Summary
遺伝子操作の時間的および空間的分解能は、彼らがかき乱すことができる生命現象のスペクトルを決定します。ここでは、時間的空間的に離散的な使用
Abstract
in vivoでのエレクトロポレーションではCのものも含めて、胚の特定領域にDNAの発現プラスミドは、RNAi試薬、及びモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供するための強力な方法です虫 、ひよこ、 アフリカツメガエル 、ゼブラフィッシュ、マウス1。ゼブラフィッシュでは、 生体内エレクトロポレーションでこれらの試薬2-7の配信のための優れた空間分解能と時間分解能を有することが示されている。それが開発の特定の段階でこれらの試薬の取り込みを可能にするため、この方法の時間分解能が重要です。エレクトロベクトルから式が6時間7内に発生するため、また、、この方法は、トランスジェニックのアプローチよりもタイムリーです。単セル2、6をターゲットにしたときの空間分解能が非常に正確にできますが、それは、組織または構造内の特定の細胞集団に試薬を配合するのが望ましい。複数のセルをターゲットとする場合、in vivoでのエレクトロポレーションで胚の特定の地域に配信するために効率的ですが、特に発展途上の神経系の中で、それは単に空間的に離散的なエレクトロポレーションによって特定の細胞型を標的とすることは困難である。また、エンハンサートラップトランスジェニックラインでは、導入遺伝子8の優れた細胞タイプ特異的発現を提供する。ここでは、特にゼブラフィッシュ嗅球の神経細胞の開発を対象とする生体内エレクトロポレーション7、9 で空間的に離散的にトランスジェニックGAL4ベースエンハンサートラップライン8を組み合わせたアプローチを説明します。 ET（zic4：Gal4TA4、UAS：mCherry）hzm5（旧GA80_9）エンハンサートラップラインは、以前に8を説明し、、mCherryの対象とトランスジェニック発現は後脳などの発展途上の脳の複数の領域におけるゼブラフィッシュ最適化されたGAL4（KalTA4）転写活性化因子によって媒介表示されます。小脳、前脳、および嗅球。嗅球に特異的にGFPの発現を標的に、複数のGal4結合部位（UAS）の制御下にGFPをコードする配列を持つプラスミドを24から28時間後に受精（HPF）における前脳の前端にエレクトロした。このメソッドは、前脳の複数の領域にプラスミドDNAが組み込まれているが、GFPの発現はトランスジェニックKalTA4転写因子を発現する細胞に誘導される。従って、GA080_9トランスジェニックラインを使用して、このアプローチは、発展途上嗅球で排他的にGFPの発現につながった。以前に嗅球10の僧帽細胞のために説明したように、このアプローチを通して標的GFP発現細胞は、典型的な軸索 投射を示した。この方法はまた、空間的及び時間的離散の機能喪失解析する方法を提供するショートヘアピンRNA干渉発現プラスミド、を含む他の試薬の標的配信を使用することができる。
Protocol
1。トランスジェニック胚
- ここでは、トランスポゾンを介するエンハンサートラップ法8を介して作成されたゼブラフィッシュのトランスジェニックラインを使用しています。 KalTA4、GAL4転写活性化因子のゼブラフィッシュを最適化したバージョン、および赤色蛍光タンパク質、mCherry：トランスジェニック挿入は、2つのコーディング配列を含む。内因性エンハンサー配列の制御下でこのトランスジェニックカセットを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュのエンハンサートラップ法の収量ライン。したがって、特定のエンハンサー配列の同一性に応じて、KalTA4とmCherry両方の発現が脳の発達の特定の領域にローカライズされています。 ET（：Gal4TA4、UAS：zic4 mCherry）のために我々がここで使用していることをhzm5ライン、式はここで特に重要な、後脳、前脳、いくつかの部位に局在している、嗅球8（また、図1を参照してください。） 。発現のこのパターン、およびゲノム内のカセットの局在を考えると、導入遺伝子は、（また見zic4プロモーター8の制御下になると予測されているhttp://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/神経画像/ lines_distel /メイン 。）。
- 大人のEt（zic4：Gal4TA4、UAS：mCherry）トランスジェニック挿入のヘテロhzm5魚は通常、約50％トランスジェニック子孫を導く、WT（AB）の魚と交配されています。 （トランスジェニック子孫の高い割合では、2つのヘテロ接合体を交配することができます。）
- 色素形成をブロックし、蛍光イメージングを促進する、6-8 HPFで100μMのN -フェニルチオ尿素（PTU）の先頭にトランスジェニック胚を治療するために。
2。取付胚
- 24から28 HPFで、PTUなし卵の水に胚を移す。蛍光顕微鏡を使用してmCherryの発現によってトランスジェニック胚を特定する。微細な鉗子を用いてトランスジェニック胚から絨毛膜を取り外します。 4：転送胚のエレクトロポレーションバッファーに加えて0.02パーセントtricaine [180 mMのNaCl、5mMのKClを、1.8 mMのCaCl 2を 、5mMのHEPES、pH 7.2のエレクトロポレーションバッファー]を含むペトリ皿に自分の絨毛膜から解放。麻酔のための2分は実装工程に進む前に有効にすることができます。
- ソリューションを電子レンジしてから、34〜37℃のインキュベーターにソリューションを配置することにより、エレクトロポレーションバッファーを加えたtricaineの低融点アガロースの0.5％溶液を準備します。アガロース溶液の温度が平衡化されていると、60ミリメートルペトリ皿の中央にアガロース溶液の大きな低下（〜500μl）を置きます。アガロースのこのドロップ、6〜8麻酔胚を追加。
- 微細な鉗子（またはカットmicroloaderのピペットチップの細かい端）、位置はすべて同じ方向に向いていると縦の列に並ぶように胚を使用する。アガロースを固化し、位置に胚をトラップするには、氷の2-3 mmの大型ペトリ皿の上に皿を置きます。
- アガロースが固化した後、溶液が完全に固化したアガロースドロップをカバーすることを確認し、エレクトロポレーション緩衝液を加えたtricaineで料理をあふれさせる。
3。プラスミドDNAの発現のマイクロインジェクション
- ミディまたはマキシプレッププラスミド単離キット（例えばQiagen）を用いてプラスミドのGFPの発現を準備します。の0.5μg/滅菌水の添加に加えて0.03パーセントのフェノールレッドの最終濃度にプラスミドを一時停止します。実験は、ここで説明するターゲティング嗅球では、複数のGal4結合部位（14タンデムUAS配列と基底魚のプロモーター、E1B）の制御下でEGFPのコード配列を持つ発現プラスミドを使用しています。このように、GFPの標的発現を仲介する、このプラスミドを用いて、トランスジェニックKalTA4転写因子を発現する細胞のみがGFPを発現することができるようになります。
注：ここで我々が開発し、脳の他の地域をターゲットとするために適用されるべきDNAの注射、の可視化のため、フェノールレッドを使用している、限り、地域が心室からアクセスすることができます。蛍光可視化を必要とする他の細胞型を標的とするために、BODIPYまたはQuantamドットの染料は、潜在的に蛍光灯照明下で注射を視覚化するために使用することができる。 - マイクロインジェクションピペットを水平または垂直ピペットプラーを使用して製造することができる。熱とプル強度の設定は、引き手の種類、発熱体の種類、およびガラスキャピラリーチューブの種類によって異なります。
サターP - 30垂直プラーを使用して、フィラメントを持つ薄肉ホウケイ酸ガラスキャピラリー[サッターインストゥルメント＃BF100 - 78 - 10]から長く、テーパー、シャープなピペットを生成するために980のヒートセットと960のプルフォースを使用。これらの設定に引っ張らMicroinjetionのピペットは封印されており、注入前に戻って分割しなければなりません。 - インジェクションピペットにDNAプラスミド溶液の1〜2μLを追加するmicroloaderのピペットチップを使用してください。
- 山と圧力注入システムのピペットホルダーにロードされたピペットを確保する。
- 圧力パルスが赤DNA溶液の吹かれたリリースを生成するまで細かい鉗子でロードされたピペットをブレイクバックする。また、チップはすぐに水中に沈め、折り畳まれた実験室のキムワイプを貫通して戻って分けることができます。
注：インジェクションピペットが最初に封印されており、手動でバック破られる必要があるため、チップサイズや注入量が可変である。理想的な注入ピペットは3-5注入パルスが完全に24 HPFの胚（40 psiで100ミリ秒の噴射パルス）の開発前脳の脳室を埋めるために必要としてください。 - そのようなそのDNAが隣接し、強制され、脳の発達の脳室内にプラスミドDNA溶液を注入し、中にインターカレー、嗅球を形成する運命脳の領域。嗅球は、前脳の脳室のほとんどの前壁の細胞から派生しています。このように、ピペットが発達中の脳の前端に向かって指しているような脳室にインジェクションピペットを挿入することにより、圧力注入は、DNAへと将来の嗅球に隣接して強制的に。赤色の染料が明らかに前脳の脳室の前端に表示されるまでのDNAを注入する。 DNAは、DNAを希釈する、すぐに拡散し始めるので、それは注射後、できるだけ早くエレクトロポレーションステップ（例えば、10秒以内）に進むことが重要です。
4。エレクトロポレーション
- エレクトログラスプラチナ皮下電極（グラステクノロジー＃E2）から作られた自己構築電極を用いて行われる。電極は、ハンドヘルドプローブに結合され、白金電極との間の最終的な距離は1mm（建築の詳細については、9を参照）でなければなりません。方形波エレクトロポレーションパルスはグラスSD - 9刺激（グラステクノロジー、モデルSD - 9）に電極を接続することによって生産されています。
- 70ボルトで、単一の、5ミリ秒のエレクトロポレーションパルスを生成するためにSD - 9刺激を設定します。負極は、胚の頭部の後方のときに正極は、胚の前端に隣接して配置されるように電極を配置します。手動〜1秒で各パルスを分離し、SD - 9刺激のシングルモードスイッチを使用して〜7月8日電気パルスを開始する。適切な電圧は、胚の年齢や使用電圧源によって異なります。古い胚のエレクトロポレーション7を開始するために高い電圧を必要とするのに対し、若い胚は、より低い電圧が胚の損傷を避けるために必要です。
- 胚は、アガロースからそれらを解放する前にエレクトロポレーション後、少なくとも10分間回復することができます。
- 微細な鉗子を使用して、自分自身胚と実際の接触を避けながら、ゆっくりと胚の輪郭をトレースすることによりアガロースから胚を解放する。
- 一度解放された、（PTUと必要に応じて）卵を水に胚を戻す。 28でそれらを保つ° C彼らはGFPの発現のために撮像されるようになるまで。
5。イメージング用取付胚
- 卵の水に加え、PTUから卵を水に加えて0.02パーセントtricaineに胚を移す。麻酔のための数分は実装工程に進む前に有効にすることができます。
- ソリューションを電子レンジしてから、34〜37℃のインキュベーターにソリューションを配置することにより、卵水+ tricaineの低融点アガロースの0.5％溶液を準備します。アガロース溶液の温度が平衡化されていると、35ミリメートルのペトリ皿の中央にアガロース溶液の大きな低下（〜300μl）を置きます。アガロースのこのドロップ一つ麻酔胚を追加。
- 微細な鉗子を（またはカットmicroloaderのピペットチップの微細な端）を使用して、位置、彼らはそれが可能な正立顕微鏡（倒立スコープが異なる胚の形状を必要とする、開発途上の脳の背側を可視化すること、直立していることなどの胚と下からの可視化を可能にする別の皿、12を参照してください）。氷の2-3 mmの大型ペトリ皿の上に皿を置くことによってアガロースを固める。細かい鉗子による再配向可能性が高い胚がその側に倒れることがないように凝固時に必要となります。
- アガロースが固化した後、洪水卵水を加えたtricaineと料理は、ソリューションが完全に固化したアガロースドロップをカバーするようにしています。
6。代表的な結果：
GFPの発現は、エレクトロポレーション後の6時間には早くも観察することができますが、ここでは4日間標的細胞の神経突起構造が十分に発展しているようにエレクトロポレーション後の胚から画像を見せている。 ET（zic4：Gal4TA4、UAS：mCherry）hzm5トランスジェニックエンハンサートラップラインは、5日後に受精（図1Aおよび1Cに後脳、小脳、前脳、そして胚の嗅球におけるmCherry（とKalTA4）の構成的発現が表示されます。）。ターゲットエレクトロポレーション（上記のように）、開発嗅球の細胞（図1B、1D、および1E）に制限されているショーのGFPの発現により援用プラスミドUAS - GFPの発現があった胚。唯一の細胞はトランスジェニック発現KalTA4転写因子は、このUAS - GFPプラスミドからの発現を活性化することができます。非トランスジェニック胚にこのプラスミドの組み込みは、任意の検出可能なGFPの発現につながるものではない。したがって、UAS - GFPと開発嗅球の細胞でGFPの排他的な表現につながるKalTA4ドライバのローカライズされたトランスジェニック発現の標的とエレクトロポレーションの複合作用である。 GFP発現細胞は嗅球僧帽細胞（図1Bおよび1D）10の典型的な軸索 投射を示す。軸索突起を可視化するために、図1Bと1Dの画像は、細胞体の領域をはるかに越えて、暴露されたような高いレベルで暴露されなければならなかった。曝露の低いレベルでは（図1E）GFPを発現する細胞体が実際に嗅球（。、灰色の線は、嗅球の境界線を示す図1Cおよび1Eの比較）にローカライズされていることを示しています。
図1は、5 DPFのゼブラフィッシュ胚の嗅球でGFPの発現を対象とした。 ET（zic4：Gal4TA4、UAS：mCherry）hzm5トランスジェニックエンハンサートラップラインは、後脳、小脳、前脳、および嗅球（とC、mCherry蛍光が赤で表示）にmCherryの構成的発現が表示されます。 mCherryのこの表現は、トランスジェニックGal4の発現によって媒介される。 28 HPFでUAS - GFPの発現ベクターでエレクトロポレーションされた胚は、緑色で示されて5日後に受精（B、D、およびE、GFP蛍光で嗅球の標的とGFPの発現が表示されます。同じ胚では、のようにとC）。下部に低いばく露のイメージは、（E）はGFPの発現は、嗅球の細胞体に制限されて表示されます。灰色の線は、嗅球の境界線を示している。ブライトフィールド（グレースケール）、緑色蛍光（緑）、および赤色蛍光（赤）画像は、すべてオリンパスBX60蛍光顕微鏡を取るれた。
Discussion
ここでは、発展途上嗅球の細胞の特定の集団にエレクトロポレーション導入遺伝子の発現を標的とするエンハンサートラップGal4のトランスジェニックラインを利用してゼブラフィッシュの in vivoエレクトロポレーション法で説明しています。このアプローチは、エンハンサートラップトランスジェニック行8を介した細胞型特異的な発現のin vivoエレクトロポレーション7 での優れた時間分解能を兼ね備えています。ここで我々は多くの異なった特定の細胞型または組織中のGAL4の標的発現で利用可能な生体内エレクトロポレーションでは 、嗅球の標的化が発展途上の神経系2-7、およびエンハンサートラップラインの他の地域をターゲットとするために使用することができます説明してきましたが、 8、11。もちろん、このエレクトロポレーション技術はまたのLexAやテトシステム13、14、15などの他のcombinatioral遺伝学的ア プローチに適しているはずです。エレクトロポレーションの主な利点は、適切なGAL4 -回線が使用可能であることを考えれば、追加のトランスジェニックラインを作るためにある必要がないということです。これは半年を保存します。
in vivoでのエレクトロポレーションでは神経系の発達の特定段階に関心7のあるもので、神経細胞とその前駆体へのオリゴヌクレオチドの組み込みが可能になります。それは以前の発生段階において必要不可欠な機能を持つ遺伝子を標的と問題を回避できるので、この時間分解能は、機能喪失解析のために特に有利である。我々はここで説明する方法はまたのRNAiオリゴヌクレオチドまたは構造とモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド4,7を含めて機能喪失型の試薬 を組み込むために使用することができます。このようなドミナントネガティブ蛋白質の発現プラスミドまたはショートヘアピンのRNAiプラスミドなどのプラスミド駆動型試薬はまた、我々はGFPの発現のためにここに示されている正確な細胞タイプ特異的発現を可能にする、Gal4のUASの制御下に置くことができます。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、ジョンホーン（; R15MH083221 NIMH）にNIH R15 AREA助成金により賄われた。
Materials
Reagents:
Equipment:
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