Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تضخيم وقياس HIV - 1 الحمض النووي الريبي في الأفراد المصابين بالايدز مع الأحمال الفيروسية أقل من الحد كشفها بواسطة فحوصات السريرية القياسية

Published: September 26, 2011 doi: 10.3791/2960
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 3
1The virology Core at the HIV Drug Resistance Program, NCI-Frederick, 2Division of Infectious Diseases, University of Pittsburgh, 3Department of Molecular Biology and Microbiology, Tuffts University

Summary

قياس مستويات HIV - 1 الحمض النووي الريبي في البلازما وتسلسل واحد HIV - 1 من الجينوم الفيروسي مع الاحمال الأفراد أقل من الحد من الكشف (50-75 نسخة / مل) هو أمر صعب. نحن هنا تصف كيفية استخراج وتحديد الحمض النووي الريبي البلازما الفيروسية باستخدام PCR الوقت الحقيقي مقايسة أن التدابير موثوق HIV - 1 RNA الى 0.3 نسخة / مل ، وكيف لتضخيم الجينوم الفيروسي بواسطة تسلسل الجينوم واحدة ، من العينات مع الأحمال الفيروسية منخفضة جدا.

Abstract

تضخيم الجينات الفيروسية وقياس HIV - 1 الحمض النووي الريبي في الأفراد المصابين HIV - 1 مع الأحمال الفيروسية أقل من الحد من الكشف عن طريق فحوصات قياسية (50-75 أدناه نسخة / مل) ضروري لاكتساب المعرفة لديناميات الفيروسية والتفاعلات المضيف الفيروس لدى المرضى الذين بطبيعة الحال السيطرة على العدوى وأولئك الذين هم على العلاج المضاد للفيروسات الجمع (سلة).

نحن هنا تصف كيفية تضخيم الجينوم الفيروسي بواسطة تسلسل الجينوم واحد (بروتوكول SGS) 13 و 19 و كيفية تحديد بدقة HIV - 1 الحمض النووي الريبي في المرضى الذين يعانون من انخفاض الأحمال الفيروسية (في نسخة واحدة الرزن (SCA) بروتوكول) 12 ، 20.

وفحص واحد هو نسخة فحص PCR في الوقت الحقيقي مع حساسية اعتمادا على حجم يجري يعاير البلازما. إذا تم الكشف عن جينوم فيروس واحد في 7 مل من البلازما ، ثم يذكر أن عدد نسخ الحمض النووي الريبي لتكون 0.3 نسخة / مل. في مقايسة لديه اختبار الرقابة الداخلية للكفاءة استخراج الحمض النووي الريبي ، وضوابط لتضخيم محتمل من الحمض النووي أو التلوث. ويتم قياس عينات المرضى في ثلاث نسخ.

في واحد تسلسل الجينوم مقايسة (SGS) ، والآن تستخدم على نطاق واسع والتي تعتبر غير العمل المكثف 3 ، 7 ، 12 ، 14 ، 15 ، هو التخفيف مقايسة الحد ، في النهاية المخفف الذي ينتشر أكثر من منتج [كدنا] بئر - 96 لوحة. وفقا لتوزيع بواسون ، عندما يكون أقل من 1 / 3 من الآبار تعطي المنتج ، وهناك فرصة بنسبة 80 ٪ من الناتج منتج PCR يجري من تضخيم من [كدنا] جزيء واحد. اس جي اس لديه ميزة على استنساخ عدم التعرض للاختزال وعدم التحيز من قبل PCR - قدم تأشب 19. ومع ذلك ، فإن نجاح التضخيم من هيئة السلع التموينية وSGS تعتمد على التصميم التمهيدي. وقد وضعت على حد سواء المقايسات للفيروس B - 1 النوع الفرعي ، ولكن يمكن تكييفها لفرعية أخرى ومناطق أخرى من الخريطة الوراثية البشرية من قبل الاشعال المتغيرة ، وتحقيقات ، والمعايير.

Protocol

1. استخراج الحمض النووي الريبي من كميات كبيرة من البلازما

وتقدم عرضا عاما للمقايسة نسخة واحدة (SCA) ، وبروتوكول واحد تسلسل الجينوم (SGS) في أرقام 1 و 2.

  1. للحصول على 7 مل من البلازما ، وتدور حوالي 14 مل من الدم الذي تم جمعه في EDTA 15 مل (وليس الهيبارين) في أنابيب جمع XG 2600 لمدة 15 دقيقة بدون الكبح. ماصة البلازما (مع التأكد من تجنب طبقة معطف الشهباء) إلى 15 مل أنابيب.
  2. إذا كان يتم استخراج الحمض النووي الريبي لفحص نسخة واحدة (SCA) ، مع ارتفاع في البلازما 30،000 نسخة من فيروس الورم اللحمي الروس السيطرة الفيريون الداخلية (RCAS). مستعدة للفيروس RCAS قبل أداء هيئة السلع التموينية كما هو موضح سابقا (20). باختصار ، هو كميا RCAS الفيروس من خلية ثقافة طاف حسب النشاط RT ، المخفف إلى التركيز النهائي لل30000 virions لكل 200 UL ، مخففة في وسائل الإعلام RPMI زراعة الأنسجة مع FBS 5 ٪ ، وتخزينها في -80 درجة مئوية في aliquots استخدام مرة واحدة. لا ينبغي أن يكون الفيروس RCAS المجمدة / إذابة قبل استخدامها في الفحص. وارتفعت في البلازما RCAS المريض للسيطرة على كفاءة استخراج الحمض النووي الريبي ودقة القياس الكمي PCR. ويمكن الاطلاع على مزيد من المعلومات حول RCAS على الرابط التالي : http://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/ .
  3. "تمهيدي تدور" البلازما ، في 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية ، في 2600 x ج لمدة 15 دقيقة لفصل أي الدهون والحطام الخلوية ، التي يمكن أن تتداخل مع الكمي RNA دقيقة.
  4. تسمية أنابيب الطرد المركزي سيتون سهلة مع ختم علامة دائمة لتحديد عدد العينات والمكان الذي سيشكل بيليه في الأنبوب. بعد زيادة ونقصان قبل ، ونقل البلازما إلى أنابيب الطرد المركزي سيتون سهلة ختم pipetting بواسطة البلازما وتجنب أي حطام الخلوية و / أو الدهون على السطح. سجل حجم المدخلات من البلازما.
  5. إضافة تريس - مخزنة المالحة (TBS) لملء ما تبقى من حجم الأنبوب ختم سيتون السهلة إلى أسفل الرقبة مترابطة. تأكد من أن لا وجود فقاعات في أنبوب أو أنابيب ستنهار في نابذة فائقة السرعة. تأكد من أن علامة على أنابيب تواجه الخارج عند وضع هذه الانابيب بداخل الدوار.
  6. الختم مع إعادة استخدامها والقبعات وعينات مكان في الدوار قبل تبرد T1270 Sorval ونابذة فائقة السرعة لأجهزة الطرد المركزي في 90SE Sorval في XG 170000 (50000 دورة في الدقيقة) في 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
  7. بعد الطرد المركزي إزالة طاف وإضافة الماء المقدس 90 و 10 درجة الجزيئي بروتين UL - K (20 ملغ / مل) إلى بيليه الفيروسي (وهذا لن يكون مرئيا).
  8. أنابيب مكان في درجة حرارة 55 مئوية وحمام ماء احتضان لمدة 30 دقيقة. تأكد من تعيين الأنابيب بزاوية بحيث يتم غمس جنب مع بيليه في الخليط بروتيناز - K والمياه.
  9. بعد مرور فترة الحضانة ، وتدور فترة وجيزة من أنبوب الطرد المركزي في جدول كبير لجمع كل السائل في الجزء السفلي من الأنبوب (حوالي 5 ثوان) وإضافة 315 UL حل 6M ثيوسيانات guanidinium و 10 ماي من الجليكوجين ملغ / مل 20 (ملاحظة : اتبع المناسبة المبادئ التوجيهية للتخلص من هذه المواد الخطرة ، لا يختلطان مع التبييض أو الأحماض والتخلص منها في حاوية منفصلة).
  10. وتدور الدوامة طفيفة خلال فترة قصيرة (حوالي 5 ثوان). احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم نقل محتويات كل أنبوب إلى المسمى حديثا 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي ريبونوكلياز الحرة.
  11. إضافة 495 UL الجزيئية للكحول الآيزوبروبيل الصف لكل الدوامة ، وأنبوب لمدة 10 ثانية ، والطرد المركزي في 21000 XG لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  12. تجاهل طاف وإضافة 500 UL من الايثانول 70 ٪.
  13. دوامة لمدة 10 ثانية ، والطرد المركزي في 21000 XG لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة الايثانول مع ماصة نقل. تدور مرة أخرى وإزالة أي بقايا مع الايثانول ماصة. الهواء الجاف لمدة 10 دقيقة. (للاطلاع على بروتوكول SGS بحل الجيش الملكي النيبالي في 40 ماي من 5 درجة الحموضة تريس - 8.0 ملي حمض الهيدروكلوريك ، والاستمرار مع بروتوكول SGS).
  14. حل بيليه في 55 ماي من الحمض النووي الريبي العازلة. يتم الحصول على الحمض النووي الريبي العازلة بإضافة 10 من المجاهدين DTT 100 ملم و 25 من المجاهدين Rnasin U / UL 40-965 المجاهدين تريس ، حمض الهيدروكلوريك (8.0 درجة الحموضة ، 5 ملم). مكان على الجليد.

2. في مقايسة نسخة واحدة

صفيحة 96 - جيدا يحمل 8 عينات من المرضى على حد سواء بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية والمعايير والضوابط RCAS. ووصف هذا البروتوكول مجموعة المتابعة لوحة واحدة.

  1. البدء بإعداد 2 aliquots من 1 مل RNA العازلة التي سيتم تخفيفه الحمض النووي الريبي HIV - 1 ومحاضر RCAS الحمض النووي الريبي لمنحنيات معيار الحمض النووي الريبي. يوصف RNA - العازلة تحت 1.13.
  2. تحضير التخفيفات على الجليد في 2 مل أنابيب الطرد المركزي. جعل نصف سجل التخفيفات النصوص الحمض النووي الريبي HIV - 1 في الجيش الملكي النيبالي ، وذلك بإضافة 25 العازلة المجاهدين من المخزون النووي الريبي HIV - 1 (1x10 6 نسخ / UL) إلى 54 ماي RNA العازلة إعطاء 3x10 5 نسخ / UL.
  3. وتستخدم 0.3 ، 1 ، و 3 التخفيفات لن تكون جزءا من المنحنى القياسي خلال التحليل لهذه القيم والاستقراء : تواصل من خلال جعل نصف متتالية سجل التخفيفات (25 + 54 ماي ماي) الى 0.3 نسخة في 10 ماي (لاحظ يجب تعيين والدر المجهولةجي التحليل). ويتم تخزين النصوص RCAS في 6 نسخ 1x10 / UL. وبالمثل ، وإعداد سجل نصف التخفيفات النصوص RCAS في الجيش الملكي النيبالي ، ولكن العازلة وصولا الى 100 نسخة في 10 ماي.
  4. تحضير الكوكتيل RT لتوليف [كدنا] كما هو موضح في الجدول رقم 1. إعداد RT العلاج ببدائل النيكوتين وردود الفعل على النحو الوارد في الجدول رقم 1 مع الأخذ في الاعتبار لتعويض قليلا اضافية لحساب أي خسارة قد تحدث أثناء النقل. ملاحظة : لالكوكتيل العلاج ببدائل النيكوتين ، يتم استبدال إنزيم RT عن طريق المياه للسيطرة على التضخيم من الحمض النووي.
    ملاحظة : تم مؤخرا هذه الخطوة الآلي ، بالإضافة إلى لوحة وضعت على روبوت Qiagen (كوربيت أصلا).
  5. إعداد البصرية 96 - جيدا لوحة (كما هو موضح في الشكل 3) ، وذلك بإضافة 20 ماي من خليط التفاعل RT إلى كل بئر. في آبار 8 المسمى "العلاج ببدائل النيكوتين ،" إضافة الكوكتيل دون الناسخ العكسي (NRT خليط التفاعل). بعد إضافة إلى لوحة الكوكتيل ، إضافة 10 ماي من المياه إلى الآبار المسماة "ضوابط قالب رقم (NTC)". إضافة 10 UL النصوص فيروس نقص المناعة البشرية إلى الآبار المسمى "فيروس نقص المناعة البشرية" في تركيزات مبين في الشكل 3. إضافة 10 UL النصوص RCAS إلى الآبار المسماة "RCAS" في التركيزات وفقا. إضافة 10 ماي من عينة مريض في الآبار المجاورة 3 المسمى "نموذج" على لوحة الرسم. إضافة 10 ماي من العينة eluted إلى الآبار المسماة "النيكوتين". إضافة 5 ماي من نفس العينة و 5 من المجاهدين المياه إلى الآبار المسماة "الرقابة الداخلية".
  6. ختم لوحة وتعمل على thermocycler على العنوان التالي : 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة و 42 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة و 85 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة و 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، و 5 ° C عقد.
  7. تحضير الماجستير يمزج PCR وفقا لجدول رقم 2.
  8. عندما يتم الانتهاء من تركيب [كدنا] ، نقل إلى منطقة مخصصة للاستخدام [كدنا]. في هذا المجال المعين ، إضافة 20 ماي من مزيج الرئيسي PCR إلى كل بئر من لوحة [كدنا] لكل من فيروس نقص المناعة البشرية وRCAS. من المهم أن تنفيذ هذه الخطوة في مجال معين لتفادي أي تلوث محتمل.
  9. لوحة تدور ، مع تغطية الختم أو ABI روش البصرية والضوئية مع تغطية شاملة (بطانية الضرورية فقط لABI 7700). روش تعمل على 480 أو ABI 7700. شروط PCR : 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم 45 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. مطلوب تحليل مستقل لRCAS وفيروس نقص المناعة البشرية. وترد أمثلة من النتائج في الشكل 4. سوف تتأثر المنحدر من منحنى معيار توزيع بواسون العادية منخفضة محاضر في عدد النسخ. من أجل ضمان المنحدر الأكثر دقة لمنحنى القياسية ، وعدد هذه المعايير نسخة منخفضة (0.3 و 1 و 3 نسخ) هي على النحو "مجهولين". 17

3. تسلسل الجينوم واحدة

  1. [كدنا] التوليف. إضافة 5 المجاهدين من 10 ملم و 5 dNTPs المجاهدين من 2 مم الجينات المحددة التمهيدي (POL أو الحياة الفطرية) لبئر في لوحة 96 PCR جيدا (Biorad). إضافة 40 ماي من الحمض النووي الريبي المستخرج. ختم اللوحة.
  2. تفسد RNA - الخليط في thermocycler عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  3. مزج الكواشف لتخليق [كدنا] ، والمدرجة في الجدول 3. بعد خطوة تغيير طبيعة ومكان لوحة PCR على الجليد ، إضافة UL 50 من خليط [كدنا] إلى كل عينة.
  4. تشغيل لوحة PCR على thermocycler : 45 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة و 85 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة و 4 درجات مئوية الانتظار.
  5. أول PCR ، 10 ردود فعل المجاهدين. تحضير خليط التفاعل PCR في علبة الكاشف باستخدام إما الاشعال لتضخيم الدور الاول من RT - P6 أو الحياة الفطرية (الكواشف المدرجة في الجدول 3 ، الاشعال المدرجة في الجدول 5).
  6. باستخدام ماصة متعدد القنوات 8.0 الاستغناء المجاهدين من خليط PCR إلى 73 بئرا على 96 لوحة PCR جيدا (70 و 3 عينات ضوابط السلبية).
  7. بعد اكتمال تركيب [كدنا] [كدنا] التحرك لوحة وPCR PCR يحتوي خليط التفاعل إلى منطقة مخصصة للاستخدام [كدنا]. في منطقة معينة ، اضافة 40 - UL للتريس حمض الهيدروكلوريك 8.0 درجة الحموضة لكل عينة [كدنا] يصل الحجم النهائي إلى 140 UL. إضافة 2.0 [كدنا] من المجاهدين إلى كل من الآبار 70 و 2.0 المجاهدين من المياه إلى كل من عناصر التحكم سلبية. ختم PCR لوحة. تعمل على thermocycler ، البرنامج في الجدول رقم 4.
  8. PCR المتداخلة -- ردود الفعل 20ul. مزج الكواشف لPCR المتداخلة في علبة الكاشف (الكواشف المدرجة في الجدول 3 ، الاشعال المدرجة في الجدول 5).
  9. إضافة 18 ماي من خليط متداخل PCR إلى 73 بئرا على طبق من ذهب 96 PCR كذلك ، من خلال الأقنية ماصة
  10. تمييع first PCR 01:05 وإضافة 2 من المجاهدين PCR الجولة الأولى للPCR المتداخلة. تشغيل PCR رد فعل على thermocycler ، وفقا للشروط الواردة في الجدول رقم 4.
  11. تشغيل العينات على agarose هلام 1 ٪. للتأكد من أن الغالبية العظمى من المنتجات PCR هي نتيجة لجزيء واحد من [كدنا] ، وينبغي أن لا يزيد عن 30 ٪ من الآبار قد تكون إيجابية. وقد تم الآلي في العملية باستخدام بيكمان كولتر Biomek FM الروبوت لتحميل محتويات لوحات PCR إلى 1 ٪ ، و 96 بئرا E - هلام (Invitrogen). يتم تشغيل E - الجل لمدة 7 دقائق على قاعدة الإلكتروني. المنتجات باستخدام تسلسل الاشعال المدرجة في الجدول 5.

4. ممثل النتائج :

SCA :

يجب على جميع عناصر التحكم في تمرير أجل النظر في قياس الحمض النووي الريبي HIV - 1 الصحيح. إذا كان الشاهد السلبي هو positiهاء ، ينبغي تجاهلها على المدى بسبب تلوث محتمل. من أجل السيطرة على الحمض النووي الريبي لخسائر خلال خطوة الاستخراج ، ينبغي استرداد ما لا يقل عن 50 ٪ من RCAS ارتفعت في البلازما. إذا كان متوسط ​​RCAS <15000 نسخة ، وفشل نموذج ينبغي تجاهلها لأن كان من الممكن أن كمية كبيرة من الحمض النووي الريبي التي فقدت خلال استخراج أو خطوات أخرى من البروتوكول. هذا يحدث في حوالي 10 ٪ من المرضى اختبار جميع العينات بسبب ارتفاع نسبة الدهون في المرجح أن 6 في البلازما. والمقصود من استعادة السيطرة على الفيروس RCAS لجودة استخراج وكفاءة والتوليف [كدنا] تضخيم PCR. لم يتم استخدامه لتصحيح لاسترداد فيروس نقص المناعة البشرية منذ منضما إلى فيروس نقص المناعة البشرية المحتمل والبروتينات المناعية البشرية الأخرى مما يجعلها مختلفة قليلا عن الفيروس المعزول من زراعة الأنسجة. وكان انتعاش RCAS في مختبرنا في المتوسط ​​25716 + / -- 4057 نسخة / خليط التفاعل ، أو حوالي 95 ٪ + / -15 ٪ من الحمض النووي الريبي وأضاف RCAS 17. تم تشغيل (لا المنتسخة العكسية) العلاج ببدائل النيكوتين السيطرة بشكل متواز من أجل اختبار للتضخيم من الحمض النووي. يتم طرح قيمة العلاج ببدائل النيكوتين من كل القيم الثلاث RNA HIV - 1 ، ثم يتم حساب المتوسط ​​وإذا كان هذا الرقم أقل من صفر (التضخيم من الحمض النووي يتجاوز التضخيم من RNA) ، والنتيجة أن تفشل ، وينبغي أن يكون ذلك بسبب تجاهلها من مخاطر تضخيم من الحمض النووي بدلا من الحمض النووي الريبي. إذا تم تضخيم فقط HIV - 1 RNA من 1 / 3 آبار ، وإعادة الاختبار أوصى عينة للتأكد من أن التضخيم هو الصحيح بالنسبة للعينة الفعلية يعاير وليس بسبب وجود الملوثات المحتملة.

إذا كانت كافة عناصر التحكم بالمرور ، يمكن حساب متوسط ​​HIV - 1 الحمض النووي الريبي نسخ العدد في البلازما.

مثال 1 : إذا كان متوسط ​​HIV - 1 في عدد النسخ هو صفر ، ويتم احتساب الحد من الكشف على أساس حجم البلازما يعاير. كمثال ، دعونا نقول كان يعاير 7 مل من البلازما. كان أصغر كمية من الحمض النووي الريبي التي كان من الممكن الكشف عن هذا الاختبار مع نسخ 1 في واحدة من الآبار وغيرها من النسخ 0 في الآبار الآخران اعطاء بمتوسط ​​0.33 نسخة من كل جانب. متوسط ​​عدد نسخ ثم لابد من ضرب بمعامل 5.5 إلى الحصول على العدد الإجمالي في نسخة شطف الحمض النووي الريبي (هناك 10 المجاهدين في كل جيد ، ولكن حجم شطف مجموع 55 ماي). الحد الأدنى من الكشف ومن ثم : 5.5 × 0.33 نسخ مقسوما 7ml = 1.83 / 7 = 0.3 نسخة / مل. وكان تركيز HIV - 1 الحمض النووي الريبي في البلازما في هذا المثال <0.3 نسخة / مل.

مثال 2 : HIV - 1 RNA قابلا للاكتشاف. تم استخراج الحمض النووي الريبي في الفترة من 7 مل من البلازما. عدد نسخ متوسط ​​HIV - 1 في الحمض النووي الريبي جيدا يحسب أن تكون 2.0 نسخ لكل بئر. ثم عدد نسخ متوسط ​​مل من البلازما هي 5.5 × 2.0 نسخ / 7 = 1.6 مل HIV - 1 RNA / مل من البلازما.

يمكن أن تكون ورقة قالب Excel المستخدمة في حساب الأرقام تحميل نسخة أسفل من الموقع.

SGS :

وينبغي إذا كان أحد الضوابط السلبية ايجابية يمكن تجاهلها على المدى بسبب تلوث محتمل. سيقوم عدد من المنتجات من كل تشغيل تعتمد على الحمل الفيروسي في كل نموذج وحالة من العينة. في تجربتنا على الكثير من الدهون أو خلايا البلازما في تقليل فرصة الحصول على المنتج. وتخزين وتجميد الأوضاع السابقة ، وذوبان الجليد من العينة تؤثر أيضا على الانتعاش من الحمض النووي الريبي إلى حد كبير. بشكل عام ، عند العمل مع العينات مع الأحمال الفيروسية أقل من 50 نسخة / مل ، والمنتج (العصابات على الجل) أمر متوقع في حوالي 1 / 3 -1 / 2 للعينات المجهزة. اعتمادا على العوامل المذكورة أعلاه ، ينبغي النظر في لوحة العصابات 1-5 نتيجة جيدة نظرا لانخفاض الأحمال الفيروسية لدى هؤلاء المرضى.

[كدنا] التوليف (RT كوكتيل / رد فعل [كدنا]) 1 رد الفعل لا الناسخ العكسي (NRT) كوكتيل / رد فعل [كدنا] (1 رد)
الصف الجزيئية H 2 O 8.1 UL 8.2 UL
25 ملم MgCl 2 6 UL 6 UL
25 ملي dNTPs 0.6 UL 0.6 UL
100 ملي DTT 0.2 UL 0.2 UL
عشوائي Hexamers (0.1 ميكروغرام / UL) 1.5 UL 1.5 UL
10X TaqMan الاحتياطي A 3.0 UL 3.0 UL
Rnasin (40 U / UL) 0.5 UL 0.5 UL
Strategene RT (200 U / UL) 0.1 UL لا تضف
مجموع 20 ماي 20 ماي
عينة الحمض النووي الريبي 10 ماي 10 ماي
اجمالى حجم 30 ماي 30 ماي

mixt الجدول 1 رد الفعل.ures [كدنا] لتخليق نسخة واحدة في الفحص.

PCR الرئيسي مزيج 1 رد الفعل المشارع
H 2 O 15.1 UL فيروس نقص المناعة البشرية إلى الأمام التمهيدي CATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGA 5' - 3 "
10X PCR مخزن الذهب 2.0 UL فيروس نقص المناعة البشرية التمهيدي عكس TGCTTGATGTCCCCCCACT 5' - 3 "
25 ملم MgCl 2 2.0 UL فيروس نقص المناعة البشرية Probe5'FAM - CCACCCCACAAGATTTAAACACCATGCTAA - طمرة 3 '
* التمهيدي إلى الأمام (100 ميكرون) 0.3 UL
* التمهيدي عكسي (100 ميكرون) 0.3 UL RCAS الأمام Primer5' - GTCAATAGAGAGAGGGATGGACAAA - 3 '
* دقق (100 ميكرون) 0.05 UL RCAS عكس Primer5' - TCCACAAGTGTAGCAGAGCCC - 3 '
TaqGold (5 U / UL) 0.25 UL RCAS دقق 5'FAM - TGGGTCGGGTGGTCGTGCC - طمرة 3 '
مجموع 20.0 UL

الجدول 2. مزيج الرئيسي PCR الاشعال والفحص عن نسخة واحدة.

[كدنا] كوكتيل / ردود الفعل [كدنا] 1 عينة الحمض النووي الريبي أول PCR الكوكتيل 1 لوحة (75 ردود) PCR المتداخلة الكوكتيل 1 لوحة (75 ردود)
10X RT العازلة (Invitrogen) 10 ماي 10X PCR العازلة (Invitrogen) 75 ماي 10X PCR العازلة 150 UL
25 ملم MgCl 2 20 ماي 50 ملي MgSO 4 30 ماي 50 ملي MgSO 4 60 ماي
0.1M DTT 1 UL 10 ملي dNTPs 15 ماي 10 ملي dNTPs 30 ماي
ريبونوكلياز خالية من المياه 17.5 UL 50 UM الاشعال (عصام) 3 UL 50 UM الاشعال (عصام) 6 UL
ريبونوكلياز التدريجي (Invitrogen) 1 UL البلاتين طق مرحبا فاي انزيم (invitrogen) 6 UL البلاتين طق مرحبا فاي انزيم (Invitrogen) 12 ماي
ثالثا مرتفع (200 U / UL) (invitrogen) 0.5 UL الجزيئية الصف المياه 468 UL الجزيئية الصف المياه UL 1086

الجدول 1. [كدنا] ومخاليط PCR لتسلسل الجينوم واحدة.

P6 - RT PCR برنامج 1 الحياة الفطرية برنامج PCR 1
1. 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة 1. 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة
2. 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية 2 0،94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية
2 0،94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية 3. 52 درجة مئوية لمدة 30 ثانية
4. 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة 30 ثانية 4. 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة
5. انتقل إلى # 2 ، و 44 دورات 5. انتقل إلى # 2 ، و 44 دورات
6. 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق 6. 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق
7. 4 درجات مئوية عقد 7. 4 درجات مئوية عقد
P6 - RT PCR برنامج 2 الحياة الفطرية 2 PCR البرنامج
1. 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة 1. 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة
2. 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية 2. 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية
3. 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية 3. 56 درجة مئوية لمدة 30 ثانية
4. 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة 4. 72 درجة مئوية لمدة 45 ثانية
5. انتقل إلى # 1 ، 40 (41 دورات الكلية) 5. انتقل إلى # 1 ، 40 (41 دورات الكلية)
6. 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق 6. 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق
7. 4 درجات مئوية عقد 7. 4 درجات مئوية عقد

الجدول 4. Thermocycler شروط الفحص لتسلسل الجينوم واحدة.

رد فعل كتاب تمهيدي تسلسل
P6 - RT [كدنا] 3500 -- 5 'CTATTAAGTATTTTGATGGGTCATAA 3'
[كدنا] الحياة الفطرية E115 - 5'AGAAAAATTCCCCTCCACAATTAA 3 '
P6 - RT 1. PCR 3500 -- 5 'CTATTAAGTATTTTGATGGGTCATAA 3'
P6 - RT 1. PCR 1849 + 5 'GATGACAGCATGTCAGGGAG 3'
P6 - RT2.PCR 1870 + 5 'GAGTTTTGGCTGAGGCAATGAG 3'
P6 - RT 2.PCR 3410 -- 5 'CAGTTAGTGGTATTACTTCTGTTAGTGCTT 3'
الحياة الفطرية 1. PCR E115 - 5'AGAAAAATTCCCCTCCACAATTAA 3 '
الحياة الفطرية 1. PCR E20 + 5'GGGCCACACATGCCTGTGTACCCACAG 3 '
الحياة الفطرية 2. PCR E30 + 5'GTGTACCCACAGACCCCAGCCCACAAG3 '
الحياة الفطرية 2. PCR E125 - 5'CAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG 3 '
P6 - RT التسلسل 2030 + 5'TGTTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC 3 '
P6 - RT التسلسل 2600 + 5'ATGGCCCAAAAGTTAAACAATGGC3 '
P6 - RT التسلسل 2610 -- 5'TTCTTCTGTCAATGGCCATTGTTTAAC3 '
P6 - RT التسلسل 3330 -- 5'TTGCCCAATTCAATTTTCCCACTAA 3 '
تسلسل الحياة الفطرية E30 + 5'GTGTACCCACAGACCCCAGCCCACAAG3 '
تسلسل الحياة الفطرية E125 - 5'CAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG 3 '

الجدول 5. الاشعال الفحص لتسلسل الجينوم واحدة.

الشكل 1
الشكل 1. نظرة عامة على الفحص تسلسل الجينوم سفعة (SGS).

الشكل 2
الشكل 2 لمحة عامة عن الفحص نسخة واحدة (SCA).

الشكل 3
الشكل 3. بلايت انشاء الفحص للنسخ واحدة.

الشكل 4
الشكل 4. تسديدة من على شاشة ABI 7700. ألف تبين HIV - 1 RNA منحنى القياسية مع عينات من المرضى وباء يظهر RCAS منحنى القياسية مع عينات المرضى ارتفعت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HIV - 1 الأفراد المصابين على العلاج المضاد للفيروسات الجمع (سلة) ، أو الذين يسيطرون بشكل طبيعي للعدوى الفيروسية والأحمال منخفضة جدا ، وعادة حوالي 1 نسخة لكل مليلتر من البلازما 4 ، 11 ، 12 ، 17 ، 18. الأحمال الفيروسية في المرضى الذين يعانون من السيطرة الطبيعية ، وكثيرا ما تتقلب حول مجموعة الفردية النقطة 1 ، 2 ، 17. وصف حساسية المقايسات وهنا تعتمد اعتمادا كبيرا على حجم المدخلات من البلازما. عموما ، ونحن نعمل مع 7 مل من البلازما ، ولكن يمكن الحصول على نتائج ايجابية من كميات صغيرة من البلازما ، وكذلك ، تبعا لتحميل البلازما الفعلية الفيروسية. طريقة استخراج الحمض النووي الريبي الموصوفة هنا هو "الشراب المنزل" الذي هو كثيفة العمالة. لقد وجدنا أن هذا الأسلوب هو استخراج موثوق جدا وأكثر فعالية من القائمة مجموعات المتاحة تجاريا لاستخراج الحمض النووي الريبي. نوعية البلازما مهم للحصول على المنتج. وتجميد والذوبان السابقة من البلازما أو تخزينها في درجات حرارة أعلى من درجة -80 تلف الحمض النووي الريبي وتقليل فرص المنتج. A "قبل تدور" من البلازما هي أيضا للغاية وأوصت لفصل الدهون والخلايا وغيرها من الخصائص التي قد تتداخل مع مقايسة قبل الطرد المركزي الفائقة.

وقد تم اتخاذ عدة خطوات الآلي في البروتوكولات.

في مقايسة SCA لديه ميزة كونها أكثر حساسية من المقايسات ultrasensitive الأخرى ، ومنها على سبيل المثال فحص في الوقت الحقيقي التي وصفها Dornadula آخرون. مع الحد الأدنى من الكشف عن 5.0 نسخ لكل مل من البلازما 5 ، مقايسة تعديل ultrasensitive Amplicor (روش ، بازل ، سويسرا) التي وصفها آخرون Havlir 9 كشف وصولا الى 2.5 نسخة لكل مليلتر من البلازما والنسخ ، وشبه كمي توسط التضخيم (TMA) التي وصفها مقايسة هاتانو آخرون (8) مع الحد الأدنى المقدر an الكشف عن 3،5 نسخة / مل. بالمقارنة مع غيرها من المقايسات وultrasensitive 5 و 8 و 9 RNA يتم رصد الانتعاش في مقايسة SCA بواسطة معيار الفيريون الداخلية (RCAS) التي تمتلك نسبة الترسيب نفس HIV - 1 ، وبالتالي فإنه بمثابة الفيروس احتياطية لضمان أن تكون جميع الفيروسات وقد تم خلال مكعبات تدور تنبيذ فائق وتحملوا ما تبقى من إجراءات استخراج صرامة. وهذا هو أيضا مفيدة جدا للمساعدة في القضاء على إمكانية الكشف سلبية كاذبة. في مقايسة SCA لديه ميزة واضحة على مدى مقايسة TMA 8 من الكمية التي يجري مباشرة. ومع ذلك تتم مقارنة مقايسة SCA لفحوصات أخرى ultrasensitive العمل مكثفة ومكلفة للغاية. نتائج من فحص SCA موثوق بها فقط إذا كانت كافة الضوابط الداخلية بالمرور.

في مقايسة المفرد الجينوم هو المعيار الذهبي لالتضخيم من الجينوم. لها ميزة على استنساخ لا يتعرض لإعادة أخذ العينات إذا كانت كمية مدخلات منخفضة 16 وليس منحازا بواسطة تأشب PCR قدم 15. ومع ذلك يقتصر SGS حسب التصميم التمهيدي الذي قد التحيز الذي HIV - 1 السكان وتتضخم 10.

كل من هيئة الأوراق المالية وSGS تعتمد اعتمادا كبيرا على التصميم التمهيدي. كلا المقايسات الموصوفة هنا صممت لتضخيم HIV - 1 باء سلالة بسبب التباين داخل النوع الفرعي باء ، لم يتم الحصول على منتج في حوالي 10 ٪ من العينات بسبب عدم التطابق بين الاشعال والقالب. ومع ذلك ، يمكن بسهولة أن تتكيف على حد سواء المقايسات إلى أنواع فرعية أخرى أو مناطق أخرى حسب التصميم الجينومية التمهيدي المتغيرة ومنحنى القياسية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

الكتاب نود أن ننوه المرضى الذين شاركوا في العديد من الدراسات من HIV - 1.

وكان JMC أستاذ البحوث في جمعية السرطان الاميركية بدعم من مؤسسة كيربي FM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Random hexamers (500 ug/ml) Promega Corp. C118A
Taqman buffer A Applied Biosystems 4304441
RNAsin (40 U/ul) Promega Corp. N211B
RT enzyme (200 U/ul) Stratagene, Agilent Technologies 600107-51
Amplitaq Gold DNA polymerase Applied Biosystems 4311814 6-pack
Amplitaq 10XGold PCR buffer II Applied Biosystems 4311814 comes with the enzyme
Magnesiumcloride 25 mM Applied Biosystems 4311814 comes with the enzyme
1M Tris-HCl buffer, pH 8.0, 5 mM Invitrogen AM9855G
Superscript III reverse transcriptase enzyme, 200 U/ul Invitrogen 18080-044
Superscript III 10X buffer Invitrogen comes with the enzyme
DTT 100 mM Invitrogen comes with the enzyme
Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity 5 U/ul Invitrogen 11304-102
10X High Fidelity PCR Buffer Invitrogen 11304-102 comes with the enzyme
Proteinase-K 20 mg/ml Ambion 2546
Guanidinium Thiocyanate solution 6M Fluka 50983
Glycogen 20 mg/ml Roche Group 10901393001
Isopropanol Sigma-Aldrich 19516
Ethanol 70% Sigma-Aldrich E702-3
Molecular grade water GIBCO, by Life Technologies 10977-015
dNTPs (25 mmol each) Bioline BIO-39025
Easy Seal Centrifuge Tubes (16x73mm) Seaton Scientific 6041
White Delrin crowns Seaton Scientific 4020 Caps for the Easy Seal Tubes
Tube Rack for Optiseal Bell-Top Tubes, 8.9 ml Beckman Coulter Inc. 361642
Hex driver ½ inc opening Seaton Scientific 4013
cap removal tupe Seaton Scientific 4014
5 ml serological pipettes Costar 4051
Pipetboy Any Supplier
15 ml Transfer pipettes ISC Bioexpress P-5005-7
5.8 ml Dispossable transfer pipettes, fine tip VWR international 14670-329
15 ml centrifuge tubes Falcon BD
1 ml centrifuge tubes Any Supplier
Tris buffer Saline tablets Sigma-Aldrich T5030-100TAB
Ultracentrifuge and rotor Sorvall, Thermo Scientific 90SE and T-1270
96-well PCR plates Bio-Rad HSS-9601
50 ml Reagent reservoir Costar 4870
Microamp optical 96-well reaction plate Applied Biosystems N801-0560
Optical plate covers Applied Biosystems 4333183
MicroAmp Optical Compression Pad Applied Biosystems 4312639
Microseal A film Bio-Rad MSA-5001
2 ml centrifuge tubes Any Supplier
1% agarose gels (E-gel, invitrogen) Invitrogen G-7008-01
E-base (Invitrogen) Invitrogen EB-M03
EDTA Collection tubes any brand

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Amara, R. R., Villinger, F., Altman, J. D., Lydy, S. L., O'Neil, S. P., Staprans, S. I., Montefiori, D. C., Xu, Y., Herndon, J. G., Wyatt, L. S. Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine. Vaccine. 20, 1949-1955 (2002).
  2. Dinoso, J., Kim, S., Blankson, J., Siliciano, R. F. Viral Dynamics of Elite Suppressors in HIV-1 Infection. Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. , (2008).
  3. Dinoso, J. B., Kim, S. Y., Wiegand, A. M., Palmer, S. E., Gange, S. J., Cranmer, L., O'Shea, A., Callender, M., Spivak, A., Brennan, T., Kearney, Treatment intensification does not reduce residual HIV-1 viremia in patients on highly active antiretroviral therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9403-9408 (2009).
  4. Doria-Rose, N. A., Klein, R. M., Manion, M. M., O'Dell, S., Phogat, A., Chakrabarti, B., Hallahan, C. W., Migueles, S. A., Wrammert, J., Ahmed, R., Nason, M., Wyatt, R. T., Mascola, J. R., Connors, M. Frequency and phenotype of human immunodeficiency virus envelope-specific B cells from patients with broadly cross-neutralizing antibodies. J. Virol. 83, 188-199 (2009).
  5. Dornadula, G., Zhang, H., Uitert, B. V. an, Stern, J., Livornese, L., Ingerman, M. J., Witek, J., Kedanis, R. J., Natkin, J., DeSimone, J., Pomerantz, R. J. Residual HIV-1 RNA in blood plasma of patients taking suppressive highly active antiretroviral therapy. JAMA. 282, 1627-1632 (1999).
  6. Gandhi, R. T., Zheng, L., Bosch, R. J., Chan, E. S., Margolis, D. M., Read, S., Kallungal, B., Palmer, S., Medvik, K., Lederman, M. M., Alatrakchi, N., Jacobson, J. M., Wiegand, A., Kearney, M., Coffin, J. M., Mellors, J. W., Eron, J. J. The effect of raltegravir intensification on low-level residual viremia in HIV-infected patients on antiretroviral therapy: a randomized controlled trial. PLoS medicine. 7, (2010).
  7. Gay, C., Dibben, O., Anderson, J. A., Stacey, A., Mayo, A. J., Norris, P. J., Kuruc, J. D., Salazar-Gonzalez, J. F., Li, H., Keele, B. F., Hicks, C., Margolis, D., Ferrari, G., Haynes, B., Swanstrom, R. Cross-sectional detection of acute HIV infection: timing of transmission, inflammation and antiretroviral therapy. PLoS One. 6, 19617-19617 (2011).
  8. Hatano, H., Delwart, E. L., Norris, P. J., Lee, T. H., Dunn-Williams, J., Hunt, P. W., Hoh, R., Stramer, S. L., Linnen, J. M., McCune, J. M., Martin, J. N., Busch, M. P., Deeks, S. G. Evidence for persistent low-level viremia in individuals who control human immunodeficiency virus in the absence of antiretroviral therapy. J. Virol. 83, 329-335 (2009).
  9. Havlir, D. V., Bassett, R., Levitan, D., Gilbert, P., Tebas, P., Collier, A. C., Hirsch, M. S., Ignacio, C., Condra, J., Gunthard, H. F., Richman, D. D., Wong, J. K. Prevalence and predictive value of intermittent viremia with combination hiv therapy. JAMA. 286, 171-179 (2001).
  10. Jordan, M. R., Kearney, M., Palmer, S., Shao, W., Maldarelli, F., Coakley, E. P., Chappey, C., Wanke, C., Coffin, J. M. Comparison of standard PCR/cloning to single genome sequencing for analysis of HIV-1 populations. J Virol Methods. 168, 114-120 (2010).
  11. Kaufmann, D. E., Kavanagh, D. G., Pereyra, F., Zaunders, J. J., Mackey, E. W., Miura, T., Palmer, S., Brockman, M., Rathod, A., Piechocka-Trocha, A., Baker, B., Zhu, B., Gall, S. L. e, Waring, M. T., Ahern, R., Moss, K., Kelleher, A. D. Upregulation of CTLA-4 by HIV-specific CD4+ T cells correlates with disease progression and defines a reversible immune dysfunction. Nat Immunol. 8, 1246-1254 (2007).
  12. Kearney, M., Maldarelli, F., Shao, W., Margolick, J. B., Daar, E. S., Mellors, J. W., Rao, V., Coffin, J. M., Palmer, S. HIV-1 Population Genetics and Adaptation in Newly Infected Individuals. J. Virol. 83, 2715-2727 (2008).
  13. Kearney, M., Palmer, S., Maldarelli, F., Shao, W., Polis, M. A., Mican, J., Rock-Kress, D., Margolick, J. B., Coffin, J. M., Mellors, J. W. Frequent polymorphism at drug resistance sites in HIV-1 protease and reverse transcriptase. AIDS. 22, 497-501 (2008).
  14. Kearney, M., Spindler, J., Shao, W., Maldarelli, F., Palmer, S., Hu, S. L., Lifson, J. D., Kewal Ramani, V. N., Mellors, J. W., Coffin, J. M., Ambrose, Z. Genetic diversity of simian immunodeficiency virus encoding HIV-1 reverse transcriptase persists in macaques despite antiretroviral therapy. Journal of Virology. 85, 1067-1076 (2011).
  15. Keele, B. F., Giorgi, E. E., Salazar-Gonzalez, J. F., Decker, J. M., Pham, K. T., Salazar, M. G., Sun, C., Grayson, T., Wang, S., Li, H., Wei, X., Jiang, C., Kirchherr, J. L., Gao, F., Anderson, J. A., Ping, L. H., Swanstrom, R. Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 105-7552 (2008).
  16. Liu, S. L., Rodrigo, A. G., Shankarappa, R. G., Learn, H., Hsu, L., Davidov, O., Zhao, L. P., Mullins, J. I. HIV quasispecies and resampling. Science. 273, 415-416 (1996).
  17. Mahalanabis, M., Jayaraman, P., Miura, T., Pereyra, F., Chester, E. M., Richardson, B., Walker, B., Haigwood, N. L. Continuous viral escape and selection by autologous neutralizing antibodies in drug-naive human immunodeficiency virus controllers. J. Virol. 83, 662-672 (2009).
  18. Migueles, S. A., Connors, M. The Role of CD4(+) and CD8(+) T Cells in Controlling HIV Infection. Curr. Infect. Dis. Rep. 4, 461-467 (2002).
  19. Palmer, S., Kearney, M., Maldarelli, F., Halvas, E. K., Bixby, C. J., Bazmi, H., Rock, D., Falloon, J., Davey, R. T., Dewar, R. L., Metcalf, J. A., Hammer, S., Mellors, J. W., Coffin, J. M. Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis. J. Clin. Microbiol. 43, 406-413 (2005).
  20. Palmer, S., Wiegand, A. P., Maldarelli, F., Bazmi, H., Mican, J. M., Polis, M., Dewar, R. L., Planta, A., Liu, S., Metcalf, J. A., Mellors, J. W., Coffin, J. M. New real-time reverse transcriptase-initiated PCR assay with single-copy sensitivity for human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma. J. Clin. Microbiol. 41, 4531-4536 (2003).

Tags

علم المناعة ، العدد 55 ، واحد تسلسل الجينوم ، SGS ، في الوقت الحقيقي PCR ، واحد نسخة مقايسة ، SCA ، HIV - 1 ، فائقة الحساسية استخراج الحمض النووي الريبي ،
تضخيم وقياس HIV - 1 الحمض النووي الريبي في الأفراد المصابين بالايدز مع الأحمال الفيروسية أقل من الحد كشفها بواسطة فحوصات السريرية القياسية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mens, H., Kearney, M., Wiegand, A.,… More

Mens, H., Kearney, M., Wiegand, A., Spindler, J., Maldarelli, F., Mellors, J. W., Coffin, J. M. Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays. J. Vis. Exp. (55), e2960, doi:10.3791/2960 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter