Summary
플라즈마 및 시퀀싱에서 HIV - 1 RNA 수준을 Quantifying하면 단일 HIV - 1 검출 한계 (50-75 사본 / ML) 아래 바이러스성로드와 개인의 genomes가 어렵습니다. 여기 우리는 안정적으로 0.3 복사 / ML에 HIV - 1 RNA를 측정하고 매우 낮은 바이러스성로드와 샘플에서 단일 게놈 시퀀싱에 의해 바이러스 genomes를 증폭하는 방법을 실시간 PCR 분석을 사용하여 플라즈마 바이러스 RNA를 추출하고 계량하는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
바이러스 유전자를 확장 및 표준 assays에 의해 검출 한계 (아래 50-75 사본 / ML) 아래 바이러스성로드와 HIV - 1 감염 개인의 HIV - 1 RNA를 quantifying 것은 환자의 바이러스성 역학 및 바이러스 호스트 상호 작용에 대한 통찰력을 얻기 위해 필요한 사람 자연 감염과 조합 antiretroviral 치료 (카트)에있는 사람을 제어합니다.
여기 하나의 게놈 시퀀싱 (SGS 프로토콜) 13, 19 및 정확하게 낮은 바이러스성로드 (단일 복사본 분석 (SCA) 프로토콜) 12, 20 환자에서 HIV - 1 RNA를 수치로 바이러스 genomes를 증폭하는 방법에 대해 설명합니다.
단일 복사본 분석이 감도는 플라즈마가 assayed되는 볼륨에 따라과 실시간 PCR 분석이다. 단일 바이러스 게놈은 플라즈마 7 ML에 감지되면 RNA 사본 번호는 0.3 복사 / ML 것으로보고됩니다. 분석은 RNA 추출의 효율성을위한 내부 통제 테스트를 가지고 있으며, DNA 또는 오염 가능성 증폭을위한 제어합니다. 환자 표본 세중의 단위로 측정됩니다.
단일 게놈 시퀀싱 분석 (SGS), 현재 널리 사용하고 이외의 노동 집약적인 3, 7, 12, 14, 15로 간주는 끝점이 cDNA 제품이 96 자 이상 전염됩니다 희석하는, 제한 희석 분석입니다 판. Poisson 분포에 따르면, 적은 우물의 1 / 3 이상이 제품을 줄 때, 하나의 cDNA 분자에서 증폭의 PCR 제품되는 결과의 80 % 기회가 있습니다. SGS는 resampling의 대상이되지 및 PCR - 도입된 재조합 19 적이어서하지 복제를 통해 장점이 있습니다. 그러나, SCA와 SGS의 증폭 성공 프라이머 설계에 따라 달라집니다. 두 assays는 HIV - 1 subtype B에 대한 개발되었다지만, 변화 primers, 프로브 및 표준에 의해 다른 subtypes와 게놈의 다른 지역에 적용할 수 있습니다.
Protocol
1. 플라즈마의 큰 볼륨에서 RNA의 추출
단일 복사본 분석 (SCA)의 개요 및 단일 게놈 시퀀싱 (SGS) 프로토콜은 그림 1과 2에 제공됩니다.
- 플라즈마 7 ML을 얻으려면, 제동없이 15 분 동안 2,600 XG에 (헤파린되지 않음) 수집 튜브를 15 ML EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에서 수집된 혈액의 약 14 ML을 돌린다. 피펫 플라즈마 (버피 코트 레이어를하지 않아야 만들기) 15 ML 튜브로.
- RNA는 단일 복사본 분석 (SCA), 스파이크 Rous 육종 바이러스 내부 virion 제어 (RCAS)의 30000 사본 플라즈마에 대한 추출하는 경우. RCAS 바이러스는 SCA대로 (20) 앞에서 설명한 수행하기 전에 준비가되어 있습니다. 간단히, 세포 배양 표면에 뜨는에서 RCAS 바이러스는 RT 활동에 의해 계량 5% FBS와 RPMI 조직 문화 미디어에 희석 200 UL 당 30,000 virions의 최종 농도로 희석하고, -80에서 ° C 단일 사용 aliquots에 저장됩니다. RCAS 바이러스는 냉동 / 분석에서 사용하기 전에 해동해서는 안됩니다. RCAS은 RNA 추출의 효율성과 PCR의 부량의 정확성을 위해 제어 환자 플라즈마에 아군이다. : RCAS에 대한 자세한 내용은 다음 링크에서 찾을 수 있습니다 http://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/ .
- "사전 스핀"플라즈마, 15 ML 원뿔 원심 튜브에 RNA의 정확한 양을 정함 방해할 수있는 lipids와 세포 부스러기를 밖으로 분리하는 15 분 동안 2,600 XG에.
- 샘플 번호와 펠렛은 튜브 형태로 될 위치를 식별할 수있는 영구 마커와 라벨 Seton 간편한 인감 원심 분리기 튜브. 사전 스핀 후, 플라즈마를 pipetting과 표면에있는 세포 파편 및 / 또는 lipids를 피함으로써 Seton 쉬운 인감 원심 튜브에 플라즈마를 전송할 수 있습니다. 플라즈마의 입력 볼륨을 기록합니다.
- 추가 트리스 버퍼 염분 (TBS)은 스레드 목의 하단에 Seton - 쉬운 인감 튜브의 나머지 볼륨을 채울 수 있습니다. 방울은 튜브에 존재하거나 튜브가 초원 심 분리기에 막을 수 있는지 확인하십시오. 회전자에 튜브를 삽입하면 튜브의 표시가 외부에 직면하고 있는지 확인합니다.
- 4 170,000 XG (50,000 RPM) · 30 분 C에서 Sorval 90SE 초원 심 분리기에 미리 냉각 Sorval T1270 로터와 원심 분리기에서 재사용 가능한 뚜껑과 장소 샘플 인감.
- 원심 분리가 뜨는 제거하고 바이러스 펠릿 (이것은 표시되지 않습니다) 90 UL 분자 학년 물 10 UL proteinase - K을 (20 MG / ML) 추가하면.
- 30 분 55 ° C 물 목욕과 부화에 넣어 튜브. 튜브가 펠렛과 측면이 proteinase - K와 물이 혼합에 잠겨 있도록 각도로 설정되어 있는지 확인합니다.
- 부화 후 곧 관의 하단에있는 모든 액체를 수집하는 테이블 톱 원심 분리기에있는 튜브를 스핀 (5 초) 및 6M guanidinium thiocyanate 솔루션의 315 UL 20 MG / ML 글리코겐의 10 UL (주 추가 : 적절한 따라 이 유해 물질에 대한 처리 지침은;) 표백 제나 산로 믹스와 별도의 용기에 배출하지 않습니다.
- 가볍게 소용돌이 (5 초)을 곧 스핀. 상온에서 10 분 부화 후 새로 표시 1.5 ML RNAse 무료 원심 분리기 튜브 각 튜브의 내용을 전송할 수 있습니다.
- 상온에서 30 분 21,000 XG 10 초 원심 각 튜브, 소용돌이에 분자 학년 이소 프로필 알코올의 495 UL을 추가합니다.
- 뜨는을 취소하고 70 % 에탄올 500 UL를 추가합니다.
- 상온에서 15 분 동안 21,000 XG 10 초 원심 분리기를위한 와동. 전송 피펫과 에탄올을 제거합니다. 다시 스핀과 피펫과 잔여 에탄올을 제거합니다. 항공은 10 분 건조. (SGS 프로토콜 5 MM 트리스 - HCL pH를 8.0 40 UL에서 RNA를 용해하고, SGS 프로토콜을 계속 들어.)
- RNA - 버퍼의 55 UL에서 펠렛을 풀다. RNA - 버퍼가 100 MM의 DTT 10 UL 40 U / UL Rnasin 25 UL 추가하여 얻은 965 UL 트리스 - HCL (산도 8.0, 5 ㎜). 얼음 놓습니다.
2. 단일 복사본 분석
96 - 웰 플레이트는 HIV와 RCAS 표준 및 컨트롤을 모두 포함하여 8 환자의 샘플을 보유하고 있습니다. 이 프로토콜은 하나의 접시의 설정을 설명합니다.
- HIV - 1 RNA 및 RNA RCAS의 성적표는 RNA 표준 곡선을위한 희석 수있는 1 ML RNA - 버퍼 2 aliquots을 준비하여 시작합니다. RNA - 버퍼는 1.13 이하 설명합니다.
- 2 ML의 원심 분리기 튜브의 얼음에 dilutions를 준비합니다. 54 UL RNA - 버퍼는 3x10 5 부 / UL를 제공하기 위해 HIV - 1 RNA 주식 (1x10 6 부 / UL)의 25 UL 추가하여 RNA - 버퍼에서 HIV - 1 RNA의 성적의 절반 로그 dilutions을 만듭니다.
- 10 UL (주 당 0.3 사본을 연속 절반 로그 dilutions을 (25 UL + 54 UL) 아래함으로써 계속 : 0.3, 1, 3 dilutions이에 대한 분석 기간 동안의 표준 곡선의 일부가되지 않습니다은 추정 값으로 사용됩니다 그리고는 신원 미상의 두어로 설정해야ING 분석). RCAS 성적 증명서는 사본 1x10 6 / UL에서 갖춰져 있습니다. 마찬가지로, RNA - 버퍼 RCAS의 성적의 절반 로그 dilutions을 준비하지만, 아래로 100 사본 10 UL 당.
- 로 표 1에 나와있는 cDNA 합성을위한 RT 칵테일을 준비합니다. RT 및 전송 중에 발생할 수있는 손실의 계정에 추가 조금을하기 위해 염두에두고 유지 표 1에 나열된대로 NRT 반응을 준비합니다. 참고 : NRT의 칵테일, RT 효소가 DNA의 증폭에 대한 제어 물로 대체됩니다.
참고 :이 단계는 최근 Qiagen 로봇 (원래 Corbett)에 설정 판 이외에 자동화되었습니다. - 각 잘하는 RT 반응 혼합물 20 UL를 추가하여, 광학 96 - 웰 플레이트 (그림 3 참조)를 설정합니다. 표시된 8 우물에서 "NRT,"반대 transcriptase (NRT 반응 혼합물)없이 칵테일을 추가합니다. 접시에 칵테일을 추가하면, 우물 표시 "아니 템플릿 컨트롤 (NTC)"물을 10 UL를 추가합니다. 그림 3 농도에서 "HIV"이라는 우물에 HIV의 성적 10 UL을 추가합니다. 따라 농도에서 "RCAS"이라는 우물에 RCAS 성적 증명서 10 UL을 추가합니다. 판 다이어그램에서 "샘플"이라는 3 인접 우물에서 환자 샘플의 10 UL을 추가합니다. 표시된 우물에 eluted 샘플 10 UL 추가 'NRT. " 동일한 샘플 5 UL 및 표시된 우물 물을 5 UL 추가 "내부 통제를."
- 번호판을 봉인하고시 thermocycler에서 실행 : 25 ° C 15 분, 42 ° 40 분 거리, 85은 10 분 ° C, 25 ° C 30 분, 5 ° C 개최를위한 C.
- 준비 PCR 마스터는 표 2에 따라 혼합.
- cDNA 합성이 완료되면, cDNA를 사용하여 지정된 장소로 이동합니다. 이 지정된 영역에서 HIV와 RCAS 모두 cDNA 접시의 각각 잘 수있는 PCR 마스터 믹스 20 UL를 추가합니다. 모든 가능한 오염을 방지하기 위해 지정된 지역에서이 단계를 수행하는 것이 중요합니다.
- 스핀 플레이트, 광학 담요 (ABI 7700에만 필요한 담요)와 ABI 또는 Roche는 광학 커버 및 커버 인감. Roche는 480 또는 ABI 7700에서 실행됩니다. PCR 조건 : 95 ° C 10 분 후, 95 45 사이클 ° 15 초 동안 C, 60 ° 1 분 C. 별도 분석 RCAS와 HIV가 필요합니다. 결과의 예는 그림 4에 표시됩니다. 표준 곡선의 기울기는 낮은 사본 번호 성적의 정상적인 Poisson 분포에 의해 영향을받을 것입니다. 으로 설정하는 표준 곡선이 낮은 복사 번호 기준 (0.3, 1, 3 부)에 대한 가장 정확한 기울기를 보장하기 위해서는 "신원 미상."17
3. 단일 게놈 시퀀싱
- cDNA 합성. 10 MM dNTPs 5 UL과 96 잘 PCR 플레이트 (Biorad)에 잘 수있는이 MM 유전자 특정 프라이머 (POL 또는 환경을) 5 UL을 추가합니다. 압축을 푼 RNA의 40 UL을 추가합니다. 인감 플레이트.
- 10 분 65시 thermocycler에있는 RNA - 혼합 ° C를 변성.
- 표 3에 나열 cDNA 합성에 대한 시약을 섞는다. denaturing 단계 후, 얼음에 PCR 플레이트를 삽입 각 샘플에 대한 cDNA 혼합물의 50 UL을 추가합니다.
- thermocycler에서 PCR 플레이트 실행 45 ° 50 분, 85 C ° 10 분 4 ° C 개최를위한 C.
- 첫 번째 PCR, 10 UL 반응. p6 - RT 또는 환경을 (표 3에 나열 시약, 표 5에 나열된 primers)의 첫 라운드 증폭을위한 중 primers를 사용하여 시약 트레이의 PCR 반응 혼합물을 준비합니다.
- 멀티 채널 피펫을 사용하면 96 잘 PCR 플레이트 (70 샘플 3 부정적 컨트롤)에 PCR 혼합물 73 우물에의 8.0 UL 하는걸.
- cDNA 합성이 완료되면 cDNA를 사용하여 지정된 지역으로 PCR 반응 혼합물을 포함하고있는 cDNA와 PCR 플레이트를 이동합니다. 지정된 영역에서 140 UL에 최종 볼륨을 가져 각 cDNA 샘플로 트리스 - HCL pH를 8.0 40 UL를 추가합니다. 부정적인 컨트롤 각각 70 우물과 물 2.0 UL 각 cDNA의 2.0 UL을 추가합니다. 인감 PCR 플레이트. thermocycler, 표 4에서 프로그램을 실행합니다.
- 중첩된 PCR - 20ul 반응. 시약 트레이 (표 3에 나열 시약, 표 5에 나열된 primers)에 중첩 PCR을위한 시약을 섞는다.
- 멀티채널 피펫으로 96 잘 PCR 플레이트에 73 우물에 중첩된 PCR 혼합물 18 UL 추가
- 첫번째 PCR 1:5 희석하여 중첩 PCR에 첫 라운드 PCR 2 UL를 추가합니다. 표 4에 나열된 조건 하에서 thermocycler에 PCR 반응을 실행합니다.
- 1 % 아가로 오스 겔에서 샘플을 실행합니다. PCR 제품의 대부분은 cDNA의 단일 분자의 결과 있는지 확인하려면 우물을 더 이상 30 %가 긍정되어야합니다. 이 과정은 1 % PCR 플레이트의 내용을로드하는 베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 Biomek FM 로봇을 사용하여 자동으로되어, 96 우물 E - 젤 (Invitrogen). E - 젤은 E -베이스 7 분 동안 실행됩니다. 표 5에 나열된 primers를 사용하여 시퀀스 제품.
4. 대표 결과 :
SCA :
모든 컨트롤은 HIV - 1 RNA 측정이 정확 고려하기 위해 통과해야합니다. 부정적인 제어 positi 경우적, 실행 때문에 가능한 오염의 무시해야합니다. 추출 단계에서 RNA의 손실을 제어하기 위해서는 플라즈마의 아군 RCAS의 적어도 50 %는 회복되어야합니다. 평균 RCAS는 <15,000 복사본이있는 경우 예제는 실패하고 RNA의 상당한 금액이 추출 또는 프로토콜의 다른 단계 도중에 분실되었을 수 있기 때문에 무시한다. 이것은 가능성으로 인해 플라즈마 6 높은 lipids 테스트를 모든 환자 샘플의 10 % 정도에서 발생합니다. RCAS 바이러스의 복구는 추출 및 cDNA 합성 및 PCR 증폭의 효율성의 품질을 제어하기위한 것입니다. 그것은 HIV가 면역 글로불린 가능성과 조직 문화에서 분리된 바이러스는 약간 다른하는 다른 인간 단백질에 바인딩되어 있기 때문에 HIV 복구를 위해 해결하기 위해 사용되지 않습니다. 4057 복사 / 반응 혼합물, 또는 95 % + / RCAS RNA의 -15 % 17 추가 - 우리가 실험실에서 RCAS의 복구는 평균 25,716에 + /이되었다. NRT (NO 반대 transcriptase) 제어 DNA의 증폭을 위해 시험하기 위해 병렬로 실행됩니다. NRT 값이 세 HIV - 1 RNA 값 각 빼서는 다음 평균 계산이 숫자 영 (DNA의 증폭은 RNA의 증폭을 초과)보다 적은 경우, 결과는 실패 것이고 무시해야하기 때문에 대신 RNA보다 DNA에서 증폭의 위험. HIV - 1 RNA에만, 3분의 1 웰즈에서 증폭하는 경우 다시 테스트 샘플은 증폭이 실제 예제는 가능한 오염 물질로 인해하지 assayed 및 것에 대해 사실 확인하는 것이 좋습니다.
모든 컨트롤 통과하면, 플라즈마의 평균 HIV - 1 RNA 사본 번호를 계산하실 수 있습니다.
예제 1 : 평균 HIV - 1 부 번호가 0 인 경우, 검출 한계는 플라즈마의 볼륨 assayed에 따라 계산됩니다. 예를 들어,하자 플라즈마 7 ML이 assayed했다고. 이 분석과 감지 할 수 RNA의 작은 금액은 물론 당 0.33 사본의 평균을주는 두 가지 다른 우물에서 우물과 0의 사본 하나에 1 부 수도 있었을 텐데. 평균 복사 번호는 다음 RNA의 용출에 총 사본 번호 (가 각 물론 10 UL은 있지만, 전체 용출 량이 55 UL했습니다)에 도착하는 5.5의 요소를 곱한 수 있습니다. 감지의 하한선은 다음이다 : 5.5 7ml = 1.83 / 7 = 0.3 복사 / ML로 나눈 X 0.33 복사합니다. 이 예제에서 플라즈마에서 HIV - 1 RNA의 농도는 <0.3 부 / ML했다.
예제 2 : HIV - 1 RNA가 감지됩니다. RNA는 플라즈마 7 ML에서 추출한했다. HIV - 1 RNA마다의 평균 사본 번호가 좋지 당 2.0 복사본으로 계산됩니다. 그렇다면 플라즈마의 ML 당 평균 사본 번호는 5.5 X 2.0 부 / 7 ML = 1.6 HIV - 1 RNA / 플라즈마의 ML.
복사 숫자를 계산하는 데 사용 템플릿 엑셀 시트는 아래 웹사이트에서 로드할 수 있습니다.
SGS :
부정적인 컨트롤 중 하나가 긍정적인 경우 실행 가능한 오염으로 인해 무시해야합니다. 각 실행에서 제품의 숫자는 각 샘플의 바이러스로드 및 샘플의 상태에 따라 달라집니다. 우리의 경험에서 플라즈마 lipids 또는 세포의 많은 제품을 얻기의 기회를 줄일 수 있습니다. 조건 및 이전 동결을 저장하고 샘플 해동하는 것도 크게 RNA의 회복에 영향을 미칠 것이다. 일반적으로, 50 사본 / ML, 제품 (젤에 밴드) 아래 바이러스성로드와 함께 샘플 작업을 할 때 처리하는 샘플의 1 / 3 -1 / 2에 대한 예상이됩니다. 위에서 언급한 요인에 따라 강판 당 1-5 밴드는이 환자에있는 낮은 바이러스 부하로 인해 좋은 결과를 고려하여야한다.
| cDNA 합성 (RT 칵테일 / cDNA 반응) | 한 반응 | 아무도 반대 transcriptase 없음 (NRT) 칵테일 / cDNA 반응 (1 반응) |
| 분자 학년 H 2 O | 8.1 UL | 8.2 UL |
| 25 MM MgCl 2 | 6 UL | 6 UL |
| 25 MM dNTPs | 0.6 UL | 0.6 UL |
| 100 MM DTT | 0.2 UL | 0.2 UL |
| 무작위 Hexamers (0.1 ug / UL) | 1.5 UL | 1.5 UL |
| 10X TaqMan 버퍼 | 3.0 UL | 3.0 UL |
| Rnasin (40 U / UL) | 0.5 UL | 0.5 UL |
| Strategene RT (200 U / UL) | 0.1 UL | 추가하지 마십시오 |
| 합계 | 20 UL | 20 UL |
| 샘플 RNA | 10 UL | 10 UL |
| 총 부피 | 30 UL | 30 UL |
표 1. 반응 mixt단일 복사본 분석에서 cDNA 합성을위한 ures.
| PCR 마스터 믹스 | 한 반응 | Primers |
| H 2 O | 15.1 UL | HIV 앞으로의 프라이머 5' - CATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGA - 3 ' |
| 10X PCR 골드 버퍼 | 2.0 UL | HIV의 역방향 프라이머 5' - TGCTTGATGTCCCCCCACT - 3 ' |
| 25 MM MgCl 2 | 2.0 UL | HIV Probe5'FAM - CCACCCCACAAGATTTAAACACCATGCTAA - TAMRA 3 ' |
| * 앞으로 프라이머 (100 음) | 0.3 UL | |
| * 역방향 프라이머 (100 음) | 0.3 UL | 앞으로 RCAS Primer5' - GTCAATAGAGAGAGGGATGGACAAA - 3 ' |
| * 프로브 (100 음) | 0.05 UL | RCAS는 Primer5' - TCCACAAGTGTAGCAGAGCCC - 3 '을 거꾸로 |
| TaqGold (5 U / UL) | 0.25 UL | RCAS 프로브 5'FAM - TGGGTCGGGTGGTCGTGCC - TAMRA 3 ' |
| 합계 | 20.0 UL |
표 2. PCR 마스터 믹스와 싱글 복사 분석을위한 primers.
| cDNA 칵테일 / cDNA 반응 | 1 RNA 샘플 | 첫 번째 PCR 칵테일 | 1 판 (75 반응) | 중첩된 PCR 칵테일 | 1 판 (75 반응) |
| 10X RT 버퍼 (Invitrogen) | 10 UL | 10X PCR 버퍼 (Invitrogen) | 75 UL | 10X PCR 버퍼 | 150 UL |
| 25 MM MgCl 2 | 20 UL | 50 MM MgSO 4 | 30 UL | 50 MM MgSO 4 | 60 UL |
| 0.1M DTT | 1 UL | 10 MM dNTPs | 15 UL | 10 MM dNTPs | 30 UL |
| RNase없는 물 | 17.5 UL | 50 음 primers (EA) | 3 UL | 50 음 primers (EA) | 6 UL |
| Rnase - 출력 (Invitrogen) | 1 UL | 플래티넘 DNA 형성 촉매 안녕 Fi를 효소 (invitrogen) | 6 UL | 플래티넘 DNA 형성 촉매 안녕 Fi를 효소 (Invitrogen) | 12 UL |
| 윗첨자 III (200 U / UL) (invitrogen) | 0.5 UL | 분자 수준의 물 | 468 UL | 분자 수준의 물 | 1086 UL |
표 1. cDNA와 단일 게놈 시퀀싱을위한 PCR 혼합물.
| P6 - RT 한 PCR 프로그램 | 환경을 한 PCR 프로그램 |
| 1. 이분에 대해 94 ° C | 1. 이분에 대해 94 ° C |
| 2. 30 초 동안 94 ° C | 30 초 동안 2 0.94는 ° C |
| 30 초 동안 2 0.94는 ° C | 3. 30 초 동안 52 ° C |
| 4. 72 ° C 일분 30 초 | 4. 1 분 72 ° C |
| 5. 44주기, # 2로 이동 | 5. 44주기, # 2로 이동 |
| 6. 72 ° C 3 분 | 6. 72 ° C 3 분 |
| 7. 4 ° C 개최 | 7. 4 ° C 개최 |
| P6 - RT PCR이 프로그램 | 환경을 두 PCR 프로그램 |
| 1. 2 분 동안 94 ° C | 1. 2 분 동안 94 ° C |
| 2. 30 초 동안 94 ° C | 2. 30 초 동안 94 ° C |
| 3. 30 초 동안 55 ° C | 3. 30 초 동안 56 ° C |
| 4. 1 분 72 ° C | 4. 72 ° C 45 초 동안 |
| 5. # 1, 40 (41 사이클 총)로 이동 | 5. # 1, 40 (41 사이클 총)로 이동 |
| 6. 72 ° C 3 분 | 6. 72 ° C 3 분 |
| 7. 4 ° C 개최 | 7. 4 ° C 개최 |
단일 게놈 시퀀싱 분석을위한 표 4. Thermocycler 조건.
| 반응 | 뇌관 | 순서 |
| P6 - RT cDNA | 3500 - | 5 'CTATTAAGTATTTTGATGGGTCATAA 3' |
| cDNA 환경을 | E115 - | 5'AGAAAAATTCCCCTCCACAATTAA 3 ' |
| P6 - RT 1. PCR | 3500 - | 5 'CTATTAAGTATTTTGATGGGTCATAA 3' |
| P6 - RT 1. PCR | 1849 + | 5 'GATGACAGCATGTCAGGGAG 3' |
| P6 - RT2.PCR | 1870 + | 5 'GAGTTTTGGCTGAGGCAATGAG 3' |
| P6 - RT 2.PCR | 3410 - | 5 'CAGTTAGTGGTATTACTTCTGTTAGTGCTT 3' |
| 환경을 1. PCR | E115 - | 5'AGAAAAATTCCCCTCCACAATTAA 3 ' |
| 환경을 1. PCR | E20 + | 5'GGGCCACACATGCCTGTGTACCCACAG 3 ' |
| 환경을 2. PCR | E30 + | 5'GTGTACCCACAGACCCCAGCCCACAAG3 ' |
| 환경을 2. PCR | E125 - | 5'CAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG 3 ' |
| P6 - RT 시퀀싱 | 2030 + | 5'TGTTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC 3 ' |
| P6 - RT 시퀀싱 | 2600 + | 5'ATGGCCCAAAAGTTAAACAATGGC3 ' |
| P6 - RT 시퀀싱 | 2610 - | 5'TTCTTCTGTCAATGGCCATTGTTTAAC3 ' |
| P6 - RT 시퀀싱 | 3330 - | 5'TTGCCCAATTCAATTTTCCCACTAA 3 ' |
| 환경을 시퀀싱 | E30 + | 5'GTGTACCCACAGACCCCAGCCCACAAG3 ' |
| 환경을 시퀀싱 | E125 - | 5'CAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG 3 ' |
단일 게놈 시퀀싱 분석을위한 표 5. Primers.
그림 1. 그을음의 게놈 시퀀싱 분석 (SGS)의 개요.
그림 2. 단일 복사본 분석 (SCA)의 개요.
그림 3. 단일 복사본 분석을위한 설정 플레이트.
그림 4. ABI 7700에서 촬영 화면. A.이 엄청난 환자 샘플 RCAS 표준 곡선을 보여주는 환자의 샘플 및 B.있는 HIV - 1 RNA 표준 곡선을 보여주는.
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Discussion
HIV - 1 감염을 자연스럽게 제어 감염 조합 antiretroviral 치료에 대한 개인 (카트) 또는 매우 낮은 바이러스성로드, 플라즈마 4, 11, 12, 17, 18 ML 당 일반적으로 한 주변의 복사본을 가지고. 자연 컨트롤과 환자의 바이러스성로드는 종종 개인의 세트 포인트 1, 2, 17 주변 변동. assays의 감도는 여기에 플라즈마의 입력 볼륨에 크게 의존 설명했다. 일반적으로, 우리는 플라즈마 7 ML로 일하고 있지만, 긍정적인 결과는 실제 플라즈마 바이러스 부하에 따라,뿐만 아니라, 플라즈마의 작은 양의에서 얻을 수있다. 여기 설명되어있는 RNA 추출 방법은 노동 집중되는 "홈 BREW"입니다. 우리는이 추출 방법은 매우 안정적이고 RNA 추출에 대한 기존의 상용 키트보다 효과적인 것으로 나타났습니다. 플라즈마의 품질 제품을 얻을 것이 중요합니다. 이전 동결 혈장의 융해 또는 -80도 이상의 온도에서 저장은 RNA에 손상을 제품의 가능성을 줄일 수 있습니다. 플라즈마의 "사전 스핀"는 매우 lipids, 전지 및 울트라 원심 분리하기 전에 분석을 방해할 수있는 다른 particularities를 분리하는 것이 좋습니다.
프로토콜의 여러 단계를 자동으로되었습니다.
SCA 분석은 예를 Dornadula 외 의해 설명되어있는 실시간 분석을위한 다른 ultrasensitive assays보다 더 민감한되는 장점이 있습니다. 플라즈마 5 ML 당 5.0 사본의 탐지 낮은 한도, 수정된 Amplicor ultrasensitive 분석은 (Roche는, 바젤, 스위스) Havlir 외 의해 설명되어 있습니다. 9 2.5 플라즈마의 ML 당 사본과 반 정량 전사 -로 검출 중재 증폭 (TMA) 분석은 Hatano 외 의해 설명되어 있습니다. 8 3.5 복사 / ML의 검출의 예상 낮은 한도. 다른 ultrasensitive assays 5, 8에 비해 SCA 분석 9 RNA 복구가 HIV - 1과 같은 침강 속도를 가지고 내부 virion 표준 (RCAS)에 의해 감시, 따라서 그것은 모든 바이러스를 보장하기 위해 백업 바이러스의 역할 ultracentrifugation 회전 중에 pelleted되었으며 엄격한 추출 절차의 나머지 부분을 참아 냈습니다. 이것은 거짓 부정적인 탐지의 가능성을 제거 도움도 매우 유용합니다. SCA 분석 직접 양적되는 TMA 분석 8 이상의 명백한 장점이 있습니다. 그러나 SCA 분석은 매우 노동 강렬하고 비싼 다른 ultrasensitive assays 비교합니다. 모든 내부 컨트롤 통과하면 SCA 분석의 결과는 신뢰할 수 있습니다.
단일 게놈 분석은 genomes의 증폭을위한 황금 표준입니다. 그것은 입력의 양이 16 낮은과 PCR 소개 재조합 15 일까지 편견되지 않는 경우 다시 샘플링의 대상이되지 않습니다의 복제를 통해 장점이 있습니다. 그러나 SGS는 프라이머 설계에 의해 제한되는 편견은 어느 HIV - 1 인구가 10 증폭 않을 수 있습니다.
SCA와 SGS 모두 뇌관 디자인에 크게 의존하고 있습니다. 두 assays 여기서 설명하는 것은 때문에 B의 subtype 내에서 다양성의 HIV - 1 subtype의 B를 증폭하도록 설계되었습니다, 제품 때문에 primers와 템플릿 간의 불일치의 샘플의 약 10 % 얻을 수 없습니다. 그러나 두 assays 쉽게 변화 뇌관 설계 및 표준 곡선 다른 subtypes 또는 기타 게놈 지역에 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 HIV - 1의 많은 연구에 참여한 환자를 인정하고 싶습니다.
JMC는 FM 커비 재단의 지원으로 미국 암 협회의 연구 교수되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Random hexamers (500 ug/ml) | Promega Corp. | C118A | |
| Taqman buffer A | Applied Biosystems | 4304441 | |
| RNAsin (40 U/ul) | Promega Corp. | N211B | |
| RT enzyme (200 U/ul) | Stratagene, Agilent Technologies | 600107-51 | |
| Amplitaq Gold DNA polymerase | Applied Biosystems | 4311814 | 6-pack |
| Amplitaq 10XGold PCR buffer II | Applied Biosystems | 4311814 | comes with the enzyme |
| Magnesiumcloride 25 mM | Applied Biosystems | 4311814 | comes with the enzyme |
| 1M Tris-HCl buffer, pH 8.0, 5 mM | Invitrogen | AM9855G | |
| Superscript III reverse transcriptase enzyme, 200 U/ul | Invitrogen | 18080-044 | |
| Superscript III 10X buffer | Invitrogen | comes with the enzyme | |
| DTT 100 mM | Invitrogen | comes with the enzyme | |
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity 5 U/ul | Invitrogen | 11304-102 | |
| 10X High Fidelity PCR Buffer | Invitrogen | 11304-102 | comes with the enzyme |
| Proteinase-K 20 mg/ml | Ambion | 2546 | |
| Guanidinium Thiocyanate solution 6M | Fluka | 50983 | |
| Glycogen 20 mg/ml | Roche Group | 10901393001 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 19516 | |
| Ethanol 70% | Sigma-Aldrich | E702-3 | |
| Molecular grade water | GIBCO, by Life Technologies | 10977-015 | |
| dNTPs (25 mmol each) | Bioline | BIO-39025 | |
| Easy Seal Centrifuge Tubes (16x73mm) | Seaton Scientific | 6041 | |
| White Delrin crowns | Seaton Scientific | 4020 | Caps for the Easy Seal Tubes |
| Tube Rack for Optiseal Bell-Top Tubes, 8.9 ml | Beckman Coulter Inc. | 361642 | |
| Hex driver ½ inc opening | Seaton Scientific | 4013 | |
| cap removal tupe | Seaton Scientific | 4014 | |
| 5 ml serological pipettes | Costar | 4051 | |
| Pipetboy | Any Supplier | ||
| 15 ml Transfer pipettes | ISC Bioexpress | P-5005-7 | |
| 5.8 ml Dispossable transfer pipettes, fine tip | VWR international | 14670-329 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Falcon BD | ||
| 1 ml centrifuge tubes | Any Supplier | ||
| Tris buffer Saline tablets | Sigma-Aldrich | T5030-100TAB | |
| Ultracentrifuge and rotor | Sorvall, Thermo Scientific | 90SE and T-1270 | |
| 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSS-9601 | |
| 50 ml Reagent reservoir | Costar | 4870 | |
| Microamp optical 96-well reaction plate | Applied Biosystems | N801-0560 | |
| Optical plate covers | Applied Biosystems | 4333183 | |
| MicroAmp Optical Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | |
| Microseal A film | Bio-Rad | MSA-5001 | |
| 2 ml centrifuge tubes | Any Supplier | ||
| 1% agarose gels (E-gel, invitrogen) | Invitrogen | G-7008-01 | |
| E-base (Invitrogen) | Invitrogen | EB-M03 | |
| EDTA Collection tubes any brand | |||
References
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