调查外毛细胞运动与外部的交流电场刺激和高速图像分析相结合

Summary

调查外毛细胞（OHC）能动的反应，包括electromotility，缓慢的蠕动和弯曲，可靠的方法来描述。 OHC的蠕动刺激引起的与外部的交流电场，该方法需要高速图像记录，基于LED照明，和上一代图像分析软件的优势。

Abstract

OHCS是圆柱形的感觉，位于尔蒂内哺乳动物内耳听觉器官的器官细胞。 “毛细胞”的名字来自它们所特有的纤毛，检测和传导声音能量¹的一个关键因素根尖捆绑的。 OHCS能够改变形状拉长，缩短和弯曲，在电气，机械和化学刺激，电机响应考虑耳蜗声信号放大²的关键。

OHC的刺激诱导两个不同的能动对策：一）electromotility，又名快速蠕动，在微秒范围内的变化，电动马达蛋白在人口稠密的OHC质膜盒装的构象变化的长度，及ii）缓慢的蠕动，在造型上的变化毫秒到秒范围涉及细胞骨架重组^，2，3。 OHC的弯曲与electromotility相关结果无论是从马达蛋白的不对称分布在外侧的质膜，或不对称电刺激这些马达蛋白（例如，与电场垂直于^细胞长轴） 4。机械和化学刺激诱 ​​导基本上是缓慢的能动反应，即使在离子的细胞和/或他们的环境条件的变化也能刺激血浆膜嵌入式^{马达蛋白5，} 6。由于OHC的能动反应耳蜗放大器的重要组成部分，声波频率（大约从20 Hz到20 kHz在人类的）的定性和定量分析这些能动的^反应是在听觉研究7领域的一个非常重要的问题。

现在高速videocameras，基于LED的照明系统，以及先进的图像分析软件相结合的新的成像技术的发展提供了能够进行可靠的定性和定量研究的隔离OHCS能动的响应外部的交流电场（EAEF） ^8。这是一个简单的和非侵入性的技术，规避^大部分 9-11以前的方法的局限性。此外，基于LED的照明系统提供微不足道的热效应，对样品的极端的亮度，因为使用视频显微镜，光学分辨率比^传统的光学显微镜技术12高出至少10倍。例如，与这里所描述的实验装置，改变细胞的长度约为20 nm可以经常和可靠地检测到10千赫的频率，可以进一步改善在较低的频率和本决议。

我们有信心，本实验的方法将有助于延长OHC的蠕动的基本细胞和分子机制的认识。

Protocol

1。隔离的OHCS

1. 开始收获豚鼠，小鼠或您的哺乳类动物模型的颞骨，此过程。
2. 接下来，打开一个锤骨钳的使用，以揭露耳蜗的颞骨，和他们沉浸在莱博维茨的L - 15。小心取出骨过剩，保持完好的骨壳。鉴于这是一个一般的程序，适用于任何哺乳类动物的颞骨，小的变化的技术处理时，可能需要从非常小的动物颞骨。泡在老动物通常是钙化，引入了新的复杂的程序。
3. 在显微镜观察下，打开耳蜗顶端区域，去除血管纹和螺旋韧带使用＃11手术刀刀片的一角，一个微点挑细的镊子。
4. 使用镊子耳蜗mod​​iolus以Corti器，并在1mg/ml的胶原酶的L - 15在室温下5分钟。
5. 如果需要从耳蜗基底轮流OHCS，去除骨壳覆盖挑耳蜗基地，并单独Corti器除去了之前使用的手术刀刀片从颞骨螺旋。
6. Corti器传输到录音室使用50μL汉密尔顿注射器。随后，游离细胞回流通过针。

2。实验装置

1. 图外部的交流电场（EAEF）发生器和与图像采集系统（图1）的联系。特别是实施House耳研究所工程的核心控制电路。
2. 在我们的实验中所用的实验装置，由AXIOVERT 135TV倒置显微镜（蔡司，Thornwood，NY）与另一种基于LED照明系统（大功率LED系统36AD3500，光速技术，坎贝尔，加利福尼亚州），两个电子micromanipulators（Eppendorf公司“Patchman”，德国），一个电脑控制的超高速Photron Fastcam × 1024的PCI相机（Photron美国公司）在凯勒端口和一个额外的经常在三目端口CCD相机。 Fastcam相机能够捕捉到的图像在高频率（高达100,000 FPS）和高分辨率（如1024 × 1024像素，1000帧，512 × 128 10,000 FPS，384 × 96 18,000 fps的，等等）。由高速摄像机提供的图像直接观察到在电脑的显示器，而CCD相机连接到不同的显示器。基于LED的照明系统工作在两种不同的模式：低功耗模拟和高功率数字。使用低功耗的模拟模式进行了初步的所有程序（电极定位，细胞定位，重点等）。高功率照明开启相机的快门光圈快门关闭，然后关闭，促进散热。国产软件，还开发了在众议院耳研究所工程的核心，在同一台PC上运行的控制的高速摄像头，基于LED的照明系统，并在EAEF触发。在一个传统的数码照片的摄像头前端口可以根据需要为静帧。 （图2）。
3. 驱动电极（两个0.25毫米直径的银线提示为0.8毫米的距离）的位置使用的电子micromanipulators。电极的位置是通过视觉和显微图像监控;焦平面图像的变化表明，电极触及的试验室的底部。最初，该电场是使用外部电极校准。这种电极的措施在不同点的电势，电场产生的“地图”。如果一个单一的孤立的外毛细胞之间与应用EAEF其纵轴平行放置电极的提示，它会移动在相同的频率的电场拉长和缩短。如果细胞被置于垂直于磁场的不同类型的OHC的反应（弯曲），可以观察和调查。 （图二B）

3。 EAEF刺激和图像采集

1. 可选择四种不同的刺激协议（图3）：
   1. 连续单频（图3）。请注意，刺激模式，频率，振幅和波型可以选择使用自制的控制软件（红色圆圈）。
   2. 突发的单一频率（图二）。阵阵爆裂之间的差距的长度也可选择。
   3. 线性扫描（图3 C）。最初和最终的频率是可选择的。
   4. 多刺激（图四）。单一的频率和线性扫描，可以结合在一个单一的实验。选择相应的参数后，控制软件，配置系统，并允许操作员通过点击一个按钮启动光同步录像和细胞刺激电脑屏幕上。
2. 拍摄的图像在高频率的AVI格式，作进一步的分析。

4。代表性的成果

1. 在这部影片中，两个孤立的外毛细胞显示时，他们正在与外部的交流电场，是平行的或横向的，分别刺激的长度或曲率的变化，其纵轴。 （电影＃2）。
2. OHCS能动反应分析行使用ProAnalyst软件（Xcitex公司，剑桥，马萨诸塞州）。 “特征跟踪”该软件的功能提供了帧帧（图4）两点之间的距离。在细胞缩短顶点（表皮板;红色）在选定点之间的距离和细胞（基底极;绿色）基数较小，且与细胞伸长增加。影片中展示了该软件分析帧一帧的长度变化。在图像的底部面板显示运动的轨迹。在这个例子中，总长度变化约6.5像素。
3. “轮廓跟踪”ProAnalyst软件的功能，可以检测到细胞边缘和自动测量的光学部分的面积（图5）。
4. 聚苯乙烯微球添加到随机液，并牢牢附着到质膜（图6）。可同时选择不同的微球，该软件可以自动跟踪他们一帧一帧。这样，细胞可分为部分和每一节的蠕动独立评估。 （图6 A）
5. 通过选择位于微球的细胞图像的外侧边缘，每个段的长度变化，并在一个段尊重的角度变化（弯曲）也可以被独立评估。 （图6B）

图1图EAEF发电机和与图像采集系统的联系。

图2：实验装置）的图片。二）在显微镜阶段，详细描绘电极和一个单一的OHC它们之间放置其纵轴平行电场的漫画。

图3。一个用户界面的配置为单频刺激国产控制软件）。选择的参数是在红色圈。 b）用户自制的控制软件的接口配置爆裂单频刺激。三）为线性扫描的刺激配置自制的控制软件的用户界面。四）控制配置多刺激国产软件的用户界面。

图4。一个OHC的单帧基地（绿色）和顶点（红色）的细胞，分别使用“功能跟踪”ProAnalyst软件的功能，选择了两个点。的单元格下方的曲线显示了电刺激所选择的点之间的距离的周期性变化。移动竖线不同的框架，可以选择个别的分析。

图5在ProAnalyst“轮廓跟踪”功能检测到细胞边缘，自动测量的光学部分的面积。

图6。一个一个孤立的OHC）拍摄的图像与聚苯乙烯微球（上），和微单独选择（下）与五个相同的图像装饰。不同的颜色分配给每个微球，和他们的位移可以单独和自动跟踪一帧一帧，分析和比较。二）任意长度的片段，可以选择聚苯乙烯微球的细胞边缘位于的定义，并在这些片段的长度变化，以及在尊重方向的一个部分的修改给别人（细胞弯曲），可自动评估框架帧图像分析软件。

电影1。豚鼠OHCS隔离。 点击这里观看视频

电影2。OHCS平行和垂直EAEF呈现出典型的electromotility和弯曲反应。 点击这里观看视频

Discussion

这里介绍的实验方法使OHC的能动反应在kHz的范围内没有任何限制细胞的运动估计。不同的刺激协议，额外的标记（微），以及细胞的方向与电场变化，使人们有可能探讨新的OHC蠕动方面与以前无法进入的细节水平。其他方法，例如那些采用光电二极管^或激光多普勒vibrometry ^10，需要严格控制的细 ​​胞中的位置。在这里，与此相反，所有的测量都属于同一单元格点之间进行，每个排量只有与在细胞形态，而不是与他们与外部参考帧运动的变化有关。可靠的测量横断面OHC的面积也很容易获得，它允许OHC的量的快速变化的估计。此外，更快，更灵敏的照相机和更好的图像分析软件的不断发展，保证质量的方法在不断改进。的技术，没有跨质膜电势控制，缺点是与目前所有的方法用于评估在kHz范围内的OHC蠕动共享限制。

因此，这里介绍的方法可能是一个听力研究的重要工具，能够基本OHCS“能动反应有关的细胞和分子机制提供新的和重要的线索

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leibovitz’s L-15	GIBCO, by Life Technologies	21083
Collagenase (Type 4)	Sigma-Aldrich	C5138	1mg/mL in L-15