Targeting bulbus olfactorius Neuronen gebruik van Gecombineerd In Vivo Elektroporatie en Gal4-Based Enhancer Trap zebravis Lines

Summary

De temporele en ruimtelijke resolutie van de genetische manipulaties bepaalt het spectrum van biologische fenomenen die ze kunnen verstoren. Hier gebruiken we tijdelijk en ruimtelijk discrete

Abstract

In vivo elektroporatie is een krachtige methode voor het leveren van DNA expressie plasmiden, RNAi reagentia, en morfolino anti-sense oligonucleotiden tot specifieke regio's van de ontwikkeling van embryo's, waaronder die van C. elegans, kuiken, Xenopus, zebravis en muis ^1. In de zebravis, heeft in vivo electroporatie is aangetoond dat ze een uitstekende ruimtelijke en temporele resolutie hebben voor de levering van deze reagentia ^2-7. De temporele resolutie van deze methode is belangrijk omdat het laat voor het inbouwen van deze reagentia in specifieke fasen van ontwikkeling. Bovendien, omdat expressie van geëlektroporeerd vectoren plaatsvindt binnen 6 uur ^7, is deze methode meer tijd dan transgene benaderingen. Terwijl de ruimtelijke resolutie kan worden uiterst nauwkeurig wanneer de doelgroep een enkele cel ^{2, 6,} is het vaak beter om reagentia te nemen in een specifieke cel populatie binnen een weefsel of structuur. Wanneer de doelgroep meerdere cellen, in vivo elektroporatie is efficiënt voor levering aan een bepaalde regio van het embryo, maar met name binnen de zich ontwikkelende zenuwstelsel, is het moeilijk om specifieke celtypen doelgroep uitsluitend via ruimtelijk discrete elektroporatie. Als alternatief, enhancer trap transgene lijnen bieden uitstekende celtype-specifieke expressie van transgenen ^8. Hier beschrijven we een aanpak die transgene Gal4-based enhancer trap lijnen ⁸ combineert met ruimtelijk discrete in vivo elektroporatie ^{7, 9} tot en met specifiek op de ontwikkeling van neuronen van de zebravis bulbus olfactorius. De Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) ^hzm5 (voorheen GA80_9) enhancer trap lijn eerder beschreven ^acht, geeft gerichte transgene expressie van mCherry gemedieerd door een zebravis geoptimaliseerd Gal4 (KalTA4) transcriptionele activator in meerdere regio's van de zich ontwikkelende hersenen waaronder achterhersenen, cerebellum, voorhersenen, en de bulbus olfactorius. Om specifiek te richten GFP expressie om de bulbus olfactorius, een plasmide met de coderende sequentie van GFP onder controle van meerdere Gal4 bindingsplaatsen (UAS) werd geëlektroporeerd in het voorste einde van de voorhersenen van 24 tot 28 uur na de bevruchting (HPF). Hoewel deze methode bevat plasmide DNA in meerdere regio's van de voorhersenen, is GFP expressie alleen geïnduceerd in cellen transgenically uiting van de KalTA4 transcriptiefactor. Dus, met behulp van de GA080_9 transgene lijn, deze aanpak heeft geleid tot GFP expressie uitsluitend in de ontwikkelingslanden bulbus olfactorius. GFP tot expressie brengen gericht door middel van deze aanpak blijkt typische axonale projecties, zoals eerder beschreven voor mitrale cellen van de bulbus olfactorius ^10. Deze methode kan ook worden gebruikt voor gerichte toediening van andere reagentia waaronder de korte-hairpin RNA-interferentie expressieplasmiden, die een methode zou bieden voor ruimte en tijd discrete verlies-van-functie analyse.

Protocol

1. Transgene embryo's

1. Hier zijn we met behulp van een transgene lijn van de zebravis gemaakt door middel van een transposon-gemedieerde enhancer trap-methode ^8. De transgene insert bevat twee coderende sequenties: KalTA4, een zebravis-geoptimaliseerde versie van de Gal4 transcriptionele activator, en de rode fluorescente eiwit, mCherry. De enhancer trap methode levert lijnen van transgene zebravis dat deze transgene cassette uitdrukkelijke onder controle van een endogene enhancer sequentie. Dus, afhankelijk van de identiteit van de specifieke enhancer sequentie, expressie van zowel KalTA4 en mCherry gelokaliseerd op specifieke gebieden van de zich ontwikkelende hersenen. Voor de Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) ^hzm5 lijn die we hier gebruiken, is uitdrukking gelokaliseerd in een aantal sites in de achterhersenen, voorhersenen, en met name van belang hier, de bulbus olfactorius ⁸ (zie ook figuur 1). . Gezien dit patroon van meningsuiting, en de lokalisatie van de cassette in het genoom, worden de transgenen voorspeld dat onder controle van de zic4 promotor ⁸ (zie ook http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/ neuroimaging / lines_distel / main .).
2. Volwassen Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) ^hzm5 vissen heterozygoot voor de transgene insert zijn meestal gekoppeld met WT (AB) vissen, wat leidt tot ongeveer 50% van transgene nakomelingen. (Voor een hoger percentage van transgene nakomelingen, kunnen twee heterozygoten worden gedekt.)
3. Om de vorming van pigment te blokkeren en te vergemakkelijken fluorescerende beeldvorming, de behandeling van transgene embryo's met 100 uM N-phenylthiourea (PTU) vanaf 6-8 hpf.

2. Montage van embryo's

1. Op 24-28 HPF, transfer embryo's voor ei water zonder PTU. Identificeer transgene embryo's door expressie van mCherry met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Haal de chorionic membraan van transgene embryo's met behulp van fijne pincet. Transfer embryo's bevrijd van hun chorion naar een petrischaal met elektroporatie buffer plus 0,02% tricaïne [Elektroporatie Buffer: 180 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl _2, 5 mM HEPES, pH 7,2] ^4. Laat 2 minuten voor de verdoving door te voeren alvorens de montage stap.
2. Bereid een 0,5% oplossing van een lage smeltpunt agarose in electroporatie buffer plus tricaïne door de magnetron van de oplossing, en vervolgens het plaatsen van de oplossing in een 34-37 ° C incubator. Zodra de temperatuur van de agarose-oplossing is evenwicht, plaats een grote daling (~ 500 ul) van de agarose oplossing voor het midden van een 60 mm petrischaal. Voeg 6-8 verdoofd embryo's om deze daling van de agarose.
3. Met behulp van fijn pincet (of de fijne uiteinden van de snede microloader pipet tips), de positie van de embryo's zodanig dat ze allemaal worden geconfronteerd in dezelfde richting en uitgelijnd in een verticale rij. Te stollen de agarose, en val de embryo's in positie, zet de schaal op een grote petrischaal met 2-3 mm van ijs.
4. Nadat de agarose is gestold, overstroming de schotel met elektroporatie buffer plus tricaïne, ervoor te zorgen dat de oplossing volledig de gestolde agarose druppel covers.

3. Micro-injectie van DNA expressie-plasmide

1. De voorbereiding van de GFP-expressie-plasmide met behulp van een midi-of maxi-prep plasmide isolatie kit (bv. Qiagen). Hang de plasmide tot een uiteindelijke concentratie van 0,5 ug / ul in steriel water plus 0,03% fenol rood. Voor de bulbus olfactorius richten experiment hier beschreven, maken we gebruik van een expressie plasmide met de coderende sequentie van EGFP onder de controle van meerdere Gal4 bindingsplaatsen (14 tandem UAS sequenties en de basale vis promotor, E1b). Met behulp van dit plasmide, enkel cellen transgenically de uiting van de KalTA4 transcriptiefactor in staat zal zijn om GFP te uiten, dus bemiddelen gerichte expressie van GFP.
   Let op: hier maken we gebruik van fenol rood voor visualisatie van DNA-injecties, die moeten gelden voor het richten van andere regio's van de zich ontwikkelende hersenen, zolang de regio kan worden geopend vanuit de ventrikels. Voor het richten van andere celtypen die TL-visualisatie nodig hebben, kunnen BODIPY of Quantam Dot kleurstoffen eventueel worden gebruikt om de injecties te visualiseren onder TL-verlichting.
2. Micro-injectie pipetten kunnen worden vervaardigd met behulp van een horizontale of verticale pipet trekker. Warmte en pull-kracht van de instellingen zal variëren afhankelijk van het type van de trekker, de aard van de verwarmings-element, en het type van de glazen capillaire buizen.
   Met behulp van een Sutter P-30 verticale trekker, gebruik maken van een warmte-instelling van 980 en een pull-kracht van 960 tot lange, taps toelopende, scherpe pipetten produceren van dunwandige borosilicaat capillair glas met filamenten [Sutter Instrument # BF100-78-10]. Microinjetion pipetten getrokken met deze instellingen zijn gesloten en moet terug worden gebroken voor injectie.
3. Gebruik een microloader pipettip tot 1-2 ul van DNA-plasmide-oplossing toe te voegen aan de injectie pipet.
4. Monteren enveilig de geladen pipet in het druk-injectiesysteem pipet houder.
5. Break terug de geladen pipet met fijne tang tot drukpulsen produceren opgeblazen versie van de rode DNA-oplossing. Als alternatief kan tips terug gebroken worden door snel een indringend onder water, gevouwen laboratorium Kimwipe.
   Let op: omdat de injectie pipetten zijn aanvankelijk afgedicht en moet terug handmatig worden gebroken, de tip grootte en injectievolume zijn variabel. Ideaal injectie pipetten moeten voorschrijven 3-5 injectie pulsen volledig te vullen de zich ontwikkelende voorhersenen ventrikel van 24 HPF embryo's (100 ms injectie pulsen op 40 psi).
6. Injecteer het plasmide DNA-oplossing in de ventrikels van de zich ontwikkelende hersenen zodanig dat DNA grenst aan gedwongen, en ingelaste in de regio van de hersenen bestemd om de bulbus olfactorius formulier. Het reukorgaan is afgeleid van cellen in de meest voorste wand van de voorhersenen ventrikel. Dus, door het invoegen van de injectie pipet in de ventrikels, zodat de pipet is de richting van het voorste einde van de ontwikkeling van de hersenen, de druk injectie dwingt het DNA in en grenzend aan de toekomstige bulbus olfactorius. Injecteren DNA tot rode kleurstof is duidelijk zichtbaar op het voorste eind van de voorhersenen ventrikel. Omdat de DNA begint direct verspreiden, het verdunnen van het DNA, is het belangrijk om door te gaan naar de elektroporatie stap zo snel mogelijk na de injectie (bijvoorbeeld binnen 10 sec).

4. Elektroporatie

1. Elektroporatie wordt uitgevoerd met behulp van zelf geconstrueerde elektroden gemaakt van Grass platina subdermale elektroden (Grass Technology # E2). De elektroden zijn bevestigd aan een hand-held sonde, en de laatste afstand tussen de platina-elektroden moeten een mm (voor details over de bouw zie ⁹⁾ zijn. Square-wave elektroporatie pulsen worden geproduceerd door het aansluiten van de elektroden op een Grass SD-9 Stimulator (Grass Technology, Model SD-9).
2. Stel de SD-9 stimulator om afzonderlijke, 5 ms elektroporatie pulsen te produceren op 70 volt. Plaats de elektroden zodanig dat de positieve elektrode is geplaatst naast het voorste einde van het embryo, terwijl de negatieve elektrode plaatsvond na de embryo hoofd. Handmatig starten ~ 7-8 elektroporatie pulsen met de single mode schakelaar van de SD-9 stimulator, het scheiden van elke puls door ~ 1 sec. Juiste voltages zullen variëren afhankelijk van de leeftijd van de embryo's en de gebruikte spanningsbron. Jongere embryo's vereisen een lagere voltages aan embryo schade te voorkomen, terwijl oudere embryo's een hogere voltages aan elektroporatie ⁷ te starten.
3. Laat de embryo's gedurende ten minste 10 minuten na elektroporatie herstellen voordat hen te bevrijden van de agarose.
4. Met behulp van fijne tang, vrij van de embryo's uit de agarose door voorzichtig het opsporen van de omtrek van de embryo's terwijl het vermijden van daadwerkelijk contact met de embryo's zelf.
5. Eenmaal bevrijd, de terugkeer van de embryo's ei water (met PTU indien nodig). Houd ze bij 28 ° C tot ze worden afgebeeld voor GFP expressie.

5. Montage van embryo's voor imaging

1. Transfer embryo's van ei water plus PTU voor ei water plus 0,02% tricaïne. Laat enkele minuten voor de verdoving door te voeren alvorens de montage stap.
2. Bereid een 0,5% oplossing van een lage smeltpunt agarose in ei water plus tricaïne door de magnetron van de oplossing, en vervolgens het plaatsen van de oplossing in een 34-37 ° C incubator. Zodra de temperatuur van de agarose-oplossing is evenwicht, plaats een grote daling (~ 300 ul) van de agarose oplossing voor het midden van een 35 mm petrischaal. Voeg een narcose embryo tot deze daling van de agarose.
3. Met behulp van fijn pincet (of de fijne uiteinden van de snede microloader pipet tips), de positie van de embryo's zodanig dat ze rechtop staan, waardoor het mogelijk is om een ​​dorsaal aanzicht van de zich ontwikkelende hersenen met een rechtopstaande microscoop (omgekeerde scopes zal een ander embryo geometrie nodig te visualiseren, en een ander gerecht zodat visualisatie van onderen, zie ^12). Stollen van de agarose door het plaatsen van de schotel op een grote petrischaal met 2-3 mm van ijs. Heroriëntering met fijne tang zal waarschijnlijk nodig zijn tijdens het stollen om ervoor te zorgen dat het embryo niet omvallen op zijn zijkant.
4. Nadat de agarose is gestold, overstroming het gerecht met ei water plus tricaïne ervoor te zorgen dat de oplossing volledig de gestolde agarose druppel covers.

6. Representatieve resultaten:

Hoewel de GFP expressie kan worden waargenomen vanaf 6 uur na elektroporatie, hier zijn we tonen beelden van een embryo 4 dagen na elektroporatie zodanig dat de neurieten structuur van de beoogde cellen voldoende is ontwikkeld. De Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) ^hzm5 transgene enhancer trap regel geeft constitutieve uiting van mCherry (en KalTA4) in de achterhersenen, cerebellum, voorhersenen, en het reukorgaan in embryo's op 5 dagen na de bevruchting (Fig. 1A en 1C). Embryo's die hebben een UAS-GFP expressie plasmide opgenomen door gerichte elektroporatie (zoals hierboven beschreven), laten zien GFP expressie die is beperkt tot cellen van de zich ontwikkelende bulbus olfactorius (Fig. 1B, 1D, 1E en). Alleen cellen transgenically-uiting van de KalTA4 transcriptiefactor in staat zijn om uitdrukking te activeren van deze UAS-GFP plasmide. Integratie van dit plasmide in niet-transgene embryo's leidt niet tot een detecteerbare GFP expressie. Het is dus de gecombineerde actie van gerichte elektroporatie van UAS-GFP en gelokaliseerde transgene expressie van de KalTA4 driver die tot de exclusieve expressie van GFP leidt in de cellen van de zich ontwikkelende bulbus olfactorius. De GFP-expressie brengen vertonen typisch axonale projecties van de bulbus olfactorius mitrale cellen (Fig. 1B en 1D) ^10. Met het oog op axon projecties te visualiseren, beelden in figuur 1B en 1D moest worden blootgesteld aan hoge niveaus, zodat de regio van cellichamen goed waren overbelicht. Een lager niveau van blootstelling (fig. 1E) toont aan dat cellichamen uiten van GFP inderdaad gelokaliseerd aan de bulbus olfactorius (vergelijk afb. 1C en 1E;. Grijze lijn markeert de grens van de bulbus olfactorius).

Figuur 1. Gerichte GFP expressie in de bulbus olfactorius van een 5 DPF zebravis embryo. De Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) ^hzm5 transgene enhancer trap lijn, displays constitutieve expressie van mCherry in de achterhersenen, cerebellum, voorhersenen, en het reukorgaan (A en C, mCherry fluorescentie weergegeven in rood). Deze uitdrukking van mCherry wordt gemedieerd door transgene Gal4-expressie. Embryo's die zijn met een UAS-GFP-expressievector geëlektroporeerd op 28 hpf, weer te geven gerichte GFP expressie in de bulbus olfactorius op 5 dagen na de bevruchting (B, D en E, GFP-fluorescentie in het groen weergegeven. Zelfde als embryo in A-en C). Een lagere blootstelling afbeelding aan de onderkant (E) laat zien dat GFP expressie is beperkt tot de cellichamen van de bulbus olfactorius. De grijze lijn geeft de grens van de bulbus olfactorius. Bright veld (grijstinten), groene fluorescentie (groen) en rode fluorescentie (rood) beelden werden alle te nemen met een Olympus BX60 fluorescentie microscoop.

Discussion

Hier hebben we beschreven een in vivo elektroporatie methode in zebravis, dat een enhancer trap Gal4 transgene lijn om expressie van het transgen geëlektroporeerd te richten op een specifieke populatie van cellen in de zich ontwikkelende bulbus olfactorius gebruikt. Deze aanpak combineert de uitstekende temporele resolutie van in vivo elektroporatie ⁷ met de cel-type specifieke expressie gemedieerd door enhancer trap transgene lijnen ^8. Hoewel we hier beschreven hebben de gerichtheid van de bulbus olfactorius, in vivo elektroporatie kan worden gebruikt om andere regio's van het zich ontwikkelende zenuwstelsel ^2-7 doel, en enhancer trap lijnen zijn verkrijgbaar met gerichte uiting van Gal4 in veel verschillende specifieke celtypen of weefsels ^{8, 11.} Natuurlijk moet dit electroporatie techniek ook geschikt zijn voor andere combinatioral genetische benaderingen, zoals de LexA of Tet-systemen ^{13, 14, 15.} Een groot voordeel van elektroporatie is dat er niet nodig om extra transgene lijnen gezien het feit dat een geschikte Gal4-line beschikbaar is te maken. Dit bespaart zes maanden.

In vivo elektroporatie maakt voor de integratie van oligonucleotiden in neuronen en hun voorlopers op welk specifiek stadium van de zenuwstelsels ontwikkeling is van belang ^7. Deze temporele resolutie is bijzonder voordelig voor verlies-van-functie analyse, omdat het kan omzeilen problemen met targeting genen die belangrijke functies hebben in eerdere ontwikkelingsstadia. De methode die we beschrijven hier kan ook worden gebruikt om de verlies-van-functie reagentia waaronder RNAi oligonucleotiden of constructies en morfolino anti-sense oligonucleotiden ^{4, 7} te nemen. Plasmide-driven reagentia zoals dominant-negatieve eiwit expressie plasmiden of korte hairpin RNAi plasmiden kunnen ook worden geplaatst onder controle van een Gal4 UAS, waardoor de precieze celtype-specifieke expressie we hier hebben laten zien voor de expressie van GFP.

Materials

Reagents: Agarose, low-melting-point (Sigma, A9414) Plasmid midi- or maxi-prep kit (e.g. Qiagen, #12643] Phenol red (Sigma, P3532) Equipment: Capillary glass with filament; ID = 0.78 mm; OD = 1.0 mm (Sutter Instruments, #BF100-78-10) Grass SD-9 Stimulator (Grass Technology, Model SD-9) Grass platinum subdermal electrodes, straight needle (Grass Technology, #E2) Micro-loader pipette tips (Eppendorf, #X22703R) Pipette puller (e.g. Sutter, Model P-30) Pipette puller (e.g. Sutter, Model P-30)