Summary
Une méthode fiable pour enquêter sur des cellules ciliées externes (CCE) des réponses mobiles, y compris électromotilité, la motilité lente et à la flexion, est décrite. Motilité OHC est provoqué par la stimulation par un champ électrique externe en alternance, et la méthode tire parti de l'enregistrement d'images à haute vitesse, un éclairage à base de LED, et la dernière génération de logiciels d'analyse d'image.
Abstract
CCE sont cylindriques cellules sensori situé dans l'organe de Corti, l'organe auditif dans l'oreille des mammifères intérieure. Le nom de «cellules ciliées» découle de leur bundle apicale caractéristique de stéréocils, un élément essentiel pour la détection et la transduction de l'énergie sonore 1. CCE sont en mesure de changer de forme allongée, de raccourcir et pliez-en réponse à une stimulation électrique, mécanique et chimique, une réponse motrice considérée comme cruciale pour l'amplification des signaux acoustiques cochléaires 2.
La stimulation OHC induit deux réponses différentes mobiles: i) électromotilité, alias la motilité rapide, les changements de longueur dans l'ordre de la microseconde issus de propulsion électrique des changements conformationnels dans les protéines motrices denses dans OHC membrane plasmique, et ii) la motilité lente, les changements de forme dans le milliseconde à quelques secondes d'intervalle sur la réorganisation du cytosquelette 2, 3. OHC flexion est associée à électromotilité, et résulter soit d'une distribution asymétrique des protéines motrices dans la membrane plasmique latérale, ou asymétrique stimulation électrique de ces protéines motrices (par exemple, avec un champ électrique perpendiculaire à l'axe longitudinal des cellules) 4. Stimuli mécaniques et chimiques induisent des réponses lentes essentiellement mobiles, même si les changements dans les conditions ioniques des cellules et / ou leur environnement peuvent aussi stimuler la membrane plasmique-embedded protéines motrices 5, 6. Depuis réponses OHC mobiles sont une composante essentielle de l'amplificateur cochléaire, l'analyse qualitative et quantitative de ces réponses mobiles à des fréquences acoustiques (environ de 20 Hz à 20 kHz chez l'humain) est une question très importante dans le domaine de l'audition de recherche 7.
Le développement de la nouvelle technologie d'imagerie combinant caméras vidéo à haute vitesse, des systèmes d'éclairage à base de LED, et un logiciel sophistiqué d'analyse d'image offre désormais la possibilité d'effectuer qualitatives fiables et des études quantitatives de la réponse motiles des CCEs isolées à un champ électrique externe en alternance (EAEF) 8. C'est une technique simple et non invasive qui contourne la plupart des limitations des approches précédentes 9-11. Par ailleurs, le système d'éclairage à base de LED offre une luminosité extrême, avec des effets négligeables thermique sur des échantillons et, en raison de l'utilisation de la microscopie vidéo, la résolution optique est d'au moins 10 fois plus élevée qu'avec les techniques classiques microscopie optique 12. Par exemple, avec le dispositif expérimental décrit ici, les changements de longueur de cellules d'environ 20 nm peuvent être systématiquement et de manière fiable détecté à des fréquences de 10 kHz, et cette résolution peut être encore améliorée aux basses fréquences.
Nous sommes confiants que cette approche expérimentale permettra d'étendre notre compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent la motilité OHC.
Protocol
1. Isolement des cellules ciliées externes
- Commencez cette procédure par la récolte os temporaux de porcs Guinée, souris ou votre modèle animal mammifères.
- Ensuite, ouvrez l'os temporal en utilisant une pince du marteau afin d'exposer la cochlée, et les plonger dans Leibovitz L-15. Enlever l'excès d'os soigneusement, en gardant la coquille osseuse intacte. Considérant que la présente est une procédure générale applicable aux os temporaux de toute espèce de mammifère, des modifications mineures à la technique peut être nécessaire lorsqu'il s'agit d'os temporaux très petits animaux. Chez les animaux de la vieille bulle est généralement calcifiée, introduisant une complication supplémentaire à la procédure.
- Sous observation microscopique, ouvrez la région apicale de la cochlée et enlever strie vasculaire et de ligament spiral en utilisant la pointe d'une lame de bistouri n ° 11, un point de micro et de prendre une pince fine.
- Prenez l'organe de Corti hors du modiolus cochléaire à l'aide de la pince, et le mettre dans la collagénase 1mg/ml dans le L-15 à température ambiante pendant 5 min.
- Si CCE à partir tourne basale de la cochlée sont nécessaire, retirez la coquille osseuse recouvrant la base de la cochlée avec la pioche, et séparer la spirale de l'os temporal à l'aide de la lame du scalpel avant de retirer l'organe de Corti.
- Transfert l'organe de Corti à la chambre d'enregistrement en utilisant une seringue de 50 uL de Hamilton. Ensuite, les cellules se dissocient par le reflux de l'aiguille.
2. Installation expérimentale
- Schéma du champ alternatif externe (EAEF) générateur électrique et de leurs liens avec le système de capture d'image (Fig. 1). Le circuit de commande a été spécialement mis en place au cœur de l'ingénierie House Ear Institute.
- Le dispositif expérimental utilisé dans nos expériences se compose d'un microscope inversé Axiovert 135TV (Zeiss, Thornwood, NY) avec un système d'éclairage à base de LED de remplacement (High Power LED System-36AD3500, Technologies de Lightspeed, Campbell, CA), deux micromanipulateurs électronique (Eppendorf "PatchMan", Allemagne), un PC contrôlé à ultra-haute vitesse Photron FastCAM X 1024 PCI caméra (Photron USA Inc) dans le port Keller et une caméra CCD ordinaire supplémentaire dans le port trinoculaire. La caméra FastCAM est capable de capturer des images à des fréquences élevées (jusqu'à 100 000 fps) et haute résolution (par exemple, 1024 x 1024 pixels à 1000 images par seconde, 512 x 128 à 10 000 fps, 384 x 96 à 18.000 fps, et ainsi de suite). Les images fournies par la caméra à haute vitesse sont directement observés dans le moniteur du PC, tandis que la caméra CCD est connecté à un autre moniteur. Le système d'éclairage à base de LED fonctionne en deux modes différents: faible puissance analogiques et numériques de haute puissance. Toutes les procédures préliminaires (positionnement des électrodes, le positionnement des cellules, la concentration, etc) sont effectuées en utilisant le mode de faible puissance analogique. L'éclairage à haute puissance est activé par l'ouverture de l'obturateur de caméra et ensuite éteint par la fermeture de l'obturateur, ce qui facilite la dissipation de chaleur. Logiciel maison, également développé au cœur House Ear Institut de génie, fonctionnant sur le même PC contrôle l'élément déclencheur de la caméra à haute vitesse, le système d'éclairage à base de LED, et le EAEF. Un appareil photo numérique conventionnel dans le port avant permet encore des images si nécessaire. (Fig. 2 A).
- Électrodes (deux 0,25 mm de diamètre fils Ag avec la distance pointe de 0,8 mm) sont entraînés à la position en utilisant l'un des micromanipulateurs électronique. La position des électrodes est contrôlé visuellement et par l'image microscopique, un changement dans le plan focal de l'image indique que les électrodes touché le fond de la chambre expérimentale. Initialement, le champ électrique est calibré en utilisant une électrode externe. Cette électrode mesure le potentiel électrique à différents points, générant une «carte» du champ électrique. Si une seule cellule isolée ciliées externes est placée entre les extrémités des électrodes avec son axe longitudinal parallèle à l'EAEF appliquée, elle se déplacera allongeant et en raccourcissant à la même fréquence du champ électrique. Si la cellule est placée perpendiculairement au champ d'un autre type d'OHC réponse (flexion) peut être observé et étudié. (Fig. 2 B)
3. La stimulation et la capture d'image EAEF
- Quatre protocoles de stimulation différentes sont sélectionnables (Fig. 3):
- continue à fréquence unique (Fig. 3 A). Notez que le type de mode de stimulation, la fréquence, l'amplitude et la vague peut être sélectionné en utilisant la maison logiciel de contrôle (cercles rouges).
- bursted fréquence unique (Fig. 3 B). La longueur des rafales et les écarts entre éclatement sont également sélectionnables.
- balayage linéaire (fig. 3 C). Les fréquences initiales et finales sont sélectionnables.
- multi-stimulation (Fig. 3 D). Fréquence unique et des balayages linéaires peuvent être combinés en une seule expérience. Après avoir sélectionné les paramètres correspondants, le logiciel de contrôle configure le système et permet à l'opérateur de lancer léger synchronisé enregistrement vidéo et la stimulation des cellules en cliquant sur un bouton uniquel'écran d'ordinateur.
- Les images sont capturées au format AVI pour une analyse plus poussée à des fréquences élevées.
4. Les résultats représentatifs
- Dans ce film, deux isolés cellules ciliées externes montrent des changements dans la longueur ou la courbure quand ils sont stimulés par un champ électrique externe alternance qui est parallèle ou transversale, respectivement, à leur axe longitudinal. (Film n ° 2).
- Réponses sont analysées CCE mobiles off-line en utilisant le logiciel ProAnalyst (Xcitex Inc, Cambridge, MA). «Tracking Feature" fonction dans ce logiciel fournit la distance entre deux points de trame par trame (fig. 4). Pendant la cellule de raccourcir la distance entre les points sélectionnés à l'apex (plaque cuticulaire; couleur rouge) et la base de la cellule (pôle basal; couleur verte) est plus petit, et augmente avec l'élongation des cellules. Le film montre le logiciel analyse trame par trame des changements dans la longueur. Le panneau en bas de l'image montre la trace du mouvement. Dans cet exemple, la variation totale de longueur est d'environ 6,5 pixels.
- "Contour Tracking" de fonction dans le logiciel peut détecter ProAnalyst bord des cellules et mesurer automatiquement l'aire de la section optique (fig. 5).
- Microsphères de polystyrène ajouté à la solution du bain de manière aléatoire et fixer solidement à la membrane plasmique (Fig. 6 A). Différents microsphères peuvent être sélectionnés simultanément, et le logiciel peut automatiquement suivre tous trame par trame. De cette façon, les cellules peuvent être divisés en sections et la motilité de chaque section évaluée indépendamment. (Fig. 6 A)
- En sélectionnant microsphères situé sur les bords latéraux de l'image des cellules, des changements dans la longueur de chaque segment et les changements de l'angle d'un point à d'autres segments (flexion) peut également être évalué de manière indépendante. (Figure 6B)
Figure 1. Schéma du générateur EAEF et leurs liens avec le système de capture d'image.
Figure 2. Une image) de l'installation expérimentale. B) Détail de la platine du microscope, avec les caricatures des électrodes et un seul OHC placé entre eux avec son axe longitudinal parallèle au champ électrique.
Figure 3. Une interface utilisateur) du logiciel de contrôle maison configuré pour une seule fréquence de stimulation. Les paramètres sélectionnés sont entourées en rouge. B) Interface Utilisateur du logiciel maison de commande configuré pour seule rafale, la fréquence de stimulation. Interface Utilisateur C) du logiciel maison de commande configuré pour une stimulation balayage linéaire. L'interface utilisateur D) du logiciel de contrôle maison configuré pour le multi-stimulation.
Figure 4. Cadre unique d'une OHC à deux points sélectionnés à la base (vert) et l'apex (rouge) de la cellule, respectivement, en utilisant le "suivi Feature" fonction du logiciel ProAnalyst. La courbe ci-dessous la cellule montre les changements périodiques de la distance entre les points sélectionnés associés à une stimulation électrique. Déplacement de la barre verticale des cadres différents peuvent être sélectionnés pour une analyse individuelle.
Figure 5. Le "suivi de contour" fonction dans ProAnalyst détecte le bord des cellules et mesurer automatiquement l'aire de la section optique.
Figure 6. A l'image) Capturé d'une OHC isolés décorées avec microsphères de polystyrène (en haut), et la même image avec cinq microsphères sélectionnées individuellement (en bas). Une couleur différente est attribuée à chaque microsphère, et leurs déplacements peuvent être individuellement et automatiquement frame par frame suivis, analysés et comparés. B) des segments de longueur arbitraire peut être défini en sélectionnant microsphères de polystyrène situé sur les bords de la cellule, et les changements de longueur de ces segments ainsi que des changements dans l'orientation d'un segment à respecter les autres (cellulaire flexion) peuvent être automatiquement évalués image par cadre avec le logiciel d'analyse d'image.
Film 1. Isolement des cellules ciliées externes de porc Guinée. Cliquez ici pour visionner la vidéo
Movie 2. CCE parallèles et perpendiculaires à l'EAEF montrant électromotilité typiques et les réponses de flexion. Cliquez ici pour visionner la vidéo
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Discussion
La méthode expérimentale présentée ici permet d'estimer les réponses OHC mobiles de la gamme kHz sans aucune restriction aux mouvements de la cellule. Différents protocoles de stimulation, d'autres marqueurs (microsphères), comme des changements dans l'orientation même de la cellule par rapport au champ électrique, permettant d'étudier de nouveaux aspects de la motilité OHC avec un niveau de détail jusque-là inaccessibles. D'autres méthodes, par exemple ceux utilisant des photodiodes 9 ou laser Doppler vibrométrie 10, exigent un contrôle serré de la position de la cellule. Ici, en revanche, toutes les mesures sont effectuées entre les points appartenant à la même cellule, et chaque déplacement est seulement associée à des changements dans la forme des cellules et non à leur mouvement par rapport à un cadre de référence externe. Des mesures fiables de la section transversale OHC sont aussi faciles à obtenir, ce qui permet une estimation des changements rapides dans le volume OHC. En outre, le développement continu des caméras plus rapides et plus sensibles et mieux le logiciel d'analyse d'image, de garantir une amélioration continue de la qualité de la méthode. Un inconvénient de la technique, aucun contrôle sur le potentiel électrique à travers la membrane plasmique, est une limitation partagé avec toutes les méthodes actuellement utilisées pour évaluer la motilité OHC dans la gamme kHz.
Ainsi, la méthode décrite ici pourrait être un outil important pour l'audition de recherche, capable de fournir de nouveaux indices et importantes sur les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents des réponses motiles CCE »
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les travaux pris en charge par des subventions des National Institutes Health R01DC10146/R01DC010397, NIDCD P30 DC006276 base en recherche et établissements d'enseignement supérieur. Son contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de NIH ou HEI. Les auteurs déclarent aucun conflit existant ou potentiel d'intérêts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz’s L-15 | GIBCO, by Life Technologies | 21083 | |
| Collagenase (Type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | 1mg/mL in L-15 |
References
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