representativt. Återigen, om de röda blodkropparna lyseras plasma inte kan användas för att utvärdera oxidativ stress hos neonatala hypoxiska ischemi.
Resultaten för kvantifiering av MDA liknar dem för allantoin med undantaget att de två toppar observeras vid olika lagringstider. Vid ~ 3,5 minuter retentionstid, en 144,00 m / z topp för MDA och vid ~ 4 minuter uppehållstid är en 158,00 m / z topp för MMDA observerade (Figur 3). Dessa toppar omvandlas sedan till koncentration, områden som visas i tabell 3, med hjälp av en standardkurva. Om analysen körs felaktigt eller prover inte derivitized ordentligt, får inga toppar observeras när man väljer för 144.00m / z och 158.00m / Z. Det bör noteras attOm det finns ett överskott av fett i plasma från bolus muntliga matning eller intravenös lipid administrationen kommer plasma ta ett mjölkaktigt utseende och kan inte användas för att utvärdera oxidativ stress hos neonatala hypoxiska ischemi.
Ett exempel på HPLC-baserade kvantifiering av xantinoxidas funktionen visas i Figur 4. Om analysen är att fungera korrekt, bör tre toppar observeras med fluorescerande detektor, en för pterin, en för isoxanthopterin, och ett för 2-AP. Dessa toppar omvandlas sedan till koncentration, områden som visas i tabell 3, med hjälp av en standardkurva. Det bör också finnas en topp som motsvarar isoxanthopterin och 2-AP på spektrum som genereras från PDA detektorn. Om enzymaktiviteten är frånvarande, kommer den topp som motsvarar isoxanthopterin inte ses. Eftersom denna analys mäter enzymet funktion, upprepad frysning och upptining av provet kan förändra detta.
Figur 1. HPLC-spektrum för identifiering av purin föreningar. A). Representativa resultat om analysen var att fungera korrekt. B). representativa resultat om det finns ett problem med HPLC, kolumnen eller vakt patron.
Figur 2. GC / MS spektrum för kvantifiering av Allantoin. Toppen vid jon 398,00 m / z motsvarar allantoin. Toppen vid jon 400,00 m / z motsvarar tunga allantoin.
Figur 3. GC / MS spektrum för kvantifiering av MDA. Toppen vid jon 144,00 m / z motsvarar MDA. Toppen vid jon 158,00 m / z motsvarar MMDA.
Figur 4. HPLC-spektrum för mätning av XO aktivitet. A) representativa resultat för 0 min inkubationstiden och B) resultat representant för 4 timmars inkubationstid. Notera högre isoxanthopterine toppen (på ~ 17 min) för 4 timmars inkubationstid. I fluorescens spektrumet eluerar 2-AP först på ~ 5min och pterine eluerar nästa på ~ 10min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De metoder som beskrivs här möjliggöra en utvärdering av neonatal hypoxi ischemi. Detta protokoll kombinerar mätning av markörer för energi (ATP) deprivation, oxidativ stress, oxidativ skada och enzymaktivitet att få en övergripande biokemiska bild av förekomsten eller graden av hypoxisk ischemi. Trots nyttan av denna metod, det finns potentiella begränsningar. För det första tar det ungefär 1-2 ml blod för att samla tillräckligt plasma att köra alla analyser. Detta kommer inte vara ett problem hos vuxna eller barn, men det blir ett problem när man arbetar med nyfödda barn, speciellt de som är för tidigt. Vi kan lösa problemet genom att prioritera analyser och späda några av de prover om det behövs andra kan det vara svårt att syntetisera MMDA,. Men deuterated MDA kan användas som ett substitut för MMDA som en intern standard.
Trots dessa begränsningar beskrivs de metoder som ger ett användbart verktyg för att utvärdera neonatal hypoxi ischemi samt andra sjukdomar förknippade med obalanserade redox homeostas. Dessutom kan alla dessa markörer, med undantag för XO, mätas i urinen, vilket ger en icke-invasiv sätt att övervaka nyfödda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete finansieras av National Institutes of Health R01 NR011209-03
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6ml K3E EDTA K3 tube | Fisher Scientific | 2204061 | |
| 5702R centrifuge | Fisher Scientific | 05413319 | With 13&16MM adaptor |
| 1.5ml microcentrifuge tube | USA Scientific, Inc. | 1615-5599 | |
| 2-Aminopurine | Sigma-Aldrich | A3509 | |
| Varian Cary 100 spectrophotometer | Agilent Technologies | 0010071500 | |
| Savant SpeedVac | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SC210A-115 | |
| Micron centrifugal filter device | Fisher Scientific | UFC501596 | |
| Supelcosil LC-18-S Column | Sigma-Aldrich | 58931 | |
| Supelcosil LC-18-S Supelguard cartridge and holder | Sigma-Aldrich | 59629 | |
| HPLC | Waters | ||
| GCMS Vial | Fisher Scientific | 03376607 | |
| DL-Allantoin-5-13C;1-15N | CDN Isotopes | M-2307 | Lot #L340P9 |
| MTBSTFA | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 48920 | |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | |
| 5973E GC/MSD | Agilent Technologies | G7021A | Part # for 5975E GC/MS |
| 3-Ethoxymethacrolein | Sigma-Aldrich | 232548 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Benzene | Sigma-Aldrich | 401765 | |
| Diisopropyl ether | Sigma-Aldrich | 38270 | |
| BHT | Sigma-Aldrich | B1378 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Phenylhydrazine | Sigma-Aldrich | P26252 |
References
- Harkness, R. A., Whitelaw, A. G., Simmonds, R. J. Intrapartum hypoxia: the association between neurological assessment of damage and abnormal excretion of ATP metabolites. J Clin Pathol. 35, 999-1007 (1982).
- Shalak, L., Perlman, J. M. Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant-current concepts. Early Hum Dev. 80, 125-141 (2004).
- Webster, W. S., Abela, D.
- Engerson, T. D., McKelvey, T. G., Rhyne, D. B., Boggio, E. B., Snyder, S. J., Jones, H. P. Conversion of xanthine dehydrogenase to oxidase in ischemic rat tissues. J Clin Invest. 79, 1564-1570 (1987).
- Choi, E. Y., Stockert, A. L., Leimkuhler, S., Hille, R. Studies on the mechanism of action of xanthine oxidase. J Inorg Biochem. 98, 841-848 (2004).
- Godber, B. L., Schwarz, G., Mendel, R. R., Lowe, D. J., Bray, R. C., Eisenthal, R. Molecular characterization of human xanthine oxidoreductase: the enzyme is grossly deficient in molybdenum and substantially deficient in iron-sulphur centres. Biochem J. 388, 501-508 (2005).
- Gruber, J., Tang, S. Y., Jenner, A. M., Mudway, I., Blomberg, A., Behndig, A. Allantoin in human plasma, serum, and nasal-lining fluids as a biomarker of oxidative stress: avoiding artifacts and establishing real in vivo concentrations. Antioxid Redox Signal. 11, 1767-1776 (2009).
- Zitnanova, I., Korytar, P., Aruoma, O. I., Sustrova, M., Garaiova, I., Muchova, J. Uric acid and allantoin levels in Down syndrome: antioxidant and oxidative stress mechanisms? Clin Chim Acta. 341, 139-146 (2004).
- Siciarz, A., Weinberger, B., Witz, G., Hiatt, M., Hegyi, T. Urinary thiobarbituric acid-reacting substances as potential biomarkers of intrauterine hypoxia. Arch Pediatr Adolesc Med. 155, 718-722 (2001).
- Buonocore, G., Perrone, S., Longini, M., Terzuoli, L., Bracci, R. Total hydroperoxide and advanced oxidation protein products in preterm hypoxic babies. Pediatr Res. 47, 221-224 (2000).
- Berne, R. M. Cardiac nucleotides in hypoxia: possible role in regulation of coronary blood flow. Am J Physiol. 204, 317-322 (1963).
- Harkness, R. A., Lund, R. J. Cerebrospinal fluid concentrations of hypoxanthine, xanthine, uridine and inosine: high concentrations of the ATP metabolite, hypoxanthine, after hypoxia. J Clin Pathol. 36, 1-8 (1983).
- Plank, M. S., Boskovic, D. S., Sowers, L. C., Angeles, D. M.
- Cighetti, G., Allevi, P., Anastasia, L., Bortone, L., Paroni, R. Use of methyl malondialdehyde as an internal standard for malondialdehyde detection: validation by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry. Clin Chem. 48, 2266-2269 (2002).
- Paroni, R., Fermo, I., Cighetti, G. Validation of methyl malondialdehyde as internal standard for malondialdehyde detection by capillary electrophoresis. Anal Biochem. 307, 92-98 (2002).
- Cighetti, G., Debiasi, S., Ciuffreda, P., Allevi, P. Beta-ethoxyacrolein contamination increases malondialdehyde inhibition of milk xanthine oxidase activity. Free Radic Biol Med. 25, 818-825 (1998).
- Cighetti, G., Debiasi, S., Paroni, R., Allevi, P. Free and total malondialdehyde assessment in biological matrices by gas chromatography-mass spectrometry: what is needed for an accurate detection. Anal Biochem. 266, 222-229 (1999).
- Yamamoto, T., Moriwaki, Y., Takahashi, S., Tsutsumi, Z., Yamakita, J., Nasako, Y. Determination of human plasma xanthine oxidase activity by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B Biomed Appl. 681, 395-400 (1996).
- Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. Fasman, G. , 3 ed, CRC Press. Boca Raton. (1988).
- Chen, X. B., Calder, A. G., Prasitkusol, P., Kyle, D. J., Jayasuriya, M. C. Determination of 15N isotopic enrichment and concentrations of allantoin and uric acid in urine by gas chromatography/mass spectrometry. J Mass Spectrom. 33, 130-137 (1998).
