Summary
Un metodo affidabile per studiare delle cellule esterne capelli (OHC) risposte di mobili, tra cui electromotility, motilità lenta e flessione, è descritto. Motilità OHC è provocato dalla stimolazione con un esterno di campo elettrico alternato, e il metodo si avvale di alte velocità di registrazione delle immagini, a base di illuminazione a LED, e l'ultima generazione di software di analisi di immagine.
Abstract
OHC sono cilindriche cellule sensomotorio trova l'organo del Corti, l'organo uditivo all'interno dell'orecchio interno dei mammiferi. Il nome "cellule ciliate" deriva dal loro caratteristico fascio apicale di stereociglia, un elemento critico per la rilevazione e trasduzione di energia sonora 1. OHC sono in grado di cambiare forma-allungare, accorciare e piegare-in risposta alla stimolazione elettrica, meccanica e chimica, una risposta motoria considerato cruciale per l'amplificazione di segnali acustici cocleari 2.
Stimolazione OHC induce due risposte diverse mobili: i) electromotility, alias motilità veloce, variazioni di lunghezza nel range microsecondo derivati da cambiamenti conformazionali a trazione elettrica in proteine motrici densamente OHC nella membrana plasmatica, e ii) la motilità lenta, cambia forma nel millisecondi a secondi gamma di riorganizzazione del citoscheletro 2, 3. OHC flessione è associato con electromotility, e il risultato sia da una distribuzione asimmetrica delle proteine motrici nella membrana plasmatica laterale, o asimmetrica stimolazione elettrica di queste proteine motore (ad esempio, con un campo elettrico perpendicolare all'asse lungo delle cellule) 4. Stimoli meccanici e chimici inducono risposte mobili essenzialmente lento, anche se i cambiamenti nelle condizioni ionico delle cellule e / o del loro ambiente può anche stimolare la membrana plasmatica-embedded proteine motrici 5, 6. Dal momento che le risposte OHC mobili sono una componente essenziale dell'amplificatore cocleare, l'analisi qualitativa e quantitativa di queste risposte mobili a frequenze acustiche (approssimativamente da 20 Hz a 20 kHz negli esseri umani) è una questione molto importante nel campo della ricerca dell'udito 7.
Lo sviluppo della nuova tecnologia di imaging ad alta velocità che unisce telecamere, sistemi basati su LED di illuminazione e sofisticati software di analisi dell'immagine offre ora la possibilità di eseguire qualitativo affidabile e studi quantitativi della risposta mobili di OHC isolato in un campo elettrico alternato esterno (EAEF) 8. Questa è una tecnica semplice e non invasivo che aggira la maggior parte dei limiti degli approcci precedenti 9-11. Inoltre, il LED basato su sistema di illuminazione fornisce luminosità estrema con insignificanti effetti termici sui campioni e, per l'uso della microscopia video, risoluzione ottica è di almeno 10 volte più alta rispetto alle tradizionali tecniche di microscopia ottica 12. Ad esempio, con l'impostazione sperimentale descritta qui, variazioni di lunghezza delle cellule di circa 20 nm, possono essere regolarmente rilevati e affidabile a frequenze di 10 kHz, e questa risoluzione può essere ulteriormente migliorati a frequenze più basse.
Siamo fiduciosi che questo approccio sperimentale contribuirà a estendere la nostra comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari alla base della motilità OHC.
Protocol
1. Isolamento di OHC
- Iniziare questa procedura per la raccolta delle ossa temporali da cavie, topi o il vostro modello animale dei mammiferi.
- Quindi, aprire le ossa temporali utilizzando una pinza martello al fine di esporre la coclea, e immergile nella Leibovitz L-15. Togliere l'eccesso di osso con attenzione, mantenendo intatto il guscio osseo. Considerando che questa è una procedura generale applicabile alle ossa temporale di qualsiasi specie di mammiferi, piccole modifiche alla tecnica può essere necessaria quando si tratta di ossa temporali da animali molto piccoli. Negli animali vecchi della bolla di solito è calcificato, introducendo un'ulteriore complicazione alla procedura.
- Sotto osservazione microscopica, aprire la regione apicale della coclea e rimuovere vascularis stria e del legamento spirale usando la punta della lama di un bisturi # 11, un punto di micro e scegliere una pinzetta sottile.
- Prendete l'Organo di Corti fuori dal modiolus cocleare con la pinzetta, e lo mise in collagenasi 1mg/ml in L-15 a temperatura ambiente per 5 min.
- Se OHC da trasforma basale della coclea sono necessari, rimuovere il guscio osseo che copre la base della coclea con il piccone, e separare la spirale dal dell'osso temporale con il bisturi prima di rimuovere l'organo di Corti.
- Trasferimento dell'organo del Corti alla camera di registrazione con una siringa da 50 microlitri Hamilton. In seguito, le cellule si dissociano da reflusso attraverso l'ago.
2. Setup sperimentale
- Schema del campo elettrico alternato Esterne (EAEF) generatore e il loro collegamento con il sistema di acquisizione delle immagini (fig. 1). La circuiteria di controllo è stato appositamente implementato presso il Nucleo di Ingegneria dell'Università degli Ear House Institute.
- Il setup sperimentale utilizzato nei nostri esperimenti è costituito da un microscopio Axiovert 135TV invertito (Zeiss, Thornwood, NY) con un'alternativa basata su LED sistema di illuminazione (LED ad alta potenza del sistema-36AD3500, tecnologie Lightspeed, Campbell, CA), due micromanipolatori elettronica (Eppendorf "PatchMan", Germania), un PC controllato ad altissima velocità Photron Fastcam X 1024 PCI fotocamera (Photron USA Inc.) nel porto Keller e una telecamera aggiuntiva CCD regolari nel porto trinoculare. La fotocamera Fastcam è in grado di catturare immagini ad alta frequenza (fino a 100.000 fps) e ad alta risoluzione (ad esempio, 1024 x 1024 pixel a 1000 fps, 512 x 128 a 10.000 fps, 384 x 96 a 18.000 fps, e così via). Le immagini fornite dalla telecamera ad alta velocità sono osservati direttamente nel monitor del PC, mentre la telecamera CCD è collegata a un altro monitor. Il LED basati su sistema di illuminazione funziona in due modalità differenti: a bassa potenza analogico e digitale ad alta potenza. Tutte le procedure preliminari (posizionamento elettrodi, posizionamento delle cellule, fuoco, ecc) sono eseguite utilizzando le modalità di risparmio energetico analogica. L'elevata potenza di illuminazione si accende l'apertura l'otturatore della fotocamera e poi spenta con la chiusura dell'otturatore, facilitando la dissipazione del calore. Software fatto in casa, anche sviluppato presso il Nucleo Ear Casa Engineering Institute, in esecuzione sullo stesso PC controlla il grilletto della telecamera ad alta velocità, il LED basato su sistema di illuminazione, e la EAEF. Una macchina fotografica digitale convenzionale in porto frontale permette di fotogrammi, se necessario. (Fig. 2 A).
- Elettrodi (due 0,25 millimetri di diametro fili di Ag con la distanza punta di 0,8 mm) sono spinti a posizione utilizzando uno dei micromanipolatori elettronico. Posizione elettrodi 'è monitorato visivamente e attraverso l'immagine microscopica, un cambiamento nel piano focale dell'immagine indica che gli elettrodi toccato il fondo della camera sperimentale. Inizialmente, il campo elettrico viene calibrato utilizzando un elettrodo esterno. Questo elettrodo misura il potenziale elettrico in punti differenti, generando una "mappa" del campo elettrico. Se una singola cellula isolata ciliate esterne è posto tra le punte degli elettrodi con il suo asse longitudinale parallelo alla EAEF applicata, si muoverà allungamento e accorciamento alla stessa frequenza del campo elettrico. Se la cella è posizionato perpendicolarmente al campo un diverso tipo di risposta OHC (flessione) possono essere osservati e studiati. (Fig. 2 B)
3. EAEF stimolazione e l'acquisizione delle immagini
- Quattro diversi protocolli di stimolazione sono selezionabili (Fig. 3):
- continuo singola frequenza (Fig. 3 A). Si noti che tipo di modalità di stimolo, frequenza, ampiezza e onda può essere selezionata usando il fatto in casa software di controllo (cerchi rossi).
- scoppiata singola frequenza (Fig. 3 B). La lunghezza delle esplosioni e le lacune tra scoppio sono selezionabili.
- lineare sweep (fig. 3 C). Le frequenze iniziale e finale sono selezionabili.
- multi-stimolazione (Fig. 3 D). Singola frequenza e spazza lineari possono essere combinati in un singolo esperimento. Dopo aver selezionato i parametri corrispondenti, il software di controllo configura il sistema e consente all'operatore di avviare luce sincronizzato registrazione video e la stimolazione delle cellule facendo clic su un solo pulsante insullo schermo del computer.
- Le immagini sono catturati in formato AVI per ulteriori analisi ad alte frequenze.
4. Rappresentante Risultati
- In questo film, due cellule ciliate esterne isolate mostrano cambiamenti nella lunghezza e curvatura, quando sono stimolati da un campo elettrico alternato esterna che è parallela o trasversale, rispettivamente, al loro asse longitudinale. (Movie # 2).
- Risposte OHC mobili vengono analizzati off-line utilizzando il software ProAnalyst (Xcitex Inc., Cambridge, MA). "Tracking Feature" funzione di questo software fornisce la distanza tra due punti di frame-by-frame (Fig. 4). Nel corso delle cellule accorciare la distanza tra i punti selezionati al vertice (cuticolare piatto, di colore rosso) e la base della cellula (polo basale, di colore verde) è più piccolo, e aumenta con l'allungamento delle cellule. Il filmato mostra il software di analisi fotogramma per fotogramma le variazioni di lunghezza. Il pannello in basso l'immagine mostra la traccia del movimento. In questo esempio, la variazione totale in lunghezza è di circa 6,5 pixel.
- "Contour Tracking" funzione nel software ProAnalyst in grado di rilevare automaticamente i bordi delle cellule e misurare l'area della sezione ottica (Fig. 5).
- Microsfere di polistirolo aggiunto alla soluzione del bagno in modo casuale e fermamente allegare alla membrana plasmatica (Fig. 6 A). Diverse microsfere possono essere selezionati contemporaneamente, e il software può automaticamente traccia di tutti i loro fotogramma per fotogramma. In questo modo, le cellule possono essere divise in sezioni e la motilità di ogni sezione valutato in maniera indipendente. (Fig. 6 A)
- Selezionando microsfere trova al margine laterale dell'immagine cellula, variazioni di lunghezza di ciascun segmento e cambiamenti di angolo di un segmento rispetto ad altri (flessione) può anche essere valutato in maniera indipendente. (Fig. 6B)
Figura 1. Schema del generatore EAEF e sui loro collegamenti con il sistema di acquisizione dell'immagine.
Figura 2. Un'immagine) del setup sperimentale. B) Particolare del palco microscopio, con vignette raffiguranti il elettrodi e una singola OHC posto tra loro con il suo parallelo all'asse longitudinale del campo elettrico.
Figura 3. A) Interfaccia utente del software di controllo fatto in casa configurato per singola frequenza di stimolazione. I parametri selezionati sono cerchiati in rosso. B) l'interfaccia utente del fatto in casa software di controllo configurato per scoppiare a frequenza singola stimolazione. C) l'interfaccia utente del fatto in casa software di controllo configurato per la stimolazione scansione lineare. D) Interfaccia utente del software di controllo fatto in casa configurato per il multi-stimolazione.
Figura 4. Singolo fotogramma di uno OHC con due punti selezionati alla base (verde) e l'apice (rosso) della cellula, rispettivamente, con il "tracking Feature" funzione del software ProAnalyst. La curva sotto la cella mostra le variazioni periodiche della distanza tra i punti selezionati associati con la stimolazione elettrica. Spostando la barra verticale telai differenti possono essere selezionati per l'analisi individuale.
Figura 5. Il "Monitoraggio Contour" funzione ProAnalyst rileva il bordo delle cellule e automaticamente misurare l'area della sezione ottica.
Figura 6. Un'immagine) Catturato un OHC isolato decorato con microsfere di polistirolo (in alto), e la stessa immagine con cinque microsfere selezionati singolarmente (in basso). Un colore diverso è stato assegnato a ogni microsfera, ed i loro spostamenti possono essere individualmente e automaticamente fotogramma per fotogramma monitorati, analizzati e confrontati. B) segmenti di lunghezza arbitraria può essere definito selezionando polistirolo microsfere trova al margine della cellula, e variazioni di lunghezza di questi segmenti così come i cambiamenti di orientamento di un segmento rispetto ad altri (cella di piegatura) possono essere valutate automaticamente fotogramma per telaio con il software di analisi delle immagini.
Movie 1. Isolamento di Guinea OHC maiale. Clicca qui per guardare il video
Movie 2. OHC parallela e perpendicolare al EAEF mostrando electromotility tipici e le risposte di curvatura. Clicca qui per guardare il video
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Discussion
Il metodo sperimentale presentato qui permette di valutare le risposte OHC mobili della gamma kHz senza alcuna restrizione al movimento della cellula. Protocolli di stimolazione differenti, altri marker (microsfere), come pure i cambiamenti nell'orientamento della cella con riguardo al campo elettrico, permettono di indagare nuovi aspetti della motilità OHC con un livello di dettaglio precedentemente inaccessibili. Altri metodi, ad esempio quelli che utilizzano fotodiodi 9 o laser Doppler vibrometria 10, richiedono uno stretto controllo della posizione della cella. Qui, al contrario, tutte le misurazioni sono eseguite tra i punti appartenenti alla stessa cella, e ogni spostamento è solo associata a cambiamenti nella forma delle cellule e non con il loro movimento rispetto ad un quadro di riferimento esterno. Misurazioni affidabili di sezione trasversale OHC sono anche facilmente reperibili, che consente una stima dei veloci cambiamenti di volume OHC. Inoltre, il continuo sviluppo delle macchine fotografiche più veloce e più sensibile e migliore software di analisi dell'immagine, garantiscono un miglioramento continuo della qualità del metodo. Un aspetto negativo della tecnica, nessun controllo sul potenziale elettrico attraverso la membrana plasmatica, è una limitazione condiviso con tutti i metodi attualmente utilizzati per valutare la motilità OHC nella gamma kHz.
Pertanto, il metodo qui descritto potrebbe essere un importante strumento per l'ascolto di ricerca, in grado di fornire nuovi indizi e importanti sui meccanismi cellulari e molecolari alla base OHC 'risposte mobili
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Lavoro supportato da National Institutes of Health sovvenzioni R01DC10146/R01DC010397, dell'NIDCD P30 DC006276 Core Research, e istituti di istruzione superiore. Il suo contenuto è esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del NIH o istituti di istruzione superiore. Gli autori dichiarano assenza di conflitto attuale o potenziale di interesse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz’s L-15 | GIBCO, by Life Technologies | 21083 | |
| Collagenase (Type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | 1mg/mL in L-15 |
References
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