إعادة إعماره البيوكيميائية من مستقبلات البروتين الستيرويد • المجمعات Hsp90 وإعادة تنشيط يجند تجليد
Summary
و<em> في المختبر</emيوصف> طريقة لإعداد مستقبلات جلايكورتيكود الوظيفية (GR) • مجمعات البروتين hsp90 المنقى من البروتينات وlysates الخلوية. أسلوب يستخدم للامتزاز مناعي المؤتلف GR تليها تجريد الملح وإعادة تشكيل البروتين المعقدة. وتناقش أهمية العوامل المساعدة والشروط العازلة ، كما هي تطبيقات أسلوب المحتملة.
Abstract
Hsp90 هو ضروري للغاية وفيرة من البروتين كوصي الجزيئية التي تم العثور على تنظيم أكثر من 150 إشارة حقيقية النواة البروتينات ، بما في ذلك عوامل النسخ (المستقبلات النووية على سبيل المثال ، البروتين p53) وتحركات البروتينات (مثل SRC ، راف ، AKT كيناز) المشاركة في دورة الخلية ، تكون الأورام ، موت الخلايا المبرمج ، وعدة مسارات إشارات حقيقية النواة 1،2. كثير من هذه البروتينات "عميل" لhsp90 ، والتجمع من مستقبلات الستيرويد • hsp90 المجمعات هو أفضل تعريف (الشكل 1). نقدم هنا لتلقي تكيف جلايكورتيكود (اليونان) وفحص مناعي في المختبر GR • أسلوب إعادة hsp90 التي يمكن استخدامها بسهولة لتحقيق حقيقية النواة hsp90 النشاط الوظيفي ، hsp90 بوساطة مستقبلات الستيرويد يجند ملزمة ، ومتطلبات العامل المساعد كوصي الجزيئية. على سبيل المثال ، يمكن استخدام هذا الاختبار لاختبار متطلبات العامل المساعد hsp90 وتأثيرات خارجية مضيفا المركبات لعملية إعادة.
كان نظام GR مفيدة بشكل خاص لدراسة hsp90 لأنه يجب أن تكون ملزمة لمستقبلات hsp90 أن يكون لها ملزم يجند فتح المشقوق يمكن الوصول إلى 3 الستيرويد. الذاتية ، GR unliganded موجودة في السيتوبلازم من خلايا الثدييات ملزمة لnoncovalently hsp90. كما وجدت في الموارد الوراثية المحلية • hsp90 heterocomplex ، وملزم يجند GR المشقوق مفتوحة وقادرة على الستيرويد ملزمة. إذا تم استعادة hsp90 تنأى عن GR أو إذا تحول دون وظيفتها ، ومستقبلات غير قادر على ربط الستيرويد ويتطلب إعادة تشكيل لGR • hsp90 heterocomplex قبل النشاط ملزمة الستيرويد 4. يمكن immunoprecipitated GR العصارة الخلوية من خلية باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ، والبروتينات مثل hsp90 المعقد للGR يمكن يعاير بواسطة لطخة غربية. يمكن تحديد النشاط ملزمة الستيرويد لGR immunoprecipitated التي تفرخ في immunopellet مع [3 H] الستيرويد.
وقد أظهرت التجارب السابقة hsp90 بوساطة افتتاح GR ملزم يجند المشقوق يتطلب hsp70 ، وهو second كوصي الجزيئية الأساسية أيضا لبقاء الخلية حقيقية النواة. وحفز النشاط الكيميائي الحيوي لhsp90 hsp70 والبروتينات التي هوب المشترك كوصي ، hsp40 ، و 5 P23. وتعتبر الأجهزة التي تحتوي على كوصي multiprotein hsp90 ، hsp70 ، هوب ، والتطور الطبيعي hsp40 هي موجودة في السيتوبلازم الخلية حقيقية النواة ، وlysate بالشبكيات يوفر كوصي الغنية مصدر بروتين 6.
في أسلوب عرضه ، هو immunoadsorbed GR من العصارة الخلوية المحمولة وتجريده من آلات كوصي hsp90/hsp70 الظروف الذاتية باستخدام ملح خفيف. ومن ثم حضنت GR الملح مع تجريده lysate بالشبكيات ، ATP ، و+ K ، والذي ينتج إعادة تشكيل GR • hsp90 heterocomplex وتفعيل النشاط ملزمة الستيرويد 7. ويمكن استخدام هذا الأسلوب لاختبار تأثير العوامل المساعدة كوصي مختلف البروتينات الرواية ، والتجريبية ، أو مثبطات hsp90 GR من أجل تحديد أهميتها الفنية بشأن 8-11 hsp90 بوساطة ملزمة الستيرويد.
Protocol
Discussion
ويمكن تكييف مقايسة المذكورة أعلاه لاختبار عدد لا يحصى من الظروف التي تؤثر على الإجراءات كوصي الآلية كوصي hsp90/hsp70-based فضلا GR ملزمة الستيرويد. بل هو تعديل أساليب ذكرت سابقا 4،8،9،17 ويهدف إلى الاستفادة من التطورات الحديثة في مجال التكنولوجيا الكهربائي ويمكن الوصول ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح GM086822 ، الأمل معهد القلب جائزة العلوم الأساسية ، وموردوك MJ الخيرية كلية العلوم الاستئماني برنامج البحوث. حدد الكواشف الكهربي وقدمت بسخاء صورة برامج التحليل بواسطة بيو راد.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Sf9 insect cells | Invitrogen | for baculovirus expression of recombinant mouse GR | |
| L929 cells | ATCC | CRL-2173 | for endogenous mouse GR cytosol preparation (alternative to baculovirus expression) |
| FiGR hybridoma cells | ATCC | CRL-2173 | for preparing ascites containing anti-GR monoclonal antibody (alternative to purified BuGR2 antibody) |
| Complete-Mini protease inhibitor, EDTA-free | Roche Applied Science | 11836170001 | |
| protein A-Sepharose | Sigma-Aldrich | P3391 | |
| rabbit reticulocyte lysate | Green Hectares (Oregon, WI) | rich source of endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery | |
| creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | for ATP-regenerating system |
| phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | for ATP-regenerating system |
| anti-GR mouse monoclonal antibody (BuGR2) | Pierce/Thermo Scientific | MA1-510 | used for GR immunoadsorption and as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp90 mouse monoclonal antibody (AC88) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-830 | used as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp70 mouse monoclonal antibody (N27F3-4) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-820 | used as primary antibody in western blotting |
| IgG from mouse serum | Sigma-Aldrich | 038K7690 | used as nonimmune antibody for negative control of immunoadsorption |
| anti-mouse IgG-peroxidase conjugate | Sigma-Aldrich | A4416 | used as secondary antibody in western blotting |
| Experion microfluidic electrophoresis system | Bio-Rad | 7007001 | alternative to conventional SDS-PAGE |
| [1,2,4,6,7-3H] dexamethasone | PerkinElmer | NET1192001MC | follow safety precautions |
References
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery. Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).
- Murphy, P. J. M. Regulation of glucocorticoid receptor steroid binding and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery: implications for clinical intervention. Leukemia. 19, 710-712 (2005).
- Pratt, W. B., Morishima, Y., Osawa, Y. The Hsp90 chaperone machinery regulates signaling by modulating ligand binding clefts. J. Biol. Chem. 283, 22885-22889 (2008).
- Dittmar, K. D., Hutchison, K. A., Owens-Grillo, J. K., Pratt, W. B. Reconstitution of the steroid receptor•hsp90 heterocomplex assembly system of rabbit reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 271, 12833-12839 (1996).
- Morishima, Y. The Hsp organizer protein hop enhances the rate of but is not essential for glucocorticoid receptor folding by the multiprotein Hsp90-based chaperone system. J. Biol. Chem. 275, 6894-6900 (2000).
- Murphy, P. J. M., Kanelakis, K. C., Galigniana, M. D., Morishima, Y., Pratt, W. B. Stoichiometry, abundance, and functional significance of the hsp90/hsp70-based multiprotein chaperone machinery in reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 276, 30092-30098 (2001).
- Dittmar, K. D., Pratt, W. B. Folding of the glucocorticoid receptor by the reconstituted Hsp90-based chaperone machinery. The initial hsp90.p60.hsp70-dependent step is sufficient for creating the steroid binding conformation. J. Biol. Chem. 272, 13047-13054 (1997).
- Kanelakis, K. C. Differential effects of the hsp70-binding protein BAG-1 on glucocorticoid receptor folding by the hsp90-based chaperone machinery. J. Biol. Chem. 274, 34134-34140 (1999).
- Morishima, Y., Kanelakis, K. C., Murphy, P. J. M., Shewach, D. S., Pratt, W. B. Evidence for iterative ratcheting of receptor-bound hsp70 between its ATP and ADP conformations during assembly of glucocorticoid receptor.hsp90 heterocomplexes. Biochemistry. 40, 1109-1116 (2001).
- Murphy, P. J. M. Pifithrin-alpha inhibits p53 signaling after interaction of the tumor suppressor protein with hsp90 and its nuclear translocation. J. Biol. Chem. 279, 30195-30201 (2004).
- Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone. J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).
- Morishima, Y., Murphy, P. J. M., Li, D. P., Sanchez, E. R., Pratt, W. B. Stepwise assembly of a glucocorticoid receptor•hsp90 heterocomplex resolves two sequential ATP-dependent events involving first hsp70 and then hsp90 in opening of the steroid binding pocket. J. Biol. Chem. 275, 18054-18060 (2000).
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones. Endocr. Rev. 18, 306-360 (1997).
- Bodwell, J. E. Identification of phosphorylated sites in the mouse glucocorticoid receptor. J. Biol. Chem. 266, 7549-7555 (1991).
- Penna, A., Cahalan, M. W. e. s. t. e. r. n. Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J. Vis. Exp. (7), e264-e264 (2007).
- Choo, Y. S., Zhang, Z. Detection of Protein Ubiquitination. J. Vis. Exp. (30), e1293-e1293 (2009).
- Murphy, P. J. M. Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor•Hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft. J. Biol. Chem. 278, 34764-34773 (2003).
- Schrum, A. G. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Sci STKE. 389, pl2-pl2 (2007).
- Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (46), e2066-e2066 (2010).
- Felts, S. J., Karnitz, L. M., Toft, D. O. Functioning of the Hsp90 machine in chaperoning checkpoint kinase I (Chk1) and the progesterone receptor (PR). Cell Stress Chaperones. 12, 353-363 (2007).
- Cintron, N. S., Toft, D. Defining the requirements for Hsp40 and Hsp70 in the Hsp90 chaperone pathway. J. Biol. Chem. 281, 26235-26244 (2006).
