Summary
Kwantificeren niveaus van HIV-1 RNA in het plasma en de volgorde single HIV-1 genoom van individuen met een viral load onder de detectielimiet (50-75 kopieën / ml) is moeilijk. Hier beschrijven we hoe te winnen en te kwantificeren plasma virale RNA met behulp van een real-time PCR-test die een betrouwbare maatregelen HIV-1 RNA beneden tot 0,3 kopieën / ml en hoe virale genomen versterken door enkele genoom, van monsters met een zeer lage viral load.
Abstract
Versterken virale genen en het kwantificeren van HIV-1 RNA in HIV-1 geïnfecteerde personen met een viral load onder de detectielimiet door standaard assays (minder dan 50 tot 75 kopieën / ml) is nodig om inzicht te krijgen op virale dynamiek en virus gastheer interacties bij patiënten die natuurlijk de controle van de infectie en degenen die op antiretrovirale combinatietherapie (CART).
Hier beschrijven we hoe de virale genomen versterken door enkele genoom (de SGS-protocol) 13, 19 en hoe nauwkeurig kwantificeren HIV-1 RNA in patiënten met een lage virale belasting (de single-copy assay (SCA)-protocol) 12, 20.
De single-kopie assay is een real-time PCR-test met de gevoeligheid afhankelijk van het volume van het plasma wordt getest. Als een enkel virus genoom wordt gedetecteerd in 7 ml plasma, dan is het RNA-kopie-aantal is naar verluidt 0,3 kopieën / ml. De test heeft een interne controle van het testen voor de efficiëntie van RNA-extractie, en controles voor mogelijke versterking van DNA of vervuiling. Monsters van patiënten worden gemeten in drievoud.
De single-genoom sequencing assay (SGS), die nu op grote schaal gebruikt en wordt beschouwd als niet-arbeidsintensief 3, 7, 12, 14, 15, is een beperkende verdunning assay, waarbij eindpunt verdunde cDNA product is verspreid over een 96-wells plaat. Volgens een Poisson-verdeling, wanneer er minder dan 1 / 3 van de putten te geven product, is er een 80% kans van het PCR-product wordt resultante van versterking van een enkele cDNA-molecuul. SGS heeft het voordeel ten opzichte van het klonen van het niet worden onderworpen aan resampling en niet wordt vertekend door PCR-geïntroduceerde recombinatie 19. Echter, de versterking succes van SCA en SGS zijn afhankelijk van primer design. Beide testen zijn ontwikkeld voor HIV-1 subtype B, maar kan worden aangepast voor andere subtypen en andere regio's van het genoom door het veranderen van primers, probes, en normen.
Protocol
1. Extractie van RNA uit grote hoeveelheden plasma
Een overzicht van de enkel exemplaar assay (SCA) en de interne genoom sequencen (SGS)-protocol zijn opgenomen in de figuren 1 en 2.
- Voor het verkrijgen van 7 ml plasma, spin ongeveer 14 ml bloed opgevangen in 15 ml EDTA (niet heparine) collectie buizen op 2.600 xg gedurende 15 minuten zonder remmen. Pipet plasma (en zorg ervoor dat de buffy coat laag te voorkomen) in 15 ml buizen.
- Als RNA wordt onttrokken voor de enkele kopie assay (SCA), spike het plasma met 30.000 exemplaren van de Rous sarcomavirus interne virion controle (RCA). De RCA virus is voor gebruik bereid met het uitvoeren van SCA zoals eerder beschreven (20). In het kort, is RCA virus van celkweeksupernatant gekwantificeerd met behulp van RT-activiteit, verdund tot een uiteindelijke concentratie van 30.000 virionen per 200 ul, verdund in RPMI weefselkweek media met 5% FBS, en opgeslagen bij -80 ° C in voor eenmalig gebruik aliquots. De RCA virus mag niet worden ingevroren / voorafgaand ontdooid te gebruiken in de test. RCA wordt verrijkt in de patiënt plasma te controleren voor de efficiëntie van de RNA-extractie en voor de juistheid van de PCR kwantificering. Meer informatie over RCA is te vinden op de volgende link: http://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/ .
- "Pre-spin" plasma, in 15 ml conische centrifugebuizen, bij 2600 xg gedurende 15 minuten te scheiden lipiden en cellulaire puin, die kunnen interfereren met accurate kwantificering RNA.
- Label Seton Easy-Seal centrifuge buizen met een permanent marker op monsternummer en de locatie waar de pellet zal vormen in de buis te identificeren. Na de pre-spin, transfer plasma een Seton Easy-Seal centrifuge buizen door pipetteren het plasma en het vermijden van cellulaire puin en / of lipiden aan de oppervlakte. Noteer de input volume van de plasma.
- Voeg Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) voor de resterende volume van de Seton-Easy Seal tube te vullen aan de onderzijde van de schroefdraad nek. Zorg ervoor dat geen luchtbellen aanwezig zijn in de buis of de buis zal instorten in de ultracentrifuge. Zorg ervoor dat het merk op de buizen naar buiten gericht is bij het plaatsen van de buisjes in de rotor.
- Afdichting met herbruikbare doppen en plaats monsters in een pre-gekoelde Sorval T1270 rotor en centrifuge in de Sorval 90SE ultracentrifuge bij 170.000 xg (50.000 rpm) bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
- Na het centrifugeren verwijderd supernatant en voeg 90 ul moleculair-biologische kwaliteit water en 10 ul proteïnase-K (20 mg / ml) om de virale pellet (dit zal niet zichtbaar zijn).
- Plaats de buisjes in een 55 ° C waterbad en incubeer gedurende 30 minuten. Zorg ervoor dat de buizen worden ingesteld op een hoek, zodat de kant met de pellet wordt ondergedompeld in de proteïnase-K en water mengsel.
- Na incubatie, kort draaien de buis in een tafelblad centrifuge om alle vloeistof op te vangen op de bodem van de buis (ongeveer 5 seconden) en voeg 315 ul van 6M guanidiniumthiocyanaat oplossing en 10 ul van 20 mg / ml glycogeen (Opmerking: Volg juiste richtlijnen voor afvalverwerking voor dit gevaarlijke materiaal; niet mengen met bleekwater of zuren en gooi in aparte container).
- Vortex licht en spin kort (ongeveer 5 seconden). Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en vervolgens over de inhoud van elke buis om een nieuw label 1,5 ml RNAse Gratis centrifugebuizen.
- Voeg 495 ul van de moleculair-biologische kwaliteit isopropylalcohol aan elke buis, vortex gedurende 10 seconden en centrifugeer bij 21.000 xg gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Gooi supernatant en voeg 500 ul van 70% ethanol.
- Vortex gedurende 10 seconden en centrifugeer bij 21.000 xg gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de ethanol met een transfer pipet. Spin opnieuw en verwijder eventueel resterende ethanol met een pipet. Drogen aan de lucht gedurende 10 minuten. (Voor de SGS-protocol RNA op te lossen in 40 ul van 5 mM Tris-HCl pH 8,0, en ga verder met de SGS-protocol).
- Los pellet in 55 ul van RNA-buffer. RNA-buffer wordt verkregen door toevoeging van 10 ul van 100 mM DTT en 25 ul van 40 U / ul Rnasin tot 965 ul Tris-HCl (pH 8,0, 5 mM). Plaats op het ijs.
2. De Single Copy-test
Een 96-well plaat bevat acht monsters van patiënten met zowel HIV en RCA normen en controles. Dit protocol beschrijft de set-up van een enkele plaat.
- Begin met het opstellen van twee porties van 1 ml RNA-buffer, waarin de HIV-1 RNA en RNA-transcripten RCA zal worden verdund voor de RNA-standaard curves. RNA-buffer wordt beschreven onder 1.13.
- Bereid verdunningen op ijs in 2 ml centrifugebuis. Maak half-log verdunningen van HIV-1 RNA transcripten in RNA-buffer door toevoeging van 25 ul van de HIV-1 RNA voorraad (1x10 6 kopieën / ul) tot 54 ul RNA-buffer te geven 3x10 5 kopieën / ul.
- Ga verder door het maken van opeenvolgende half-log verdunningen (25 ul + 54 ul) naar beneden tot 0,3 exemplaren per 10 ul (Let op: 0,3, 1 en 3 verdunningen zal geen deel uitmaken van de standaard curve tijdens de analyse voor deze worden gebruikt als extrapolatie waarden en dient te worden ingesteld op onbekenden DurING-analyse). RCA transcripties zijn opgeslagen op 1x10 6 kopieën / ul. Ook bereiden half-log verdunningen van RCA transcripten in RNA-buffer, maar tot 100 exemplaren per 10 ul.
- Bereid de RT cocktail voor de cDNA synthese zoals vermeld in tabel 1. Bereid RT en NRT reacties zoals vermeld in tabel 1 te houden in het achterhoofd om een beetje extra rekening te houden voor enig verlies die zich kunnen voordoen tijdens de overdracht. Let op: voor de NRT cocktail, de RT enzym wordt vervangen door water om de controle voor de amplificatie van DNA.
Opmerking: Deze stap is onlangs geautomatiseerd in aanvulling op plaat zetten op een Qiagen Robot (oorspronkelijk Corbett). - Stel de optische 96-well plaat (zoals weergegeven in figuur 3), door toevoeging van 20 ul van RT reactiemengsel aan elke well. In de gelabelde 8 wells "NRT," voegt de cocktail zonder de reverse transcriptase (NRT reactiemengsel). Na het toevoegen van de cocktails op de plaat, voeg 10 ul van water aan bronnen met het label "No template controles (NTC)". Voeg 10 ul van de HIV-transcripten te putten met het label "HIV" in concentraties weergegeven in figuur 3. Voeg 10 ul van de RCA transcripten te putten met het label "RCA" in volgens concentraties. Voeg 10 ul van de patiënt monster in de drie aangrenzende putten met het label "Sample" op plaat diagram. Voeg 10 ul van het geëlueerde monster aan de putten met het label "NRT." Voeg 5 ul van hetzelfde monster en 5 ul van water naar de putten met het label "interne controle."
- Sluit de plaat en draaien op thermocycler op: 25 ° C gedurende 15 minuten, 42 ° C gedurende 40 minuten, 85 ° C gedurende 10 minuten, 25 ° C gedurende 30 minuten, en 5 ° C te houden.
- Bereid PCR mastermengsels volgens Tabel 2.
- Wanneer de cDNA-synthese is voltooid, verhuizen naar een terrein dat is aangewezen voor het gebruik van cDNA. In dit aangewezen gebied, voeg 20 ul van de PCR Master Mix aan elk putje van de cDNA plaat voor zowel HIV en RCA. Het is belangrijk om deze stap uit te voeren in een aangewezen gebied om eventuele besmetting te voorkomen.
- Spin plaat, afdichting met ABI-of Roche Lichtkap en bedek met optische deken (deken alleen nodig voor ABI 7700). Run op Roche 480 of ABI 7700. PCR-condities: 95 ° C gedurende 10 minuten, vervolgens 45 cycli van 95 ° C gedurende 15 seconden, 60 ° C gedurende 1 minuut. Afzonderlijke analyse is vereist voor RCA en HIV. Voorbeelden van resultaten zijn weergegeven in figuur 4. De helling van de standaard curve wordt beïnvloed door een normale Poisson-verdeling van de lage kopie-aantal transcripten. Om de meest nauwkeurige helling zorgen voor de standaard curve, deze lage copy number normen (0,3, 1 en 3 kopieën) worden ingesteld als 'onbekenden'. 17
3. Single Genome Sequencing
- cDNA synthese. Voeg 5 ul van 10 mM dNTPs en 5 ul van de 2 mM gen-specifieke primer (pol of env) om een goed in een 96 goed PCR-plaat (Biorad). Voeg 40 ul van de geëxtraheerde RNA. Seal plaat.
- Denaturatie van de RNA-mengsel in thermocycler bij 65 ° C gedurende 10 minuten.
- Meng de reagentia voor cDNA synthese, vermeld in tabel 3. Na de denaturering stap, plaats PCR-plaat op ijs, voeg de 50 ul van het cDNA mengsel aan elk monster.
- Run PCR-plaat op thermocycler: 45 ° C gedurende 50 min, 85 ° C gedurende 10 min en 4 ° C te houden.
- Eerste PCR, 10 ul reacties. Maak de PCR-mengsel in een reagens lade met behulp van de primers voor de eerste ronde versterking van p6-rt of env (Reagentia vermeld in tabel 3, primers weergegeven in Tabel 5).
- Met behulp van een multi-channel pipet afzien 8,0 ul PCR-mengsel tot 73 putten op de 96 goed PCR-plaat (70 monsters en drie negatieve controles).
- Na de cDNA synthese is voltooid zet de cDNA en PCR-plaat met PCR-mix tot een terrein dat is aangewezen voor het gebruik van cDNA. In het aangewezen gebied, voeg 40 ul van Tris-HCl pH 8,0 tot elk cDNA monster om het uiteindelijke volume tot 140 ul. Voeg 2,0 ul van cDNA aan elk van de 70 putten en 2,0 ul van het water aan elk van de negatieve controles. Seal PCR-plaat. Run op thermocycler, het programma in tabel 4.
- Geneste PCR - 20ul reacties. Meng de reagentia voor de geneste PCR in het reagens lade (reagentia vermeld in tabel 3, primers weergegeven in Tabel 5).
- Voeg 18 ul van de geneste PCR-mengsel tot 73 putten op een 96 goed PCR-plaat, door meerkanaalspipet
- Verdunnen eerste PCR 1:5 en voeg 2 ul van de eerste ronde PCR om de geneste PCR. Run PCR-reactie op de thermocycler, onder de voorwaarden vermeld in tabel 4.
- Lopen monsters op een 1% agarose gel. Om ervoor te zorgen dat het merendeel van de PCR-producten zijn het resultaat van een enkel molecuul van cDNA, mag niet meer dan 30% van de putten positief zijn. Het proces is geautomatiseerd met behulp van de Beckman Coulter Biomek FM robot om de inhoud van de PCR-platen belasting met 1%, 96 wells E-gel (Invitrogen). E-gels worden uitgevoerd gedurende 7 minuten op de E-base. Volgorde producten met behulp van primers in tabel 5.
4. Representatieve resultaten:
SCA:
Alle controles moeten passeren om te denken over de HIV-1 RNA-meting te corrigeren. Als een negatieve controle is positive, moet de run worden genegeerd vanwege mogelijke besmetting. Om de controle van de verliezen van RNA tijdens de extractie stap, moet ten minste 50% van de RCA spiked in het plasma worden teruggewonnen. Als de gemiddelde RCA is <15.000 exemplaren, het monster mislukt en moeten worden genegeerd, omdat een aanzienlijk deel van de RNA kunnen verloren zijn gegaan tijdens de extractie of de andere stappen van het protocol. Dit komt voor bij ongeveer 10% van alle patiënten monsters getest waarschijnlijk te wijten aan hoge lipiden in het plasma 6. Het herstel van de RCA virus is bedoeld om te controleren voor de kwaliteit van de winning en de efficiëntie van de cDNA synthese en PCR-amplificatie. Het wordt niet gebruikt om te corrigeren voor HIV herstel sinds HIV is waarschijnlijk gebonden aan immunoglobulinen en andere menselijke eiwitten waardoor het enigszins afwijken van virus geïsoleerd uit weefselkweek. Het herstel van de RCA in ons lab was gemiddeld 25.716 + / - 4.057 kopieën / reactiemengsel, of ongeveer 95% + / -15% van de RCA-RNA 17 toegevoegd. De NRT (geen reverse transcriptase) controle is uitgevoerd in parallel om te testen voor de amplificatie van DNA. De NRT-waarde wordt afgetrokken van elk van de drie HIV-1 RNA waarden, dan is het gemiddelde berekend en indien dit aantal kleiner is dan nul (de amplificatie van DNA groter is dan de versterking van RNA), het resultaat zou mislukken en dient te worden genegeerd, omdat van het risico van de versterking van DNA in plaats van RNA. Als HIV-1 RNA is alleen maar versterkt vanaf 1 / 3 putten, hertesten van het monster wordt aanbevolen om ervoor te zorgen dat de versterking geldt voor de eigenlijke monster getest en niet het gevolg van een mogelijke verontreiniging.
Als alle controles passeren, kan de gemiddelde HIV-1 RNA kopie-aantal in het plasma worden berekend.
Voorbeeld 1: Als de gemiddelde HIV-1-kopie-aantal nul is, is de detectiegrens berekend op basis van het volume van de plasma getest. Als voorbeeld, laten we zeggen 7 ml plasma werd getest. De kleinste hoeveelheid RNA die had kunnen worden ontdekt met deze test zou zijn geweest een exemplaar in een van de putten en 0 exemplaren in de twee andere putten of een gemiddelde van 0,33 exemplaren per goed. Het gemiddeld aantal kopieën moet dan worden vermenigvuldigd met een factor van 5,5 te krijgen tot het totale aantal kopieën in de RNA-elutie (er is 10 ul in elk putje, maar de totale elutie volume was 55 ul). De ondergrens van detectie is dan: 5,5 x 0,33 kopieën gedeeld door 7ml = 1,83 / 7 = 0,3 kopieën / ml. De concentratie van HIV-1 RNA in het plasma in dit voorbeeld is <0,3 kopieën / ml.
Voorbeeld 2: HIV-1 RNA is aantoonbaar. RNA werd geëxtraheerd uit 7 ml plasma. Het gemiddeld aantal kopieën van hiv-1 RNA per goed is berekend op 2,0 exemplaren per goed. Dan het gemiddeld aantal kopieën per ml plasma is 5,5 x 2,0 kopieën / ml 7 = 1,6 HIV-1 RNA / ml plasma.
Een sjabloon in Excel sheet gebruikt voor het kopiëren getallen te berekenen kan worden gedownload van de website.
SGS:
Als een van de negatieve controles positief is de run moet vanwege mogelijke besmetting buiten beschouwing worden gelaten. Het aantal van het product van elke run zal afhangen van de viral load in elk monster en de conditie van het monster. In onze ervaring een veel lipiden of cellen in het plasma zal de kans op het verkrijgen van product. Het opslaan van de voorwaarden en vorige invriezen en ontdooien van het monster zal ook een grote invloed op het herstel van RNA. In het algemeen, bij het werken met monsters met een virale last van minder dan 50 kopieën / ml, product (banden op gel) is te verwachten in ongeveer 1 / 3 -1 / 2 van verwerkte monsters. Afhankelijk van de hierboven genoemde factoren, moet 1-5 bands per plaat worden beschouwd als een goed resultaat te wijten aan de lage virale belasting bij deze patiënten.
| cDNA-synthese (RT Cocktail / cDNA reactie) | 1 reactie | Geen reverse transcriptase (NRT) cocktail / cDNA reactie (1 reactie) |
| Moleculair-biologische kwaliteit H 2 O | 8,1 ul | 8,2 ul |
| 25 mM MgCl 2 | 6 ul | 6 ul |
| 25 mM dNTPs | 0,6 ul | 0,6 ul |
| 100 mM DTT | 0,2 ul | 0,2 ul |
| Random hexameren (0,1 ug / ul) | 1,5 ul | 1,5 ul |
| 10X TaqMan Buffer A | 3,0 ul | 3,0 ul |
| Rnasin (40 U / uL) | 0,5 ul | 0,5 ul |
| Strategene RT (200 U / ul) | 0,1 ul | Niet toe te voegen |
| Totaal | 20 ul | 20 ul |
| Monster RNA | 10 ul | 10 ul |
| Totale volume | 30 ul | 30 ul |
Tabel 1. Reactie Mixtgelen voor de cDNA synthese in Single Copy Assay.
| PCR Master Mix | 1 reactie | Primers |
| H 2 O | 15,1 ul | HIV voorwaartse primer 5'-CATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGA-3 ' |
| 10X PCR Gold Buffer | 2,0 ul | HIV reverse primer 5'-TGCTTGATGTCCCCCCACT-3 ' |
| 25 mM MgCl 2 | 2,0 ul | HIV Probe5'FAM-CCACCCCACAAGATTTAAACACCATGCTAA-Tamra 3 ' |
| * Voorwaartse primer (100 um) | 0,3 ul | |
| * Reverse Primer (100 um) | 0,3 ul | RCA Forward Primer5'-GTCAATAGAGAGAGGGATGGACAAA-3 ' |
| * Probe (100 um) | 0,05 ul | RCA Reverse Primer5'-TCCACAAGTGTAGCAGAGCCC-3 ' |
| TaqGold (5 U / ul) | 0,25 ul | RCA Probe 5'FAM-TGGGTCGGGTGGTCGTGCC-Tamra 3 ' |
| Totaal | 20,0 ul |
Tabel 2. PCR Master Mix en primers voor Single Copy Assay.
| cDNA cocktail / cDNA reacties | Een RNA-monster | Eerste PCR cocktail | Een plaat (75 reacties) | Geneste PCR cocktail | Een plaat (75 reacties) |
| 10X RT Buffer (Invitrogen) | 10 ul | 10X PCR-buffer (Invitrogen) | 75 ul | 10X PCR-buffer | 150 ul |
| 25 mM MgCl 2 | 20 ul | 50 mM MgSO 4 | 30 ul | 50 mM MgSO 4 | 60 ul |
| 0,1 M DTT | Een ul | 10 mM dNTPs | 15 ul | 10 mM dNTPs | 30 ul |
| RNase-vrij water | 17,5 ul | 50 uM primers (bis) | 3 ul | 50 uM primers (bis) | 6 ul |
| RNase-Out (Invitrogen) | Een ul | Platinum Taq Hi Fi Enzyme (Invitrogen) | 6 ul | Platinum Taq Hi Fi Enzyme (Invitrogen) | 12 ul |
| Superscript III (200 U / ul) (Invitrogen) | 0,5 ul | Moleculaire-grade water | 468 ul | Moleculaire-grade water | 1086 ul |
Tabel 1. CDNA en PCR-mengsels voor Single Genome Sequencing.
| P6-RT een PCR-programma | Env een PCR-programma |
| 1. 94 ° C gedurende 2 minuten | 1. 94 ° C gedurende 2 minuten |
| 2. 94 ° C gedurende 30 seconden | 2 0,94 ° C gedurende 30 seconden |
| 2 0,94 ° C gedurende 30 seconden | 3. 52 ° C gedurende 30 seconden |
| 4. 72 ° C gedurende 1 minuut 30 seconden | 4. 72 ° C gedurende 1 minuut |
| 5. Ga naar # 2, 44 cycli | 5. Ga naar # 2, 44 cycli |
| 6. 72 ° C gedurende 3 minuten | 6. 72 ° C gedurende 3 minuten |
| 7. 4 ° C te houden | 7. 4 ° C te houden |
| P6-RT 2 PCR-programma | Env twee PCR-programma |
| 1. 94 ° C gedurende 2 minuten | 1. 94 ° C gedurende 2 minuten |
| 2. 94 ° C gedurende 30 seconden | 2. 94 ° C gedurende 30 seconden |
| 3. 55 ° C gedurende 30 seconden | 3. 56 ° C gedurende 30 seconden |
| 4. 72 ° C gedurende 1 minuut | 4. 72 ° C gedurende 45 seconden |
| 5. Ga naar # 1, 40 (41 cycli totaal) | 5. Ga naar # 1, 40 (41 cycli totaal) |
| 6. 72 ° C gedurende 3 minuten | 6. 72 ° C gedurende 3 minuten |
| 7. 4 ° C te houden | 7. 4 ° C te houden |
Tabel 4. Thermocycler voorwaarden voor de Single Genome Sequencing Assay.
| Reactie | Grondverf | Volgorde |
| P6-RT cDNA | 3500 - | 5 'CTATTAAGTATTTTGATGGGTCATAA 3' |
| env cDNA | E115- | 5'AGAAAAATTCCCCTCCACAATTAA 3 ' |
| P6-RT: 1. PCR | 3500 - | 5 'CTATTAAGTATTTTGATGGGTCATAA 3' |
| P6-RT: 1. PCR | 1849 + | 5 'GATGACAGCATGTCAGGGAG 3' |
| P6-RT2.PCR | 1870 + | 5 'GAGTTTTGGCTGAGGCAATGAG 3' |
| P6-RT 2.PCR | 3410 - | 5 'CAGTTAGTGGTATTACTTCTGTTAGTGCTT 3' |
| env 1. PCR | E115- | 5'AGAAAAATTCCCCTCCACAATTAA 3 ' |
| env 1. PCR | E20 + | 5'GGGCCACACATGCCTGTGTACCCACAG 3 ' |
| env 2. PCR | E30 + | 5'GTGTACCCACAGACCCCAGCCCACAAG3 ' |
| env 2. PCR | E125- | 5'CAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG 3 ' |
| P6-RT sequencing | 2030 + | 5'TGTTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC 3 ' |
| P6-RT sequencing | 2600 + | 5'ATGGCCCAAAAGTTAAACAATGGC3 ' |
| P6-RT sequencing | 2610 - | 5'TTCTTCTGTCAATGGCCATTGTTTAAC3 ' |
| P6-RT sequencing | 3330 - | 5'TTGCCCAATTCAATTTTCCCACTAA 3 ' |
| env sequencing | E30 + | 5'GTGTACCCACAGACCCCAGCCCACAAG3 ' |
| env sequencing | E125- | 5'CAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG 3 ' |
Tabel 5. Primers voor de interne Genome Sequencing Assay.
Figuur 1. Overzicht van de Singe Genome Sequencing Assay (SGS).
Figuur 2. Overzicht van de Single Copy Assay (SCA).
Figuur 3. Plaat set-up voor de Single Copy Assay.
Figuur 4. Scherm schot van de ABI 7700. A. met de HIV-1 RNA standaard curve met patiënten monsters en B. met RCA standaard curve met puntige patiënten monsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HIV-1 geïnfecteerde personen op antiretrovirale combinatietherapie (CART) of die van nature de controle van de infectie hebben een zeer lage virale belasting, meestal rond een kopie per ml plasma 4, 11, 12, 17, 18. Viral load bij patiënten met een natuurlijke beheersing, vaak schommelen rond een individuele set punt 1, 2, 17. De gevoeligheid van de testen hierin beschreven is sterk afhankelijk van de input volume van het plasma. Over het algemeen hebben we gewerkt met 7 ml plasma, maar positieve resultaten kunnen worden verkregen bij kleinere hoeveelheden plasma, maar ook, afhankelijk van de feitelijke plasma viral load. De RNA-extractie methode hierin beschreven is een "home brew ', dat is arbeidsintensief. We hebben ontdekt dat deze extractie methode is zeer betrouwbaar en effectiever dan de bestaande commercieel verkrijgbare kits voor RNA-extractie. De kwaliteit van het plasma is belangrijk om product te krijgen. Vorige invriezen en ontdooien van plasma of de opslag bij temperaturen hoger dan -80 graden zal schade aan de RNA-en verminderen de kans van het product. Een "pre-spin 'van plasma is ook zeer aan te bevelen deze te scheiden van lipiden, cellen en andere bijzonderheden die kunnen interfereren met de test voor de ultra-centrifugatie.
Verschillende stappen in de protocollen zijn geautomatiseerd.
De SCA test heeft het voordeel dat ze gevoeliger zijn dan andere ultragevoelige testen, zoals bijvoorbeeld de real-time-assay beschreven door Dornadula et al.. met een lagere detectiegrens van 5,0 kopieën per ml plasma 5, de gemodificeerde Amplicor ultragevoelige test (Roche, Basel, Zwitserland) beschreven door Havlir et al.. negen sporen naar beneden tot 2,5 kopieën per ml plasma en de semi-kwantitatieve transcriptie- gemedieerde amplificatie (TMA) assay beschreven door Hatano et al.. 8 met een geschatte ondergrens van detectie van 3,5 kopieën / ml. Vergeleken met de andere ultragevoelige testen 5, 8, 9 RNA herstel in de SCA-test wordt gecontroleerd door een interne virion standaard (RCA), dat dezelfde bezinkingssnelheid bezit als HIV-1, waardoor het fungeert als een back-up virus om ervoor te zorgen dat alle virussen zijn gepelleteerd tijdens de ultracentrifugeren spin en hebben doorstaan de rest van de strenge extractieprocedure. Dit is ook erg nuttig om te helpen de mogelijkheid van een vals-negatieve detectie te elimineren. De SCA test heeft het duidelijke voordeel ten opzichte van de TMA-assay 8 van rechtstreeks kwantitatief. Echter, de SCA-test is in vergelijking met andere ultragevoelige testen zeer arbeidsintensief intensief en duur. De resultaten van de SCA-test zijn alleen betrouwbaar als alle interne controles passeren.
De single-genoom assay is de gouden standaard voor de versterking van genomen. Het heeft het voordeel ten opzichte van het klonen van het niet te worden onderworpen aan re-sampling indien het bedrag van de spanning te laag is 16 en is niet vertekend door PCR geïntroduceerd recombinatie 15. Maar SGS is beperkt door primer design dat kan vertekening die de HIV-1 populaties worden versterkt 10.
Zowel de SCA en SGS zijn sterk afhankelijk van primer design. Beide assays hier beschreven zijn ontworpen om HIV-1 subtype B. versterken Vanwege de variabiliteit binnen de B-subtype, is product niet verkregen in ongeveer 10% van de monsters als gevolg van discrepanties tussen de primers en de sjabloon. Echter, beide assays gemakkelijk worden aangepast aan andere subtypen of andere genomische regio's door het veranderen van primer design en de standaard curve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen de patiënten die deelnamen aan de vele studies van HIV-1 te erkennen.
JMC was een Research Professor van de American Cancer Society met de steun van de FM-Kirby Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Random hexamers (500 ug/ml) | Promega Corp. | C118A | |
| Taqman buffer A | Applied Biosystems | 4304441 | |
| RNAsin (40 U/ul) | Promega Corp. | N211B | |
| RT enzyme (200 U/ul) | Stratagene, Agilent Technologies | 600107-51 | |
| Amplitaq Gold DNA polymerase | Applied Biosystems | 4311814 | 6-pack |
| Amplitaq 10XGold PCR buffer II | Applied Biosystems | 4311814 | comes with the enzyme |
| Magnesiumcloride 25 mM | Applied Biosystems | 4311814 | comes with the enzyme |
| 1M Tris-HCl buffer, pH 8.0, 5 mM | Invitrogen | AM9855G | |
| Superscript III reverse transcriptase enzyme, 200 U/ul | Invitrogen | 18080-044 | |
| Superscript III 10X buffer | Invitrogen | comes with the enzyme | |
| DTT 100 mM | Invitrogen | comes with the enzyme | |
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity 5 U/ul | Invitrogen | 11304-102 | |
| 10X High Fidelity PCR Buffer | Invitrogen | 11304-102 | comes with the enzyme |
| Proteinase-K 20 mg/ml | Ambion | 2546 | |
| Guanidinium Thiocyanate solution 6M | Fluka | 50983 | |
| Glycogen 20 mg/ml | Roche Group | 10901393001 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 19516 | |
| Ethanol 70% | Sigma-Aldrich | E702-3 | |
| Molecular grade water | GIBCO, by Life Technologies | 10977-015 | |
| dNTPs (25 mmol each) | Bioline | BIO-39025 | |
| Easy Seal Centrifuge Tubes (16x73mm) | Seaton Scientific | 6041 | |
| White Delrin crowns | Seaton Scientific | 4020 | Caps for the Easy Seal Tubes |
| Tube Rack for Optiseal Bell-Top Tubes, 8.9 ml | Beckman Coulter Inc. | 361642 | |
| Hex driver ½ inc opening | Seaton Scientific | 4013 | |
| cap removal tupe | Seaton Scientific | 4014 | |
| 5 ml serological pipettes | Costar | 4051 | |
| Pipetboy | Any Supplier | ||
| 15 ml Transfer pipettes | ISC Bioexpress | P-5005-7 | |
| 5.8 ml Dispossable transfer pipettes, fine tip | VWR international | 14670-329 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Falcon BD | ||
| 1 ml centrifuge tubes | Any Supplier | ||
| Tris buffer Saline tablets | Sigma-Aldrich | T5030-100TAB | |
| Ultracentrifuge and rotor | Sorvall, Thermo Scientific | 90SE and T-1270 | |
| 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSS-9601 | |
| 50 ml Reagent reservoir | Costar | 4870 | |
| Microamp optical 96-well reaction plate | Applied Biosystems | N801-0560 | |
| Optical plate covers | Applied Biosystems | 4333183 | |
| MicroAmp Optical Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | |
| Microseal A film | Bio-Rad | MSA-5001 | |
| 2 ml centrifuge tubes | Any Supplier | ||
| 1% agarose gels (E-gel, invitrogen) | Invitrogen | G-7008-01 | |
| E-base (Invitrogen) | Invitrogen | EB-M03 | |
| EDTA Collection tubes any brand | |||
References
- Amara, R. R., Villinger, F., Altman, J. D., Lydy, S. L., O'Neil, S. P., Staprans, S. I., Montefiori, D. C., Xu, Y., Herndon, J. G., Wyatt, L. S. Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine. Vaccine. 20, 1949-1955 (2002).
- Dinoso, J., Kim, S., Blankson, J., Siliciano, R. F. Viral Dynamics of Elite Suppressors in HIV-1 Infection. Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. , (2008).
- Dinoso, J. B., Kim, S. Y., Wiegand, A. M., Palmer, S. E., Gange, S. J., Cranmer, L., O'Shea, A., Callender, M., Spivak, A., Brennan, T., Kearney, Treatment intensification does not reduce residual HIV-1 viremia in patients on highly active antiretroviral therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9403-9408 (2009).
- Doria-Rose, N. A., Klein, R. M., Manion, M. M., O'Dell, S., Phogat, A., Chakrabarti, B., Hallahan, C. W., Migueles, S. A., Wrammert, J., Ahmed, R., Nason, M., Wyatt, R. T., Mascola, J. R., Connors, M. Frequency and phenotype of human immunodeficiency virus envelope-specific B cells from patients with broadly cross-neutralizing antibodies. J. Virol. 83, 188-199 (2009).
- Dornadula, G., Zhang, H., Uitert, B. V. an, Stern, J., Livornese, L., Ingerman, M. J., Witek, J., Kedanis, R. J., Natkin, J., DeSimone, J., Pomerantz, R. J. Residual HIV-1 RNA in blood plasma of patients taking suppressive highly active antiretroviral therapy. JAMA. 282, 1627-1632 (1999).
- Gandhi, R. T., Zheng, L., Bosch, R. J., Chan, E. S., Margolis, D. M., Read, S., Kallungal, B., Palmer, S., Medvik, K., Lederman, M. M., Alatrakchi, N., Jacobson, J. M., Wiegand, A., Kearney, M., Coffin, J. M., Mellors, J. W., Eron, J. J. The effect of raltegravir intensification on low-level residual viremia in HIV-infected patients on antiretroviral therapy: a randomized controlled trial. PLoS medicine. 7, (2010).
- Gay, C., Dibben, O., Anderson, J. A., Stacey, A., Mayo, A. J., Norris, P. J., Kuruc, J. D., Salazar-Gonzalez, J. F., Li, H., Keele, B. F., Hicks, C., Margolis, D., Ferrari, G., Haynes, B., Swanstrom, R. Cross-sectional detection of acute HIV infection: timing of transmission, inflammation and antiretroviral therapy. PLoS One. 6, 19617-19617 (2011).
- Hatano, H., Delwart, E. L., Norris, P. J., Lee, T. H., Dunn-Williams, J., Hunt, P. W., Hoh, R., Stramer, S. L., Linnen, J. M., McCune, J. M., Martin, J. N., Busch, M. P., Deeks, S. G. Evidence for persistent low-level viremia in individuals who control human immunodeficiency virus in the absence of antiretroviral therapy. J. Virol. 83, 329-335 (2009).
- Havlir, D. V., Bassett, R., Levitan, D., Gilbert, P., Tebas, P., Collier, A. C., Hirsch, M. S., Ignacio, C., Condra, J., Gunthard, H. F., Richman, D. D., Wong, J. K. Prevalence and predictive value of intermittent viremia with combination hiv therapy. JAMA. 286, 171-179 (2001).
- Jordan, M. R., Kearney, M., Palmer, S., Shao, W., Maldarelli, F., Coakley, E. P., Chappey, C., Wanke, C., Coffin, J. M. Comparison of standard PCR/cloning to single genome sequencing for analysis of HIV-1 populations. J Virol Methods. 168, 114-120 (2010).
- Kaufmann, D. E., Kavanagh, D. G., Pereyra, F., Zaunders, J. J., Mackey, E. W., Miura, T., Palmer, S., Brockman, M., Rathod, A., Piechocka-Trocha, A., Baker, B., Zhu, B., Gall, S. L. e, Waring, M. T., Ahern, R., Moss, K., Kelleher, A. D. Upregulation of CTLA-4 by HIV-specific CD4+ T cells correlates with disease progression and defines a reversible immune dysfunction. Nat Immunol. 8, 1246-1254 (2007).
- Kearney, M., Maldarelli, F., Shao, W., Margolick, J. B., Daar, E. S., Mellors, J. W., Rao, V., Coffin, J. M., Palmer, S. HIV-1 Population Genetics and Adaptation in Newly Infected Individuals. J. Virol. 83, 2715-2727 (2008).
- Kearney, M., Palmer, S., Maldarelli, F., Shao, W., Polis, M. A., Mican, J., Rock-Kress, D., Margolick, J. B., Coffin, J. M., Mellors, J. W. Frequent polymorphism at drug resistance sites in HIV-1 protease and reverse transcriptase. AIDS. 22, 497-501 (2008).
- Kearney, M., Spindler, J., Shao, W., Maldarelli, F., Palmer, S., Hu, S. L., Lifson, J. D., Kewal Ramani, V. N., Mellors, J. W., Coffin, J. M., Ambrose, Z. Genetic diversity of simian immunodeficiency virus encoding HIV-1 reverse transcriptase persists in macaques despite antiretroviral therapy. Journal of Virology. 85, 1067-1076 (2011).
- Keele, B. F., Giorgi, E. E., Salazar-Gonzalez, J. F., Decker, J. M., Pham, K. T., Salazar, M. G., Sun, C., Grayson, T., Wang, S., Li, H., Wei, X., Jiang, C., Kirchherr, J. L., Gao, F., Anderson, J. A., Ping, L. H., Swanstrom, R. Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 105-7552 (2008).
- Liu, S. L., Rodrigo, A. G., Shankarappa, R. G., Learn, H., Hsu, L., Davidov, O., Zhao, L. P., Mullins, J. I. HIV quasispecies and resampling. Science. 273, 415-416 (1996).
- Mahalanabis, M., Jayaraman, P., Miura, T., Pereyra, F., Chester, E. M., Richardson, B., Walker, B., Haigwood, N. L. Continuous viral escape and selection by autologous neutralizing antibodies in drug-naive human immunodeficiency virus controllers. J. Virol. 83, 662-672 (2009).
- Migueles, S. A., Connors, M. The Role of CD4(+) and CD8(+) T Cells in Controlling HIV Infection. Curr. Infect. Dis. Rep. 4, 461-467 (2002).
- Palmer, S., Kearney, M., Maldarelli, F., Halvas, E. K., Bixby, C. J., Bazmi, H., Rock, D., Falloon, J., Davey, R. T., Dewar, R. L., Metcalf, J. A., Hammer, S., Mellors, J. W., Coffin, J. M. Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis. J. Clin. Microbiol. 43, 406-413 (2005).
- Palmer, S., Wiegand, A. P., Maldarelli, F., Bazmi, H., Mican, J. M., Polis, M., Dewar, R. L., Planta, A., Liu, S., Metcalf, J. A., Mellors, J. W., Coffin, J. M. New real-time reverse transcriptase-initiated PCR assay with single-copy sensitivity for human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma. J. Clin. Microbiol. 41, 4531-4536 (2003).
