Summary
ووصف طريقة موثوقة للتحقيق في الخلية الخارجي الشعر (OHC) ردود متحركة ، بما في ذلك electromotility ، حركية بطيئة والانحناء. وأثارت OHC حركية بواسطة التحفيز مع حقل خارجي الكهربائية بالتناوب ، وطريقة الاستفادة من تسجيل صورة عالية السرعة ، وإنارة LED مقرها ، ومشاركة برنامج تحليل الصور جيل.
Abstract
OHCs هي اسطوانية الخلايا الحسية الموجودة في الجهاز كورتي ، الجهاز السمعي داخل الأذن الداخلية الثدييات. اسم "خلايا الشعر" مستمد من حزمة من قمية المميزة لأهداب ساكنة ، عنصرا حاسما لكشف وتنبيغ من الطاقة السليمة 1. OHCs قادرة على تغيير شكلها ، استطال ، وتقصير ، وثني ، وذلك استجابة لتحفيز الكهربائية والميكانيكية والكيميائية ، واستجابة الحركية التي تعتبر حاسمة لتضخيم قوقعة من الإشارات الصوتية 2.
OHC التحفيز يدفع ردين متحركة مختلفة : ط) electromotility ، الملقب حركية سريعة ، والتغيرات في الطول في نطاق ميكروثانية المستمدة من كهربائيا يحركها التغييرات متعلق بتكوين البروتينات في السيارات المزدحمة بالسكان في غشاء البلازما OHC ، والثاني) حركية بطيئة ، والتغييرات في الشكل ميلي ثانية واحدة إلى مجموعة ثانية تشمل إعادة تنظيم هيكل الخلية 2 ، 3. ويرتبط مع electromotility OHC الانحناء ، وإما نتيجة التوزيع غير المتماثل من البروتينات السيارات في غشاء البلازما الوحشي ، أو التحفيز الكهربائي غير متكافئة من تلك البروتينات السيارات (على سبيل المثال ، مع مجال كهربائي عمودي على محور طويل من الخلايا) 4. المحفزات الميكانيكية والكيميائية تحفز الاستجابات بطيئة متحركة أساسا ، على الرغم من التغيرات في الظروف الأيونية للخلايا و / أو بيئتها يمكن أن تحفز أيضا جزءا لا يتجزأ من غشاء البلازما البروتينات السيارات 5 ، 6. منذ الاستجابات OHC متحركة تشكل عنصرا أساسيا من مكبر للصوت القوقعة ، والتحليل النوعي والكمي لهذه الاستجابات على ترددات صوتية متحركة (حوالي من 20 هرتز إلى 20 كيلو هرتز في البشر) هو أمر مهم جدا في مجال البحوث جلسة 7.
تطوير تكنولوجيا جديدة تجمع بين التصوير عالية السرعة videocameras ، وأنظمة الإضاءة LED ومقرها ومتطورة توفر برمجيات تحليل الصور الآن القدرة على أداء موثوق بها ونوعية الدراسات الكمية للاستجابة متحركة للOHCs المعزولة إلى حقل كهربائي خارجي بالتناوب (EAEF) 8. هذا هو أسلوب بسيط وغير الغازية التي تلتف معظم القيود المفروضة على النهج السابق 9-11. وعلاوة على ذلك ، ونظام إضاءة LED المستندة يوفر السطوع الشديد مع آثار ضئيلة الحرارية على عينات ، وبسبب استخدام الفحص المجهري للفيديو ، القرار الضوئية لا يقل عن 10 أضعاف أعلى مما مع التقنيات التقليدية المجهري الخفيفة 12. على سبيل المثال ، مع الإعداد التجريبية وصفها هنا ، يمكن للتغيرات في طول خلية من حوالي 20 نانومتر ، وبشكل روتيني يتم الكشف بشكل صحيح على الترددات من 10 كيلوهرتز ، ويمكن أن يكون هذا القرار مزيدا من التحسن في ترددات منخفضة نسبيا.
نحن واثقون من أن هذا النهج التجريبي سوف تساعد على توسيع فهمنا للآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء OHC حركية.
Protocol
1. عزلة OHCs
- يبدأ هذا الإجراء عن طريق حصاد العظام الصدغي من الخنازير الغينية والفئران أو النموذج الخاص الحيوانات الثديية.
- المقبل ، فتح العظام الزمنية باستخدام كلاب المطرقة من أجل فضح القوقعة ، وتزج بهم في يبوفيتش L - 15. إزالة الزائدة بعناية العظام ، والحفاظ على قذيفة عظمية سليمة. في حين أن هذا الإجراء عامة تنطبق على العظام الصدغي من أي نوع من الثدييات ، قد تغييرات طفيفة على تقنية ضرورية عند التعامل مع العظام الصدغي من الحيوانات الصغيرة جدا. في الحيوانات القديمة متكلسة عادة الفقاعة ، في معرض تقديمه لتعقيد إضافي لهذا الاجراء.
- تحت الملاحظة مجهري ، وفتح المنطقة قمية من القوقعة وإزالة السطر وعائي والرباط دوامة استخدام غيض من شفرة مشرط رقم 11 ، وهي نقطة صغيرة بيك ومنتاش الغرامة.
- يأخذ الجهاز كورتي الخروج من قوقعة عماد القوقعة باستخدام الملقط ، ووضعها في كولاجيناز 1mg/ml في L - 15 في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- إذا كانت هناك حاجة من OHCs يتحول القاعدية من القوقعة ، وإزالة القشرة العظمية التي تغطي قاعدة القوقعة مع بيك ، ومنفصلة في دوامة من العظم الصدغي باستخدام شفرة مشرط قبل إزالة الجهاز كورتي.
- نقل الجهاز كورتي إلى غرفة تسجيل باستخدام محقنة هاميلتون 50 ميكرولتر. بعد ذلك ، فصل الخلايا عن طريق ارتداد عن طريق الإبرة.
2. إعداد التجريبية
- رسم تخطيطي للالمتردد الكهربائية الخارجية مولد (EAEF) الميدانية وصلاتها مع نظام التقاط الصور (الشكل 1). ونفذت خصيصا للدائرة تحكم في صلب الهندسة في معهد الأذن البيت.
- الإعداد التجريبية المستخدمة في التجارب لدينا يتكون من مجهر مقلوب Axiovert 135TV (زايس ، Thornwood ، NY) مع نظام إضاءة LED البديل القائم على (السلطة العليا الصمام منظومة 36AD3500 ، لايت سبيد للتكنولوجيا ، وكامبل ، كاليفورنيا) ، وهما micromanipulators الإلكترونية (إيبندورف "Patchman" ، ألمانيا) ، التي يسيطر عليها جهاز كمبيوتر فائق السرعة Photron Fastcam 1024 X PCI الكاميرا (الولايات المتحدة الأمريكية Photron شركة) في ميناء كيلر وإضافي لاتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا العادية في ميناء trinocular. الكاميرا Fastcam قادرة على التقاط صور على ترددات عالية (تصل إلى 100،000 في الثانية) ، وارتفاع القرار (على سبيل المثال ، 1024 × 1024 بكسل في 1000 إطارا في الثانية ، 512 × 128 في 10000 في الثانية ، 384 × 96 إطارا في الثانية عند 18000 ، وهلم جرا). ويلاحظ وبشكل مباشر على الصور التي تقدمها كاميرا عالية السرعة في مراقبة أجهزة الكمبيوتر الشخصية ، في حين يتم توصيل الكاميرا إلى جهاز CCD مختلفة. نظام إضاءة LED المستندة يعمل في وضعين مختلفين : منخفضة الطاقة التناظرية والرقمية عالية الطاقة. يتم تنفيذ كافة الإجراءات الأولية (الأقطاب الكهربائية لتحديد المواقع ، وتحديد المواقع الخلية ، والتركيز ، الخ) باستخدام وضع الطاقة المنخفضة التناظرية. يتم فيها تشغيل إنارة عالية الطاقة على الفتحة التي من مصراع الكاميرا ، وتحولت بعد ذلك من قبل إغلاق مصراع الكاميرا ، وتسهيل تبديد الحرارة. برامج محلية الصنع ، وضعت أيضا في صميم الأذن البيت معهد الهندسة ، التي تعمل على نفس الكمبيوتر يتحكم في تحريك للكاميرا عالية السرعة ، ونظام إضاءة LED ومقرها في وEAEF. ألف كاميرا الصور الرقمية التقليدية في ميناء الجبهة لا يزال يسمح للإطارات حسب الحاجة. (شكل 2 أ).
- هي التي تحرك أقطاب (اثنان من 0.25 ملم قطر أسلاك الفضة مع غيض من مسافة 0.8 ملم) إلى موقف باستخدام أحد micromanipulators الالكترونية. ويتم رصد موقف أقطاب 'بصريا ومن خلال الصور المجهرية ؛ تغيير في المستوى البؤري للصورة يشير إلى أن أقطاب لمس الجزء السفلي من الغرفة التجريبية. في البداية ، هو مجال معايرة الكهربائية باستخدام إلكترود الخارجية. هذا القطب التدابير المحتملة الكهربائية في نقاط مختلفة ، وخلق "الخريطة" من الحقل الكهربائي. إذا وضعت خلية واحدة معزولة الخارجي بين الشعر نصائح من أقطاب موازية مع المحور الطولي للEAEF التطبيقية ، وسينتقل التطويل وتقصير في نفس التردد في الحقل الكهربائي. يمكن إذا وضعت الخلية عموديا على المجال يمكن ملاحظة نوع مختلف من الاستجابة OHC (الانحناء) والتحقيق فيها. (الشكل رقم 2 ب)
3. EAEF التحفيز والتقاط الصور
- أربعة بروتوكولات تنبيه مختلفة للاختيار (الشكل 3) :
- تردد واحد مستمر (الشكل 3 أ). لاحظ أنه يمكن تحديد الوضع التحفيز ، وتواتر ، واتساع موجة نوع باستخدام محلية الصنع برامج التحكم (الدوائر الحمراء).
- تردد واحد انفجر (الشكل 3 ب). يتم اختيار أيضا طول رشقات نارية والفجوات بين الانفجار.
- الخطي اكتساح (الشكل 3 C). يتم اختيار الترددات الأولية والنهائية.
- التحفيز متعددة (الشكل 3 د). ويمكن الجمع بين تردد واحد والاحتلالات الخطية في تجربة واحدة. بعد اختيار المعلمات المقابلة ، وبرامج التحكم تكوين النظام ويسمح للمشغل للشروع في ضوء تزامن تسجيل الفيديو وتحفيز الخلية عن طريق النقر على زر واحد فيشاشة الكمبيوتر.
- يتم التقاط الصور بتنسيق AVI لمزيد من التحليل على ترددات عالية.
4. ممثل النتائج
- في هذا الفيلم ، واثنين من عزل خلايا الشعر الخارجي تظهر تغيرات في طول أو الانحناء عندما يتم تحفيز لهم لحقل كهربائي خارجي المتردد الذي موازية أو عرضي ، على التوالي ، على المحور الطولي. (الفيلم # 2).
- ويتم تحليل ردود OHCs متحركة قبالة الخط باستخدام البرمجيات ProAnalyst (Xcitex شركة كامبريدج ، MA). "ميزة تتبع" وظيفة في هذا البرنامج يوفر المسافة بين نقطتين الإطار حسب الإطار (الشكل 4). خلال خلية تقصير المسافة بين نقاط مختارة على (لوحة جليدية ؛ اللون الأحمر) قمة وقاعدة الخلية (بصل القطب ؛ اللون الأخضر) هو أصغر ، ويزداد مع استطالة الخلايا. الفيلم يتناول البرنامج تحليل الإطار حسب الإطار التغيرات في الطول. لوحة في الجزء السفلي من الصورة يظهر أثر للحركة. في هذا المثال ، التغيير الكلي في طول نحو 6.5 بكسل.
- "يمكن أن تتبع كونتور" وظيفة في مجال البرمجيات ProAnalyst كشف حافة الخلية وقياس تلقائيا مساحة المقطع البصرية (الشكل 5).
- وأضاف المجهرية البوليسترين في حل حمام عشوائيا ونعلق بحزم إلى غشاء البلازما (الشكل 6 أ). يمكن تحديد المجهرية مختلفة في وقت واحد ، ويمكن البرنامج تلقائيا تعقب كل منهم الإطار من جانب الإطار. بهذه الطريقة ، يمكن تقسيم الخلايا في الفروع وحركية كل قسم تقييم مستقل. (شكل 6 أ)
- عن طريق اختيار المجهرية الموجودة على الحواف الجانبية للصورة الخلية ، ويمكن للتغيرات في طول كل قطعة والتغيرات في زاوية احترام شريحة واحدة إلى أخرى أيضا (الانحناء) يتم تقييمها بشكل مستقل. (الشكل 6B)
الشكل 1. رسم تخطيطي للمولد EAEF وصلاتها مع نظام التقاط صورة.
الشكل 2. صورة) من الإعداد التجريبية. B) تفاصيل المرحلة المجهر ، مع الرسوم المسيئة للأقطاب واحدة وضعت بين OHC لهم موازية المحور الطولي إلى الحقل الكهربائي.
الشكل 3. واجهة المستخدم) من برنامج مراقبة محلية الصنع لتكوين واحدة التردد التحفيز. وحلقت المعلمات المحدد باللون الأحمر. B) واجهة المستخدم للمنزل من صنع برامج التحكم عن انفجار واحد تكوين التردد التحفيز. C) واجهة المستخدم للمنزل من صنع برامج التحكم تكوين لتحفيز اكتساح الخطي. D) واجهة المستخدم للبرنامج حاسوبي لمراقبة محلية الصنع تكوين لتحفيز متعددة.
الشكل 4. الإطار واحدة من OHC برصيد نقطتين المحدد في القاعدة (الخضراء) وقمة (الحمراء) للخلية ، على التوالي ، وذلك باستخدام "ميزة تتبع" وظيفة من برنامج ProAnalyst. منحنى أسفل الخلية يبين التغيرات الدورية في المسافة بين النقاط المختارة المرتبطة التحفيز الكهربائي. ويمكن تحريك إطارات شريط عمودي مختلفة يتم اختيارها للتحليل الفردية.
الرقم 5 ، و "تعقب كونتور" وظيفة في ProAnalyst بالكشف عن حافة الخلية وقياس تلقائيا منطقة الباب البصرية.
الشكل 6. صورة) الملتقطة من OHC معزولة مزينة المجهرية البوليسترين (العلوي) ، ونفس الصورة مع خمسة المجهرية اختيار فردي (القاع). تم تعيين لون مختلف لكل microsphere ، والتشريد ، يستطيع أن يكون فرديا وتتبعها تلقائيا الإطار الإطار ، وتحليلها ومقارنتها. ب) يمكن تعريف قطاعات من طول التعسفي من خلال تحديد البوليسترين المجهرية الموجودة على حواف الخلية ، ويمكن أن تكون التغييرات في طول هذه القطاعات فضلا عن التغيرات في اتجاه احترام فئة واحدة للآخرين (خلية الانحناء) تقييم الإطار تلقائيا من قبل الإطار مع صورة برامج التحليل.
الفيلم 1. عزل OHCs خنزير غينيا. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو
الفيلم 2. OHCs متوازية ومتعامدة مع EAEF electromotility عرض نموذجي والاستجابات الانحناء. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المنهج التجريبي المقدمة هنا يمكن تقدير ردود OHC متحركة في نطاق كيلوهرتز دون أي قيود على حركة الخلية. بروتوكولات تنبيه مختلفة ، وعلامات إضافية (المجهرية) ، وكذلك التغيرات في اتجاه الخلية فيما يتعلق الحقل الكهربائي ، وجعل من الممكن تحقيق جوانب جديدة من حركية OHC مع مستوى التفاصيل التي يتعذر الوصول إليها سابقا. أساليب أخرى ، مثل تلك التي تستخدم photodiodes 9 أو الليزر دوبلر vibrometry 10 ، تحتاج إلى رقابة مشددة من موضع الخلية. هنا ، في المقابل ، يتم تنفيذ جميع القياسات بين نقاط ينتمون إلى نفس الخلية ، ويرتبط فقط كل النزوح مع التغيرات في شكل الخلية وليس مع حركتهم فيما يتعلق بجريمة من الإطار الخارجي للمرجعية. هنا أيضا قياسات موثوقة من مساحة OHC مستعرضة الحصول عليها بسهولة ، والذي يسمح لتقدير حجم التغيرات السريعة في OHC. بالإضافة إلى ذلك ، والتطوير المستمر من الكاميرات بشكل أسرع وأكثر حساسية وأفضل برنامج تحليل الصور ، وضمان تحسن مستمر في نوعية الأسلوب. والجانب السلبي للتقنية ، أي سيطرة على الجهد الكهربائي عبر غشاء البلازما ، هو الحد المشترك مع كافة الأساليب الحالية المستخدمة لتقييم OHC الحركية في نطاق كيلوهرتز.
وبالتالي ، قد يكون الأسلوب هو موضح هنا أداة هامة لسماع البحوث وقادرة على تقديم أدلة جديدة وهامة حول الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء ردود OHCs 'متحركة
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
العمل بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح R01DC10146/R01DC010397 ، P30 NIDCD الأساسية DC006276 بحوث والتعليم العالي. محتواه هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة نظر رسمية من المعاهد الوطنية للصحة أو التعليم العالي. الكتاب تعلن أي نزاع قائم أو محتمل في المصالح.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz’s L-15 | GIBCO, by Life Technologies | 21083 | |
| Collagenase (Type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | 1mg/mL in L-15 |
References
- Frolenkov, G. I. Genetic insights into the morphogenesis of inner ear hair cells. Nat Rev Genet. 5, 489-498 (2004).
- Ashmore, J. Cochlear outer hair cell motility. Physiol Rev. 88, 173-210 (2008).
- Dallos, P., Fakler, B. Prestin, a new type of motor protein. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 3, 104-111 (2002).
- Frolenkov, G. I. Cochlear outer hair cell bending in an external electrical field. Biophys. J. 73, 1665-1672 (1997).
- Matsumoto, N., Kalinec, F. Extraction of Prestin-Dependent and Prestin-Independent Components from Complex Motile Responses in Guinea Pig Outer Hair Cells. Biophys J. 89, 4343-4351 (2005).
- Matsumoto, N., Kalinec, F. Prestin-dependent and prestin-independent motility of guinea pig outer hair cells. Hear Res. 208, 1-12 (2005).
- Ashmore, J. The remarkable cochlear amplifier. Hear Res. 266, 1-17 (2010).
- Kitani, R., Kakehata, S., Kalinec, F. Motile responses of cochlear outer hair cells stimulated with an alternating electrical field. Hearing Research. , (2011).
- Dallos, P., Evans, B. N. High-frequency outer hair cell motility: corrections and addendum. Science. 268, 1420-1421 (1995).
- Frank, G., Hemmert, W., Gummer, A. W. Limiting dynamics of high-frequency electromechanical transduction in outer hair cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 4420-4425 (1999).
- Santos-Sacchi, J. On the frequency limit and phase of outer hair cell motility: effects of the membrane filter. J. Neurosci. 12, 1906-1916 (1992).
- Inoué, S. Video Microscopy. , Plenum Press. New York. (1986).
