Summary
एक अनूठी शल्य चिकित्सा पद्धति और इलेक्ट्रोड के विशेष आकार का उपयोग करके विकासशील माउस मस्तिष्क में एक जीन स्थानांतरण विधि वर्णित है. इस अनूठी तकनीक प्लाज्मिड अस्थायी और spatially डीएनए है, जो मस्तिष्क के विकास का अध्ययन में कई neuroscientists सहायता करेगा के अभिकर्मक की अनुमति देता है.
Protocol
1. इंजेक्शन के लिए केशिका और डीएनए समाधान की तैयारी
- प्लास्मिड डीएनए एक मैक्सी प्रस्तुत करने या समकक्ष विधि के साथ, शुद्ध और 2-3 μg / μl के अंतिम एकाग्रता. डीएनए के 100 μg विभाज्य है, तेजी से हरे (1% शेयर) डाई और ते के 10μl जोड़ने और (10mm Tris बेस, 1mm EDTA समाधान, पीएच 8.0) 100 μl के लिए एक मात्रा को समायोजित करने के लिए / 1μg इंजेक्शन मिश्रण के लिए अंतिम डीएनए एकाग्रता μl. प्लास्मिड डीएनए की एकाग्रता बदला जा सकता है प्लाज्मिड के आकार पर निर्भर करता है, और यह भी अपने अभिकर्मक दक्षता, जो व्यक्तिगत रूप से परीक्षण किया जा जरूरत है.
- 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 14,000 RPM में डीएनए समाधान और स्पिन के लिए किसी भी अवशेषों को हटाने के लिए सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा.
- एक गिलास केशिका tubea गिलास केशिका एक micropipette खींचने का उपयोग ट्यूबों खींचो. संदंश के साथ टिप टिप एक 20-30 सुक्ष्ममापी व्यास चुटकी. टिप से 800 मिमी-1 सुक्ष्ममापी उपाय और बाहरी व्यास की जांच कम से कम 60 सुक्ष्ममापी है (छवि 1 ए ).
- Micromanipulator केशिका कनेक्ट है, और खनिज तेल के साथ भरें. डीएनए समाधान, डूब समाधान में टिप के साथ केशिका भरने और डीएनए समाधान चूसना.
2. प्लैटिनम इलेक्ट्रोड छड़ी
यहाँ हम छड़ी प्लैटिनम इलेक्ट्रोड (Nepe जीन, CUY611P2-1) का इस्तेमाल मस्तिष्क के सतही प्रांतस्था (छवि 1F) के रूप में, इस क्षेत्र में electroporate.
3. सूक्ष्म इलेक्ट्रोड तैयार
सूक्ष्म इलेक्ट्रोड का उपयोग करें मस्तिष्क (यानी, thalamus और hypothalamus) (छवि 2B - ई) के गहरे भागों में electroporated.
- टंगस्टन का एक अंत (नकारात्मक इलेक्ट्रोड के लिए) और प्लैटिनम तार (सकारात्मक इलेक्ट्रोड के लिए) सोना चढ़ाया पिनों पर coiled है और parafilm के साथ तय की. एक कपास झाड़ू के स्टेम करने के लिए तार डालें और parafilm (छवि 1B) के साथ दोनों सिरों लपेटो.
- समान रूप से sandpaper के साथ तार की नोक पैनापन जब तक यह 20-30 सुक्ष्ममापी बाहरी व्यास और 800 से 60 सुक्ष्ममापी सुक्ष्ममापी 1 टिप के मिमी (छवि 1C और डी) तक पहुँचता है.
- इन्सुलेशन के लिए तार करने के लिए पॉलिश नाखून की एक पतली कोट लागू करें. नेल पॉलिश के बाद सूख गया है, एक एसीटोन से लथपथ कपास झाड़ू का उपयोग करने के लिए यह टिप (सुक्ष्ममापी टिप से 200 के बारे में) से दूर. महत्वपूर्ण नोट: आदेश में माउस गर्भाशय को नुकसान को रोकने के लिए, 800 के भीतर भाग सुक्ष्ममापी 1 टिप के मिमी व्यास में 70 से अधिक नहीं सुक्ष्ममापी (छवि 1E) होना चाहिए.
4. सर्जरी की तैयारी
- एक गर्भवती माउस anesthetize (E9.5 - E15.5). हम दवा ग्रेड सोडियम pentobarbital साथ anesthetization दिखाना है (तालिका II, ग्राम शरीर के वजन के 50 प्रतिशत μg, intraperitoneally इंजेक्षन और 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा). एक चतनाशून्य करनेवाली औषधि के रूप में pentobarbital सोडियम वैकल्पिक Ketamine / Xylazine इंजेक्शन या गैस anesthetics (गैस कम अवधि प्रक्रियाओं के लिए बेहतर है) शामिल हैं. इंजेक्शन ध्यान के साथ किया जाना चाहिए किसी भी अंगों से बचने, अन्यथा यह गर्भाशय नुकसान या पशु को मारने के कारण होगा. जब सफल आईपी किया जाता है, जीवित रहने की दर 95% से अधिक है. इसके अलावा सर्जरी खुली हवा वातावरण में किया जा सकता है. इससे पहले कि जानवर द्वारा उनके पैर की अंगुली pinching संवेदनाहारी पुष्टि करने के लिए प्रतिक्रिया की कमी के लिए संचालन, परीक्षण शुरू कर दिया.
- एक रेजर ब्लेड और 50% EtOH का उपयोग पेट से बाल दाढ़ी. Betadine और शराब की scrubs की (70%) बारी के साथ त्वचा की तैयारी.
- ठीक कैंची के साथ पेट midline पर एक चीरा और एक 37 पर सभी गर्भाशय सींग खींच सावधानी ° buffered - फॉस्फेट सी पूर्व गर्म खारा (पीबीएस) सिक्त कपास धुंध, जो घाव के आसपास रखा गया है. समय के सभी पीबीएस के साथ गर्भाशय नम रखें.
- सूचकांक और मध्यम उंगलियों के बीच एक लचीला फाइबर ऑप्टिक केबल पकड़ो और यह गर्भाशय सींग के तहत जगह है. 70% से पहले EtOH उपयोग करने के लिए के साथ स्वच्छ केबल. माइक्रोस्कोप या ताल दृश्य के लिए आवश्यक है. फाइबर ऑप्टिक प्रकाश ऑप्टिक केबल और अंगूठे के बीच स्थिति गर्भाशय, और धीरे से निचोड़ करने के लिए ऊपर भ्रूण गर्भाशय की दीवार के करीब धक्का.
5. डीएनए और electroporation की इंजेक्शन
- जब भ्रूण तैनात है, सम्मिलित करते हैं, कांच लक्ष्य वेंट्रिकल में सावधानी केशिका और डीएनए समाधान के लगभग 1 μl (2A छवि) इंजेक्षन.
- BrainIf electoporation के लिए छड़ी प्लैटिनम इलेक्ट्रोड के साथ प्रयोग के ऊपरी भाग के लिए electroporation के लिए, गर्भाशय के बाहर इलेक्ट्रोड जगह और निर्माण अनुदेश के अनुसार सुझाव दिया वर्ग लहर वर्तमान दालों लागू (मैं टेबल). यदि मस्तिष्क की गहरी हिस्सा usingFor electroporation, nmicro electroporation, eedle प्रकार इलेक्ट्रोड उपयोग किया जाता है. डीएनए में ठीक टंगस्टन नकारात्मक इलेक्ट्रोड Iinsert गर्भाशय में और दो इलेक्ट्रोड के बीच जगह लक्षित क्षेत्र वेंट्रिकल और एक प्लैटिनम इलेक्ट्रोड इंजेक्शन, तो वर्ग लहर वर्तमान दालों (मैं टेबल) (छवि 2B) लागू सुझाव दिया.
6. डाक electroporation
- अपने orig में गर्भाशय सींग वापस प्लेससाथ inal स्थान और 37 डिग्री सेल्सियस पीबीएस पूर्व गर्म 500 μL जोड़ें.
- शल्य सिवनी और एक 9 एमएम autoclipauto क्लिप के साथ बंद बाहरी परत के साथ भीतरी परत सिवनी.
- 2 घंटे के लिए एक हीटिंग पैड पर रखें जानवरों संज्ञाहरण से वसूली की अनुमति देने के लिए. Carprofen या buprenorphine जैसे दर्दनाशक दवाओं पोस्ट ऑपरेटिव दर्द के लिए प्रशासित किया जा सकता है है.
7. प्रतिनिधि परिणाम:
PCAG - EYFP के cortical electroporation की कुछ उदाहरण अलग अलग समय बिंदुओं पर छड़ी प्लैटिनम इलेक्ट्रोड का उपयोग निर्माण आंकड़ा चित्रा 32 में दिखाया जाता है. दिमाग E14.5 E13.5, और E15.5 electroporated हैं, और प्रसव के बाद (पी) दिन 6 पर काटा. AThe RORc ntibody धुंधला से पता चलता है 4 परत और EYFP ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की स्थिति की स्थिति GFP एंटीबॉडी धुंधला द्वारा पता चला रहे हैं, और दोनों छवियों सुपर लगाया (छवि 3 ए और बी ) कर रहे हैं. लेबल cortical कोशिकाओं रहे हैं cortical electroporated कोशिकाओं की परत स्पष्ट रूप से प्रत्येक (32 छवि) प्रयोग, जो पता चलता है समय पर निर्भर electroporation cortical परत विशिष्ट संभव GOF / LOF बनाता है में अलग है.
भ्रूण सेल अभिकर्मक और दक्षता की व्यवहार्यता भ्रूण की उम्र और electroporation के स्थान पर निर्भर करता है. नमूने 1 पटल पर सूचीबद्ध हैं, तथापि, स्थितियों प्रत्येक चरण पर निर्भर करता है और मस्तिष्क का हिस्सा electroporation के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए.
Thalamus और छड़ी प्लैटिनम इलेक्ट्रोड का उपयोग के साथ hypothalamus के रूप में एक गहरी ऊतक में electroporation अक्सर कम दक्षता (1 टेबल) दे. यह समस्या सूक्ष्म इलेक्ट्रोड whichelectrodes, जो मस्तिष्क के गहरे भागों तक पहुंच जाएगा का उपयोग करके हल किया जा सकता है. चित्रा 3 4 विकासशील diencephalon में electroporation pCAG EYFP के उदाहरण से पता चलता है. प्लास्मिड डीएनए समाधान 3 Rd निलय में E11.5 में अंतःक्षिप्त है और सूक्ष्म electroporation (3C4C छवि) द्वारा पीछा किया . electroporated क्षेत्र thalamus में प्रतिबंधित है जहां axons परियोजना के सबसे प्रांतस्था (3B4B छवि). प्रांतस्था के 4 परत करने के लिए Axon प्रक्षेपण भी कल्पना EYFP, जो पूरे न्यूरॉन fillesfills द्वारा किया जा सकता है. (3A4A छवि).
चित्रा 1 कार्टून केशिका के सही आकार का प्रदर्शन योजनाबद्ध. (ए) एक गिलास केशिका ट्यूब एक micropipette खींचने का उपयोग करने के लिए निश्चित आकार बनाने के लिए खींच लिया है. एक टिप संदंश द्वारा pinched बंद करने के लिए यह 20-30 सुक्ष्ममापी है. टिप (लाल ब्रैकेट) से 800 सुक्ष्ममापी 1mm उपाय और सुनिश्चित करें कि बाहरी व्यास में कम से कम 60 सुक्ष्ममापी (हरी कोष्ठक). (बी) टंगस्टन या प्लैटिनम तार का एक अंत सोना चढ़ाया पिनों पर coiled है और parafilm के साथ तय. फिर रेत कागज का उपयोग करने के लिए अपने टिप बनाने के लिए 20-30 सुक्ष्ममापी बाहरी व्यास और 60 के टिप 1 मिमी से सुक्ष्ममापी बन. (सी) टंगस्टन तार की छवि को आकार देने से पहले. (डी) को आकार देने के बाद टंगस्टन तार की छवि. (ई) नेल पॉलिश की पतली कोट लागू करने के बाद तार टंगस्टन की छवि. ई में स्केल बार CE के लिए 10 सुक्ष्ममापी (छोटी पैमाने) है. (एफ) स्टिक प्लैटिनम इलेक्ट्रोड (नेपा जीन. CUY611P2-1). एफ में स्केल बार 2 मिमी है.
चित्रा 2. शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के कार्टून स्कीमा. (ए) पार्श्व वेंट्रिकल या बड़े भ्रूण (बाईं ओर) में और 3 Rd वेंट्रिकल या छोटे भ्रूण (सही पक्ष) में इंजेक्शन के आरेख. प्लैटिनम छड़ी इलेक्ट्रोड (बाईं ओर) और सुई प्रकार इलेक्ट्रोड (सही पक्ष) (बी) electrporation का आरेख.
चित्रा 3 माउस telencephalon का विकास करना. PCAG - EYFP साथ E13.5 (ए), E14.5 (बी) और E15.5 (सी) पर electroporated किया गया था और P6 पर काटा. दिमाग राज्याभिषेक sectioned और अलग GFP एंटीबॉडी या RORc एंटीबॉडी के साथ दाग थे और छवियों विलय कर रहे हैं. (ए) E13.5 transfect कई परत 4 न्यूरॉन्स पर प्लाज्मिड pCAG - EYFP electroporation. जो 4 मार्करों RORc परत के साथ ओवरलैप. (बी) E14.5 transfect कोशिकाओं है, जो 4 न्यूरॉन्स परत की तुलना में अधिक सतही हैं पर प्लाज्मिड pCAG - EYFP electroporation. (सी) E15.5 2 / 3 परत के रूप में electroporation लेबल कई सतही न्यूरॉन्स. स्केल बार 200 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 4 EYFP के thalamo cortical axons (TCA) में अभिकर्मक. (ए) cortical परत में 4 TCA टर्मिनस GFP एंटीबॉडी धुंधला से पता चला है. RORc एंटीबॉडी धुंधला 4 परत की स्थिति प्रकट करने के लिए प्रयोग किया जाता है. दोनों छवियों को एक ही अनुभाग से लिया जाता है और विलय. (बी) thalamus में electroporation की स्थिति भी GFP एंटीबॉडी धुंधला हो जाना और RORc धुंधला हो जाना है, जो अभिव्यक्ति 11 thalamus में प्रतिबंधित है के द्वारा दिखाया गया है. (सी) thalamic electroporation और TCA प्रक्षेपण के लिए कार्टून योजनाबद्ध दिखाए जाते हैं. स्केल बार 200 सुक्ष्ममापी.
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम केवल एक छोटे से भ्रूण मस्तिष्क के अलग आकार इलेक्ट्रोड का उपयोग प्रतिबंधित क्षेत्र में pCAG - EYFP अभिकर्मक की तकनीक के लाभों का वर्णन. के लिए अभिकर्मक दक्षता के विभिन्न प्रमोटर द्वारा तुलना पहले से वर्णित है, जो सेल प्रकार एक विशिष्टता से पता चलता है. हालांकि, वहाँ अभिकर्मक के रूप में ऐसी तकनीक के लिए सीमाएं हैं केवल क्षणिक है और प्लाज्मिड पर निर्भर बदलता है, यह किसी भी सेल विशिष्टता नहीं है और यह ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की संख्या पर नियंत्रण कठिन है. ThereforeHowever, अन्य तकनीकों के साथ इस प्रोटोकॉल के संयोजन आगे अलग हेरफेर तरीकों के लिए संभावनाओं प्रदान करेगा. सबसे पहले, प्लास्मिड डीएनए में सेल विशिष्ट प्रमोटर शामिल सेल प्रकार न्यूरॉन्स, glial कोशिकाओं और astrocytes जैसे विशिष्ट अभिकर्मक, की अनुमति देगा. दूसरा, के बाद से अभिकर्मक क्षणिक है, यह वैज्ञानिकों ने बाद में जीवन में जीन के समारोह का विश्लेषण करना चाहते हैं के लिए उपयुक्त नहीं है. इसलिए, प्लास्मिड डीएनए जीनोम में एकीकृत transposase के साथ संयोजन यह एक स्थिर 8 अभिकर्मक में बदल जाएगा . Tet पर या tet बंद प्रणाली के अगले गोद लेने, यह संभव समय या तंत्रिका कोशिकाओं 8 में टाइप विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति सेल हेरफेर करने के लिए कर देगा. वैकल्पिक रूप से, एक tamoxifen-inducible (टी) Cre ईआर 9 recombinases और रिपोर्टर 10 चूहों के साथ इस प्रोटोकॉल गठबंधन कर सकते हैं.
ऊतकों के इस व्यापक पहुंच काफी तंत्रिका विज्ञान में प्रयोग किया जाता प्रयोगात्मक डिजाइन बदल जाएगा.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम आरआईकेईएन मस्तिष्क विज्ञान संस्थान (बीएसआई), मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम (HFSP) (टीएस के लिए सम्मानित किया गया) और आरआईकेईएन जूनियर रिसर्च एसोसिएट कार्यक्रम (JRA, एम.के. के लिए सम्मानित किया) आरआईकेईएन मस्तिष्क विज्ञान संस्थान (बीएसआई), मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित किया गया था (HFSP) (टीएस करने के लिए सम्मानित किया गया) और आरआईकेईएन जूनियर रिसर्च एसोसिएट कार्यक्रम (JRA, एम.के. को सम्मानित किया) यह काम वित्त पोषित.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bare tungsten wire diameter 125 μm | A-M Systems | 797600 | |
| bare platinum wire diameter 125 μm | A-M Systems | 767000 | |
| Stick electrodes | Nepa gene | CUY610P4-1 | |
| glass capillary tube | Stoelting Co. | 50611 | |
| micromanipulator | KD Scientific | KDS310 | |
| scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5865 | |
| pulse generator | A-M Systems | Model 2100 | |
| 9 mm autoclip | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9260 | |
| gold-plated pins | World Precision Instruments, Inc. | 5482 | |
| RORc antibody | Perseus Proteomics | H3925 |
References
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