Summary
En gen överföringsmetod i utvecklingsländerna musen hjärnan beskrivs med hjälp av en unik kirurgisk metod och speciella form av elektroder. Denna unika teknik gör det möjligt transfektion av plasmid-DNA tidsmässigt och rumsligt, som kommer att hjälpa många neuroforskare för att studera hjärnans utveckling.
Abstract
För att förstå funktionen hos gener som uttrycks i viss region i den växande hjärnan, inklusive signalmolekyler och axonet molekyler vägledning, lokala genöverföring eller knock-out krävs. Riktad genmodifiering knock-in eller knock-out i lokala regioner är möjligt att utföra med kombination med en specifik CRE linje, vilket är mödosamt, kostsamt och tidskrävande. Därför kommer en enkel transfektion metod, en i livmodern elektroporering teknik, som kan utföras med kort tid, vara praktiskt att testa möjliga funktion av gener innan generationen av transgena djur 1,2. Utöver detta, i livmodern elektroporering mål områden i hjärnan där ingen specifik CRE linje existerar, och kommer att begränsa embryonal dödlighet 3,4. Här presenterar vi en metod att i livmodern elektroporering kombinera två olika typer av elektroder för enkel och bekväm genöverföring till målområden i den växande hjärnan. Först kommer en unik innehav metod av embryon med hjälp av en optisk fiber ljus kabel gör små embryon (från E9.5) synliga för riktad DNA-lösningen injektion i ventriklar och nål elektroder typ insättning till målet hjärnan området 5,6. Den mönstring av hjärnan som kortikala område förekomma i tidiga fosterstadiet, därför dessa tidiga elektroporation från E9.5 ge ett stort bidrag för att förstå hela evenemangsområdet mönstring. För det andra hindrar den exakta formen av en kapillär livmodern skador genom att göra hål genom tillägg av kapillär. Dessutom är den exakta formen på nålen elektroder skapas med volfram och platina tråd och slipas med sandpapper och isolerad med nagellack 7, en metod som beskrivs i detalj i detta protokoll. Denna unika teknik gör det möjligt transfektion av plasmid DNA i begränsade områden av hjärnan och gör det möjligt för små embryon electroporated. Detta kommer att hjälpa till, öppna ett nytt fönster för många forskare som arbetar på celldifferentiering, cell migration, axon vägledning i mycket tidiga fosterstadiet. Dessutom kommer denna teknik hjälper forskarna att transfektera plasmid-DNA i djupa delar av den växande hjärnan såsom thalamus och hypothalamus, där inte många region-specifika CRE linjer finns för få av funktion (GOF) eller förlust av funktion (LOF) analyser.
Protocol
1. Beredning av kapillär och DNA injektionsvätska, lösning
- Rena plasmid DNA med ett Maxi-prep eller motsvarande metod, och göra en slutlig koncentration på 2-3 mikrogram / l. Alikvotera 100 mikrogram av DNA, lägga 10μl av snabba gröna färgämne (1% aktier) och TE (10 mM Tris-Base, 1mm EDTA, pH 8,0) och justera en volym på 100 l så att den slutliga DNA-koncentrationen för injektion mix till 1μg / l. Koncentrationen av plasmid-DNA kan ändras beroende på storleken på plasmiden, och även dess transfektion effektivitet, som måste testas individuellt.
- Snurra DNA-lösningen i 5 minuter vid 14.000 rpm vid rumstemperatur och supernatanten för att avlägsna rester.
- Dra ett glas kapillär tubea glas kapillärrör med en mikropipett avdragare. Nyp bort toppen med en pincett för att göra spetsen har en 20-30 ìm diameter. Mät 800 ìm-1 mm från spets och kontrollera ytterdiameter är mindre än 60 ìm (Fig. 1A).
- Anslut kapillär till mikromanipulator, och fyll på med mineralolja. För att fylla kapillär med DNA lösningen, sänk spetsen i lösningen och suga upp DNA lösningen.
2. Stick platina elektroder
Här har vi använt elektroder sticka platina (Nepe gen, CUY611P2-1) till electroporate i ytliga delen av hjärnan, som cortex (bild 1F).
3. Beredning av mikro-elektroder
Använd mikro-elektroder till electroporated i djupa delar av hjärnan (dvs, thalamus och hypothalamus) (Fig. 2B-E).
- Ena änden av volfram (för negativa elektroder) och platina (för positiva elektroder) trådar är lindad på guldpläterade stift och fasta med parafilm. Sätt i kabeln till stammen av en bomullstuss och linda båda ändar med parafilm (Fig. 1B).
- Jämnt vässa spetsen på tråd med sandpapper tills den når 20-30 ìm yttre diameter och 60 ìm från 800 ìm-1 mm av spetsen (fig. 1C och D).
- Applicera ett tunt lager nagellack till tråd för isolering. Efter nagellack har torkat, använd en aceton-indränkt bomullstuss för att ta bort det från toppen (ca 200 ìm från spetsen). Viktigt: För att undvika skador på musen livmoder, bör den del inom 800 ìm-1 mm av spetsen inte vara mer än 70 mikrometer i diameter (Fig. 1E).
4. Beredning av kirurgi
- Bedöva en gravid mus (E9.5-E15.5). Vi visar anesthetization med farmaceutisk kvalitet natrium pentobarbital (Tabell II, 50 mikrogram per gram kroppsvikt, injicera intraperitonealt och vänta 5 min). Alternativ till natrium pentobarbital som bedövningsmedel inkluderar ketamin / Xylazine injektion eller bedövningsmedel gas (gas är att föredra för kortvarig förfaranden). Injektionen bör ske med uppmärksamhet för att undvika organ, annars kommer att orsaka skada i livmodern eller döda djur. När framgångsrika IP är gjort, är överlevnaden mer än 95%. Även kirurgi kan utföras på utomhusmarknader miljö. Innan startade verksamheten, test för en brist på svar från djuret att nypa sin tå för att bekräfta narkos.
- Raka håret från buken med ett rakblad och 50% EtOH. Förbered huden med omväxlande skurar av Betadine och alkohol (70%).
- Gör ett snitt i buken mittlinjen med fina sax och dra ut alla uterin horn försiktigt på en 37 ° C förvärms fosfatbuffrad saltlösning (PBS)-fuktad gasväv, som placeras runt såret. Håll livmodern fuktig med PBS hela tiden.
- Håll en flexibel fiberoptisk kabel mellan pek-och långfingret och placera den under livmoderns horn. Rengör kabeln med 70% EtOH före användning. Inga mikroskop eller lupp krävs för visualisering. Placera livmodern mellan optisk fiber ljus optisk kabel och tummen, och pressa försiktigt för att driva upp embryot närmare livmoderväggen.
5. Injektion av DNA och elektroporation
- När embryot är placerad, sätter glaset kapillär försiktigt i mål kammare och injicera ca 1 l av DNA-lösning (Fig. 2A).
- För elektroporering ytliga delen av brainIf hjälp med elektroder pinne platina för electoporation, placera elektroderna utanför livmodern och tillämpa föreslog fyrkantsvåg strömpulser enligt tillverkares anvisning (Tabell I). Om usingFor elektroporation till djupare delar av hjärnan,, nmicro elektroporation är eedle typ elektroder används. Iinsert en fin volfram negativa elektroden i DNA injiceras kammare och en platina elektrod in i livmodern och placera målregion mellan två elektroder, använd sedan föreslog fyrkantsvåg strömpulser (Tabell I) (Fig. 2B).
6. Inlägg elektroporation
- Placera livmodern hornet tillbaka på sin origVSLUTANDE plats med och lägga till 500 mikroliter av 37 ° C förvärms PBS.
- Sutur det inre lagret med kirurgiska suturer och nära yttre lagret med en 9 mm autoclipauto klipp.
- Placera djur på en värmedyna i 2 timmar för att tillåta återhämtning från narkosen. Analgetika såsom karprofen eller buprenorfin kan ges för postoperativ smärta.
7. Representativa resultat:
Några exempel på kortikal elektroporering av pCAG-EYFP konstruera med hjälp av elektroder fastnar platina vid olika tidpunkter visas i figur Figur 32. Hjärnor är electroporated vid E13.5, E14.5 och E15.5 och skördas vid födseln dag (P) 6. ADet ntibody färgning av RORc avslöjar ställning skikt 4 och ställning EYFP transfekterade celler avslöjades av GFP antikropp färgning, och båda bilderna är super infördes (Fig. 3A och B). Märkta kortikala celler är lagret av kortikala electroporated celler klart skiljer sig i varje försök (Fig. 32), vilket tyder på tidsberoende elektroporation gör kortikala lager-specifik GOF / LOF möjligt.
Lönsamheten för embryon och effektivitet cell transfektion varierar beroende på åldern på embryot och placeringen av elektroporation. Prover är noterad på tabell 1, dock bör villkor optimeras för varje elektroporation beroende på hur långt och en del av hjärnan.
Elektroporation i en djup vävnad såsom thalamus och hypothalamus med hjälp av elektroder pinne platina ger ofta låg verkningsgrad (tabell 1). Detta problem kan lösas med hjälp av mikro-elektroder whichelectrodes, som kommer att nå till djupa delar av hjärnan. Figur 3 4 visar exempel på pCAG-EYFP elektroporation i utvecklingsländerna diencephalon. Plasmid-DNA-lösning sprutas in i 3: e ventrikeln vid E11.5 följt av mikro elektroporation (bild 3C4C). Det electroporated området är begränsat i thalamus där de flesta av axoner projektet till cortex (bild 3B4B). Axon projektion till skikt 4 av hjärnbarken kan också visualiseras genom EYFP, som fillesfills upp hela neuron. (Bild 3A4A).
Figur 1. Cartoon schema som visar den korrekta formen på kapillär. (A) Ett glas kapillärrör dras med hjälp av en mikropipett avdragare att göra vissa form. Ett tips är kläms ut med pincett för att göra det 20-30 ìm. Mät 800 ìm-1 mm från spetsen (röda fästet) och se till att yttre diameter är mindre än 60 ìm (grön fäste). (B) Ena änden av volfram eller kablar platina är hoprullad på guldpläterade stift och fasta med parafilm. Använd sedan sandpapper för att göra sina tips för att bli 20-30 ìm yttre diameter och 60 ìm från 1 mm i spetsen. (C) Bilden av volfram tråd innan formning. (D) Bilden av volfram tråd efter formning. (E) Bilden av volfram tråd efter applicering tunt lager nagellack. Skala bar i E är 10 mikrometer (minsta skala) för CE. (F) Stick platina elektroder (Nepa genen. CUY611P2-1). Skala bar i F är 2 mm.
Figur 2. Cartoon schemat för kirurgiska ingrepp. (A) Diagram över injektion i laterala ventrikeln eller stora embryon (vänster) och i 3: e ventrikeln eller små embryon (höger sida). (B) Diagram över electrporation av platina elektrod (vänster sida) och nåltyp elektrod (höger sida).
Figur 3. Utveckla mus telencephalon var electroporated med pCAG-EYFP vid E13.5 (A), E14.5 (B) och E15.5 (C) och skördas vid P6. Hjärnor var sektioneras koronalt och färgas med GFP antikropp eller RORc antikropp separat och bilder är sammanslagna. (A) elektroporering av pCAG-EYFP plasmid vid E13.5 transfektera många lager 4 nervceller. som överlappar lager 4 markörer RORc. (B) elektroporering av pCAG-EYFP plasmid vid E14.5 transfektera celler, som är mer ytliga än lager 4 nervceller. (C) E15.5 elektroporation etiketten många ytliga nervceller som layer 2 / 3. Skala bar 200 ìm.
Figur 4. Transfektion av EYFP i thalamo-kortikal axoner (TSA). (A) TCA ändstationen i kortikala skikt 4 avslöjas av GFP antikropp färgning. RORc antikropp färgning används för att avslöja en position av lager 4. Båda bilderna är tagna från samma avsnitt och samman. (B) Placering av elektroporation i thalamus visas också av GFP antikropp färgning och RORc färgning, som uttryck är begränsad i thalamus 11. (C) Cartoon schema för thalamic elektroporation och TCA projektion visas. Skala bar 200 ìm.
Discussion
I detta protokoll beskrivs vi bara fördelar med tekniken i pCAG-EYFP transfektion till begränsat område av en liten embryonal hjärna med hjälp av olika formade elektroder. För jämförelse av transfektion effektivitet genom olika promotor beskrivs tidigare, som visar specificiteten celltyp 1. Det finns dock begränsningar för tekniken, exempelvis transfektion bara är övergående och varierar beroende på plasmiden, har den inte någon cell specificitet och det är svårt att kontrollera antalet transfekterade cellerna. ThereforeHowever kommer att kombinera detta protokoll med andra tekniker ytterligare ge möjligheter för olika manipulation metoder. Först kommer integrera cellens specifika promotorn i plasmid-DNA kan celltyp specifika transfektion, som nervceller, gliaceller och astrocyter. För det andra, eftersom transfektion är övergående, är det inte lämpligt för forskare som vill analysera funktionen av genen senare i livet. Därför kommer tillsammans med en transposase att göra plasmid-DNA integreras i genomet omvandla den till en stabil transfektion 8. Sedan antagandet av Tet-på eller Tet-off-systemet gör det möjligt att manipulera tidpunkten eller cellen typspecifika genuttryck i neurala celler 8. Alternativt kan man kombinera detta protokoll med tamoxifen-inducerbara Cre-ER (T) recombinases 9 och möss reporter 10.
Denna breda tillgängligheten av vävnader kommer att drastiskt förändra experimentell design används i neurovetenskap.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av RIKEN Brain Science Institute (BSI), Human Frontier Science Program (HFSP) (tilldelas TS) och RIKEN Junior Research Associate Program (JRA, tilldelas MK) RIKEN Brain Science Institute (BSI), Human Frontier Science Program (HFSP) (tilldelas TS) och RIKEN Junior Research Associate Program (JRA, tilldelas MK) finansierat detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bare tungsten wire diameter 125 μm | A-M Systems | 797600 | |
| bare platinum wire diameter 125 μm | A-M Systems | 767000 | |
| Stick electrodes | Nepa gene | CUY610P4-1 | |
| glass capillary tube | Stoelting Co. | 50611 | |
| micromanipulator | KD Scientific | KDS310 | |
| scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5865 | |
| pulse generator | A-M Systems | Model 2100 | |
| 9 mm autoclip | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9260 | |
| gold-plated pins | World Precision Instruments, Inc. | 5482 | |
| RORc antibody | Perseus Proteomics | H3925 |
References
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
- Imayoshi, I., Shimogori, T., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Hes genes and neurogenin regulate non-neural versus neural fate specification in the dorsal telencephalic midline. Development. 135, 2531-2541 (2008).
- Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex. Development. 131, 5639-5647 (2004).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
- Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Avian Embryology. Methods in Cell Biology. Vol 87, 2nd Edition, Elsevier Academic Press Inc. 271-271 (2008).
- Feil, R. Ligand-activated site-specific recombination in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 10887-10890 (1996).
- Indra, A. K. Temporally-controlled site-specific mutagenesis in the basal layer of the epidermis: comparison of the recombinase activity of the tamoxifen-inducible Cre-ERT and Cre-ERT2 recombinases. Nucleic Acids Research. 27, 4324-4327 (1999).
- Nakagawa, Y., O'Leary, D. D. M. Dynamic patterned expression of orphan nuclear receptor genes ROR alpha and ROR beta in developing mouse forebrain. Developmental Neuroscience. 25, 234-244 (2003).
