Die Quantifizierung der HIV-1 RNA im Plasma und Sequenzierung einzelner HIV-1 Genome von Individuen mit einer Viruslast unterhalb der Nachweisgrenze (50-75 Kopien / ml) ist schwierig. Hier beschreiben wir, wie zu extrahieren und zu quantifizieren, Plasma-Virus-RNA mit Hilfe eines Echtzeit-PCR-Assay, der zuverlässig misst HIV-1 RNA bis zu 0,3 Kopien / ml und wie man virale Genome von einzelnen Genomsequenzierung verstärken, von Proben mit sehr niedrigen Viruslast.
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Methodenartikel
Verstärkung und Quantifizierung von HIV-1 RNA in HIV-infizierten Personen mit Viruslast unter der Nachweisgrenze von Standard Clinical Assays
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Amplifikation viraler Gene und Quantifizierung von HIV-1 RNA in HIV-1 infizierten Patienten mit einer Viruslast unterhalb der Nachweisgrenze von Standard-Tests (unter 50-75 Kopien / ml) ist notwendig, um einen Einblick zu viralen Dynamik und Virus Wirt-Interaktionen zu gewinnen bei Patienten, die natürlich Kontrolle der Infektion und diejenigen, die auf einer antiretroviralen Kombinationstherapie (cART) sind.
Hier beschreiben wir, wie man virale Genome von einzelnen Genoms (die SGS-Protokoll) 13, 19 und wie genau quantifizieren HIV-1 RNA bei Patienten mit niedrigen Viruslast (die Single-Copy-Test (SCA)-Protokoll) 12, 20 zu verstärken.
Die Single-copy-Assay ist ein real-time PCR-Assay mit Empfindlichkeit in Abhängigkeit vom Volumen des Plasmas untersucht. Wenn ein einzelner Virus-Genom in 7 ml Plasma erkannt wird, dann ist die RNA-Kopienzahl gemeldet zu 0,3 Kopien / ml liegen. Der Test hat ein internes Kontrollsystem Tests für die Effizienz der RNA-Extraktion und Steuerungen für möglich Amplifikation aus DNA oder Verunreinigung. Patientenproben sind in dreifacher Ausfertigung gemessen.
Die Single-Genom-Sequenzierung Assay (SGS), mittlerweile weit verbreitet und als nicht arbeitsintensiv 3, 7, 12, 14, 15, ist ein limitierender Verdünnung Assay, in dem Endpunkt verdünnten cDNA Produkt über einen 96-Loch verteilt Platte. Laut einer Poisson-Verteilung, wenn weniger als 1 / 3 der Brunnen Produkt geben, gibt es eine 80% ige Chance, das PCR-Produkt wird resultierenden Verstärkung von einer einzigen cDNA-Molekül. SGS hat den Vorteil, über das Klonen von nicht zu Resampling unterzogen und nicht durch PCR eingeführt Rekombination 19 vorgespannt. Allerdings hängen die Verstärkung Erfolg von SCA und SGS auf Primer-Design. Beide Tests wurden für HIV-1 Subtyp B entwickelt, kann aber für andere Subtypen und anderen Regionen des Genoms, indem Primer, Sonden und Standards angepasst werden.
Protokoll
1. Extraktion von RNA aus große Mengen an Plasma-
Eine Übersicht über die einzelne Kopie Assay (SCA) und die einzigen Genoms (SGS)-Protokoll sind in den Abbildungen 1 und 2 vorgesehen.
- Um 7 ml Plasma, Spin ca. 14 ml Blut in 15 ml EDTA (nicht Heparin) Sammelröhrchen bei 2.600 xg für 15 Minuten ohne zu bremsen. Pipette Plasma (achten Sie darauf, die Buffy-Coat-Schicht zu vermeiden) in 15 ml Tuben.
- Wenn RNA wird für die einzelne Kopie Assay (SCA), spike das Plasma mit 30.000 Kopien des Rous Sarcoma Virus internen Virion-Steuerung (RCAS) extrahiert. Die RCAS Virus ist vor der Durchführung SCA wie zuvor beschrieben (20) vo....
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Diskussion
HIV-1 infizierten Personen auf einer antiretroviralen Kombinationstherapie behandelt (cART) oder die natürlich kontrollieren die Infektion haben eine sehr niedrige Viruslast, typischerweise etwa 1 Exemplar pro ml Plasma 4, 11, 12, 17, 18. Viruslast bei Patienten mit natürlichen Kontrolle, oft um einen individuellen Sollwert 1, 2, 17 schwanken. Die Empfindlichkeit des hier beschriebenen Tests ist stark abhängig von der Eingabe Volumen von Plasma. Generell haben wir mit 7 ml Plasma gearbeitet, aber p.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Die Autoren möchten die Patienten, die in den zahlreichen Studien von HIV-1 beteiligt zu bestätigen.
JMC war ein Research Professor der American Cancer Society mit Unterstützung der FM Kirby Foundation.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenz | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare |
| Zufällige Hexameren (500 ug / ml) | Promega | C118A | |
| Taqman Puffer A | Applied Biosystems | 4304441 | |
| RNAsin (40 U / ul) | Promega | N211B | |
| RT-Enzym (200 U / ul) | Strategene | 600107-51 | |
| AmpliTaq Gold DNA-Polymerase | Applied Biosystems | 4311814 | 6-pack |
| Amplitaq 10XGold PCR-Puffer II | Applied Biosystems | 4311814 | kommt mit dem Enzym |
| Magnesiumcloride 25 mM | Applied Biosystems | 4311814 | kommt mit dem Enzym |
| 1M Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, 5 mM | Invitrogen | AM9855G | |
| Superscript III Enzym reverse Transkriptase, 200 U / ul | Invitrogen | 18080-044 | |
| Superscript III 10X-Puffer | Invitrogen | kommt mit dem Enzym | |
| 100 mM DTT | Invitrogen | kommt mit dem Enzym | |
| Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity 5 U / ul | Invitrogen | 11304-102 | |
| 10x High Fidelity PCR Buffer | Invitrogen | 11304-102 | kommt mit dem Enzym |
| Proteinase-K 20 mg / ml | Ambion | 2546 | |
| Guanidiniumthiocyanat Lösung 6M | FlukaBiochemica | 50983 | |
| Glykogen 20 mg / ml | Roche | 10901393001 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 19516 | |
| Ethanol 70% | Sigma-Aldrich | E702-3 | |
| Molecular-Wasser | Gibco / Invitrogen | 10977-015 | |
| dNTPs (25 mmol pro Stück) | Bioline | BIO-39025 |
| Name des Euipment | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Einfache Seal Zentrifugenröhrchen (16x73mm) | Seaton Scientific | 6041 | |
| Weiß Delrin Kronen | Seaton Scientific | 4020 | Caps für den Easy Seal Tubes |
| Tube Rack für Optiseal Bell-Top Tubes, 8,9 ml | Beckman | 361642 | |
| Hex-Treiber ½ inc Eröffnung | Seaton Scientific | 4013 | |
| Kappe Entfernung tupe | Seaton Scientific | 4014 | |
| 5 ml serologischen Pipetten | Costar | 4051 | |
| Pipetboy | alle | ||
| 15 ml Transferpipetten | ISC Bioexpress | P-5005-7 | |
| 5,8 ml Dispossable Transferpipetten, feine Spitze | VWR | 14670-329 | |
| 15 ml Zentrifugenröhrchen | Falke | ||
| 1 ml Zentrifugenröhrchen | alle | ||
| Tris-Puffer Saline Tabletten | Sigma-Aldrich | T5030-100TAB | |
| Ultrazentrifuge und Rotor | Sorval | 90SE und T-1270 | |
| 96-well PCR-Platten | Biorad | HSS-9601 | |
| 50 ml Reagenz-Reservoir | Costar | 4870 | |
| Microamp optischen 96-Well-Reaktionsplatte | Applied Biosystems | N801-0560 | |
| Optische Platte deckt | Applied Biosystems | 4333183 | |
| MicroAmp Optical Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | |
| MicrosealEin Film | Biorad | MSA-5001 | |
| 2 ml Zentrifugenröhrchen | Alle | ||
| 1% igen Agarosegelen (E-Gel, Invitrogen) | Invitrogen | G-7008 bis 01 | |
| E-base (Invitrogen) | Invitrogen | EB-M03 |
EDTA Sammelröhrchen jede Marke
Referenzen
- Amara, R. R., Villinger, F., Altman, J. D., Lydy, S. L., O'Neil, S. P., Staprans, S. I., Montefiori, D. C., Xu, Y., Herndon, J. G., Wyatt, L. S. Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine. Vaccine. 20, 1949-1955 (2002).
- Dinoso, J., Kim, S., Blankson, J., Siliciano, R. F.
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Nachdrucke und Genehmigungen
