Summary
Bir
Abstract
Hsp90 önemli ve son derece bol moleküler şaperon protein, hücre bisiklet alan transkripsiyon faktörleri (örneğin nükleer reseptörleri, p53) ve protein kinazlar (örneğin, Src, Raf, Akt kinaz) dahil olmak üzere 150'den fazla ökaryotik sinyalizasyon proteinler, düzenleyen tespit edilmiştir. tümörogenez, apoptozis ve birden fazla ökaryotik sinyalizasyon yolları 1,2 . Hsp 90 için bu çok 'yandaş' proteinler ki, steroid reseptör montaj • hsp 90 kompleksleri (Şekil 1) en iyi tanımlanmış . Biz burada bir uyarlanabilir glukokortikoid reseptör (GR) immunoprecipitation tahlil ve ökaryotik hsp 90 fonksiyonel aktivite, bağlayıcı hsp 90-aracılı steroid reseptör ligand ve moleküler şaperon kofaktör gereksinimleri kolayca prob kullanılıyor olabilir • in vitro GR hsp 90 sulandırıldıktan yöntemi mevcut. Örneğin, bu testte hsp 90 kofaktör gereksinimleri ve eksojen bileşiklerin sulandırıldıktan süreci ekleyerek etkilerini test etmek için kullanılır.
Reseptör steroid 3 erişilebilir yarık açık bir ligand bağlanması için hsp 90 bağlı olması gerekir, çünkü GR hsp 90 eğitim için özellikle yararlı bir sistem olmuştur . Endojen, unliganded GR noncovalently hsp 90 bağlı memeli hücrelerinin sitoplazmasında bulunur. Endojen GR • hsp 90 heterocomplex bulunan yarık GR ligand bağlanması, açık ve bağlayıcı steroid yeteneğine sahip. Hsp 90 GR ayrıdır veya onun işlevini inhibe ise, alıcı, steroid bağlamak mümkün ve steroid bağlanma aktivitesi önce GR • hsp 90 heterocomplex sulandırılması gereklidir 4 geri . GR bir monoklonal antikor kullanılarak hücre sitoplazmada immunoprecipitated ve western blot ile test edilebilir gibi hsp 90 proteinler GR için complexed olabilir. [3 H] steroid immunopellet kuluçka immunoprecipitated GR Steroid bağlayıcı aktivite tespit edilebilir.
Önceki deneyler, yarık GR ligand bağlama hsp 90 aracılı açılış göstermiştir hsp70, ikinci bir moleküler şaperon ökaryotik hücre canlılığı için de gereklidir gerektirir. Hsp 90 ve hsp70 biyokimyasal faaliyet proteinler co-hastabakıcı Hop hsp40 ve P23 5 tarafından katalize. Multiprotein hastabakıcı makineleri hsp 90, hsp70, Hop, ve hsp40 içeren bir ökaryotik hücre sitoplazmasında endojen ve retikülosit lizat bir hastabakıcı zengin protein kaynağı 6 sağlar.
Sunulan yöntem, GR hücre sitoplazmada immunoadsorbed ve hafif tuzlu koşulları kullanarak endojen hsp90/hsp70 şaperon makine elimden. Tuz elimden GR GR sulandırıldıktan sonuçları retikülosit lizat, ATP ve K + ile inkübe steroid bağlanma aktivitesi 7 • hsp 90 heterocomplex ve yeniden. Bu yöntem, hsp 90-aracılı steroid bağlayıcı 8-11 fonksiyonel önemi belirlemek amacıyla çeşitli şaperon kofaktör, roman proteinleri, ve deneysel hsp 90 GR inhibitörlerinin etkilerini test etmek için kullanılabilir .
Protocol
1. Fonksiyonel GR bulunduğu hücrenin sitoplazmada hazırlanması
- Teknik not: Tüm tamponlar soğutmalı olmalı ve santrüfüj ve inkübasyon dahil olmak üzere bu protokolü, her adımında, buz üzerinde veya 4 yapılmalıdır ° C, aksi belirtilmedikçe. Düşük sıcaklık, GR ve protein kompleksleri bozulmasını önlemek için çok önemlidir.
- Soğutmalı santrifüj kullanarak hücrelerin fonksiyonel GR yüksek bir konsantrasyon ifade ~ 1-5 ml pelet edinin. GR zengin hücre kaynakları örnekleri fare fibroblast endojen GR yüksek bir konsantrasyon ifade L929 hücreleri, ve Sf9 rekombinant GR bakülovirüs (örneğin p2Bac-mgr bakülovirüs 12) ile enfekte olmuş hücreleri içerir. Paketlenmiş hücreleri yaklaşık 15-20 ml Sf9 bakülovirüs hücre kültürü litre başına elde edilir. Hücreler önce hasat katlanarak büyüyor olmalıdır. 5 dakika boyunca 5.000 × g hücre süspansiyonu santrifüjleyin.
- Hanks 'tamponlu salin solüsyonu 15 ml hücre pelletini üç kez yıkayın. Yıkar arasında, 5 dakika hafifçe için 5.000 santrifüj takip pelet, × g tekrar süspansiyon haline getirin. Son yıkama sonrasında, süpernatantı tamamen kaldırmak.
- HEM tamponu (10 mM HEPES, 1 mM EDTA, 20 mM sodyum molibdat, pH 7.4), 1 mM phenylmethylsulfonyl florür (PMSF) ve 3 yer tablet Komple Mini proteaz inhibitörü içeren bir homojenizasyon tamponu 7.5 ml hazırlayın. PMSF ve Komple-Mini tablet sonraki adımları sırasında meydana gelen proteoliz önler. Komple Mini tablet kolay bir havanda ince bir toz için zemin olabilir. Homojenizasyon tampon 1,5 cilt hücre pelet ekleyin.
- Rüptürü Dounce homojenizasyon (50 vuruş) veya donma / çözülme (3 siklus) tekniği ile hücreleri. Dounce homojenizasyon gelişmiş endojen GR • hsp 90 protein kompleksleri sürdürmek ve tamamlamak için daha hızlı olabilir. Donma / çözülme araştırmacı bu aşamada protokolü askıya alma ve daha sonraki bir zamanda devam etmek için bir fırsat sağlar. Dounce homojenizasyon protein parçalanmasını önlemek için bir buz kovası homojenizatör ile yapılmalıdır. Donma / çözülme pelet homojenizasyon tampon karışımı hücre içeren sıvı azot, kuru buz veya -20 ile santrifüj tüpüne dondurma yapılabilir ° C inkübasyon, 30 ° C su banyosunda çözülme.
- Ultrasantrifügasyon rüptüre hücre partikül madde GR içeren sitoplazmada ayırın. 30 dakika boyunca 100.000 × g dayanıklı ultrasantrifüjdeki tüpleri, çift kütle denge tüpler ve santrifüj Homojenat aktarın.
- -20 Sitoplazmada (süpernatant) ve mağaza ° C, uzun süreli depolama için 1.5 ml mikrosantrifüj tüpler 500 ul alikotları çıkarın. Maksimum fonksiyonel GR aktivitesi korumak için, depolama önce metanol-kuru buz banyosu 30 saniye boyunca sıvı nitrojen ya da inkübe alikotları flaş dondurma. Soğutma reaktifi ile doğrudan temas önlemek için dikkatli olunuz.
2. Hücre sitoplazmasında GR Immunoadsorption
- Teknik not: Şekil 2 Bu protokol Adımlar 2-5 şematik bir bakış sağlar.
- Adım 1 hazırlanan reseptör immunoadsorb GR karşı yükseltilmiş bir monoklonal immünglobulin G (IgG) antikor içeren bir immunoadsorption karışım hazırlayın. 1,5 ml mikrosantrifüj tüp, çözülmüş, 100 ul GR içeren sitozolde 200 ul TEGM tampon (8 mM TES, 4 mM EDTA, 50 mM NaCl, 20 mM molibdat,% 10 (v / v) gliserol, pH 7.6) birleştirmek 100,% 20 protein ul-sepharose (PAS), anti-GR monoklonal IgG bulamaç (v / v, TEGM tamponunda hazırlanmış) ve 5 mg (örneğin BuGR2). Molibdat, tahlil endojen heterocomplex steroid bağlanma aktivitesi 13 için yararlı olabilir GR-hsp 90 heterocomplex, istikrara kavuşturmak amacıyla TEGM tampon dahildir .
- Anti-GR antikor saflaştırılmış protein ticari olarak kullanılabilir. Alternatif olarak, 10 anti-GR immunoadsorption karışımı IgG içeren asit ul ekleyerek elde edilebilir. Asit, anti-GR hibridoma hücreleri (örneğin FiGR hibridoma hücreleri 14) ile enjekte edilen farelerin tarafından üretilen ve asit elde edilmiş ve bu deneylerde kullanılan antikor konsantrasyonunu yaklaşık Bradford yöntemi ile ölçülen, 0.5 mikrogram / ml idi .
- GR-içeren sitozolde TEGM tampon ve PAS (yukarıda açıklandığı gibi) ve GR tanımaz bir IgG 5 mikrogram, hsp 90 ya da diğer moleküler şaperon proteinleri ("immün olmayan" olarak anılacaktır kullanarak bir negatif kontrol örneği hazırlayın antikor).
- Numune tüpleri% 20 bulamaç PAS aktarırken, bir kesim nispeten büyük PAS boncuk büyüklüğü nedeniyle P-200 pipetlemeyin ucunu kullanabilirsiniz. Kes pipetlemeyin ipuçları, böylece pipetlemeyin ucu diyafram artırılması, piyasada bulunan P-200 ipuçları sonunda 2-3 mm dilimleme tarafından hazırlanmıştır.
- 2 saat sürekli rotasyon ile en az bir dikey dönen tekerlek ve inkübe yerleştirin örnekleri. Örnekler olabiliraktivitesini kaybetmeden 8 saate kadar inkübe edilmelidir.
- Immunoadsorption inkübasyon bitiminde, santrifüj bağlanmamış proteinler antikor-PAS pelet ("immunopellet") çıkarın. 10.000 az 1 dakika için programlanmış bir soğutmalı santrifüj × g kullanarak santrifüj immunopellets süpernatantlar ayırın ve sonra 1 ml TEGM tampon ve vorteks ile iki kez yıkayın. Santrifüj ve yıkar arasında pelet rahatsız ihtiyatlı olmak süpernatant atın.
- Ikinci yıkama bitiminde tüm süpernatantı. Pelet hiçbiri yanlışlıkla aspire edilir sağlamak amacıyla, son supernatant aspirasyon crimped P-200 pipetlemeyin ucu kullanın. Kıvrımlı pipetlemeyin ipuçları forseps kullanarak piyasada bulunan P-200 ipuçları düzleştirme tarafından hazırlanır.
3. Endojen hsp 90 GR immunopellet Çözülme ("Tuz sıyırma")
- Adım 2 hazırlanan yıkanmış immunopellet, 355 ul TEG tampon (sodyum molibdat olmadan TEGM tampon) ve 5 M NaCl (son NaCl konsantrasyonu = 0,5 M) 45 ul ekleyin.
- 1.5 saat sürekli rotasyon için dikey dönen tekerlek ve inkübe yerleştirin örnekleri. Örnekler 2 saat inkübe edilebilir, ancak, uzun inkubasyon azalmış protein kurtarma ve alt fonksiyonel aktivite yol açabilir.
- Santrifüj yoluyla immunopellet bağlanmamış proteinler çıkarın. 10.000 x g. az 1 dakika süreyle örnekleri Spin 1 ml TEG tampon ve bir kez 1 ml 10 mM HEPES tamponu, pH 7.4 ile bir kez yıkayın.
- Ikinci yıkama sonuca tüm süpernatantı immunopellet rahatsız etmemek için dikkatli olmak, bir crimped P-200 pipetlemeyin ucu kullanarak.
4. Sulandırma GR • hsp 90 heterocomplex moleküler şaperonlar, kofaktör ve ATP
- Teknik not: aşağıda hazırlanan sulandırıldıktan karışımı ek proteinler, kofaktör, harekete geçirmek, ya da ilgi inhibitörleri de dahil olmak üzere sayısız deneysel koşullar test edilebilir. Sulandırıldıktan karışımlarının toplam hacmi <120 ul olmalıdır.
- Her tuz elimden immunopellet 50 moleküler bir hastabakıcı kaynak ve ATP üreten bir sistem (10 mM Hepes, 50 mM ATP, 250 mM kreatin fosfat, 20 mM magnezyum asetat 5 ul ul içeren bir sulandırıldıktan karışımı ekleyin, Adım 3 hazırlanan 100 U / ml kreatin fosfokinaz, pH 7.4).
- 50 ul HKD tamponu (10 mM Hepes, 100 mM KCl, 5 mM dithiothreitol (DTT), pH 7.4) ve ATP üreten sistemin ek bir 5 ul sulandırıldıktan karışımı tamamlayan Sulandırma reaksiyonlar artabilir. Bu adım, bol sulandırıldıktan ve steroid bağlayıcı gözlenmektedir atlanabilir. KCl hsp70 ATPaz aktivitesini artırır ve DTT oksidasyon 9 sistein içeren proteinler korur.
- Önerilen moleküler şaperon kaynağı piyasada bulunan tavşan retikülosit lizat. Bireysel moleküler şaperonlar retikülosit lizat arınmış veya recombinantly ifade (örneğin 15 hsp 90 mg, 15 mg hsp70, 0.6 mg Hop, 6 mg P23 ve 0.125 HKD tampon mikrogram hsp40) de kullanılıyor olabilir.
- Numune tam 20 dakika boyunca 30 ° C su banyosunda inkübe edin. Flick tüpler için her 1-2 dakika hafifçe pelet rahatsız ve sulandırıldıktan çözüm karıştırın.
- 1 dakika için 1 ml. TEGM 10.000 tampon, vorteks, santrifüj × g. Süpernatantı ve pelet rahatsız etmemek için dikkatli atın. Toplam üç yıkar için tekrarlayın. Tamamen bir crimped P-200 pipetlemeyin ucu kullanarak nihai yıkama sonuca tüm süpernatant kaldırmak.
5. Sulandırılmış protein kompleksleri ve ligand bağlayıcı aktivite analizi
- Sulandırılmış immunopellet Proteinler geleneksel denatüre poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE), mikroakışkan elektroforez (örneğin, Bio-Rad Experion) ve batı blot (Şekil 3) ile tespit edilebilir. Teknik not: SDS-PAGE 15 ve 16 blot batı açıklayan Mükemmel protokolleri diğer araştırmacılar sayesinde, şu anda kullanılabilir.
- SDS-PAGE β-mercaptoethanol ve vorteks içeren numune tamponu 50 ul ekleyin. Özel numune tamponu tarifleri değişir. Elektroforez sistemi istihdam edilmek üzere üretici tavsiyesine göre birini seçin.
- Kaynar su banyosu ya da 100 ° C, elektronik ısı blok 5 dakika inkübe edin.
- 1 dakika 10.000 x g'de santrifüjleyin. GR için complexed immunoadsorbing antikor, GR ve proteinleri birbirinden ayrı düşünülemez ve örnek tampon süpernatant salınır.
- Süpernatantı crimped ucu P-200 pipetlemeyin ucu kullanarak taze mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Pelet atın. Örnek şu anda piyasada bulunan SDS-PAGE veya mikroakışkan elektroforez sistemleri kullanılarak analiz için hazırlanır. Tekniği f ya tamamlayınüreticinin talimatlarına ollowing.
- Western blot analizi aşağıdaki SDS-PAGE immunoadsorbed GR ve sulandırıldıktan inkübasyon aşağıdaki GR complexed moleküler şaperonlar kesin tanımlama için olanak sağlar. GR (BuGR2), hsp 90 (AC88) karşı gündeme monoklonal primer antikorlar, hsp70 (N27F3 4) ve co-hastabakıcı proteinler GR • hsp 90 protein kompleksi ana bileşenleri tespit etmek için kullanın.
- [3 H] steroid (Şekil 4) kullanarak steroid bağlanma aktivitesi assaying • hsp 90 protein kompleksi tarafından tespit edilebilir GR sulandırıldıktan sonra tuz elimden GR Fonksiyonel aktivasyonu. Protokolün geri kalanı için, güvenli tritiated örnekleri ve atık kullanım için gerekli önlemleri uygulayın.
- Sulandırılmış immunopellet için, 47.5 ul HEM tampon ve 2 mcM 2.5 ul [3 H] deksametazon (son steroid konsantrasyonu = 100 nM) ekleyebilirsiniz.
- Yavaşça mikrosantrifüj tüp duvar yerinden numune miktarı en aza indirmek için dikkatli olmak pelet karıştırın.
- Buz üzerinde bir gece inkübe edin. Bu inkübasyon sırasında numune tüpleri döndürmek veya karıştırmak için gerekli değildir.
- 1 ml 10.000 TEGM tampon, hafifçe karıştırın ve santrifüj × g 1 dakika boyunca ekleyin. Dikkatli olmak, süpernatantı atın bağlanmamış [3 H] steroid içerir. TEGM tamponu ile 3 yıkar toplam tekrarlayın.
- Tamamen bir crimped P-200 pipetlemeyin ucu kullanarak nihai yıkama sonuca tüm süpernatant kaldırmak. Pelet GR, GR complexed hsp 90 ve diğer moleküler şaperonlar ve [3 H] özellikle steroid reseptör bağlı içerir. Nonspesifik bağlayıcı bir gecelik inkübasyon karışımı 1000 kat daha fazla olmayan tritiated deksametazon gibi hesaplanabilir. Alternatif bir negatif kontrol olarak, anti-GR immunoadsorbing antikor ile değiştirilebilir Adım 2.2 'de eklendi olmayan bir-GR-immunoadsorbing antikor (NI).
- Yıkanmış immunopellets 200 ul TEGM tampon ve bir kesim P-200 pipetlemeyin ucu kullanarak 10 ml sintilasyon şişeleri transfer askıya alındı.
- Şişeleri ve vorteks 4.8 ml sintilasyon kokteyl ekleyin.
- [3 H] sulandırılmış GR steroid bağlama miktarı • hsp 90 protein kompleksi sıvı sintilasyon spektrometresi kullanılarak test edilebilir.
6. Temsilcisi Sonuçlar:
Temsilcisi SDS-PAGE ve western blot verileri Şekil 3'te sunulmaktadır. Endojen GR • hsp 90 heterocomplex anti-GR antikor ve GR ile birlikte immunoadsorb Coomassie boyama (Şekil 3A) tarafından görüntülenmiştir olduğunu bireysel proteinleri kullanarak hücre sitoplazmada immunoadsorbed. Immunopellet sulandırıldıktan tayininde herhangi bir aşamada herhangi bir bileşeninin protein kimlik teyidi ilgi protein karşı gündeme monoklonal antikorlar kullanarak molekül ağırlığı ve batı blot SDS-PAGE hesaplama yapılabilir.
Sulandırılmış GR • hsp 90 heterocomplexes Experion mikroakışkan elektroforez verileri (Şekil 3C ve 3D) ve western blot analizi (Şekil 3B) kullanılarak sunulmaktadır. GR immunoadsorption özgüllüğü immunoadsorbing anti-GR antikor immün olmayan bir antikor (Şekil 3C, NI IgG kulvar) ile değiştirerek teyit edilir. Immün olmayan antikor aşırı miktarda kullanıldığında bile, hiçbir GR veya moleküler şaperonlar (bkz. Şekil 3C, GR, hsp 90 ve gözlenen grubun eksikliği ile anti-GR immunoadsorption şerit bulunan hsp70 protein bantları immunoprecipitated NI IgG şerit). Aynı şekilde, soyulmuş ve suni immunopellets western blot analizi ile tuz elimden GR (Şekil 3B) hsp 90 bölünmeler ve diğer şaperon proteinler onaylamak mümkün. Immunoadsorbing antikor ağır zincir (HC) Coomassie leke ve batı blot tarafından saptanabilir ve her kulvarın görüntülenir eşit büyüklükte immunopellets onaylamak için hizmet vermektedir.
Steroid bağlayıcı immunoadsorbed GR aktivitesi test edilen tüm koşulları için test edilmelidir, ve temsili steroid veri bağlama Şekil 4'te sunulmaktadır. Endojen GR • hsp 90 heterocomplexes immunoadsorbed, tuz elimden, ve yeniden. Ya retikülosit lizat kullanılması veya saflaştırılmış proteinler, sulandırılmış GR steroid bağlanma aktivitesi • hsp 90 heterocomplex genellikle endojen GR • hsp 90 bağlayıcı aktivite düzeyi% 75-100 döner. Elektroforez verilere benzer şekilde, immün olmayan bir antikor (NI), negatif kontrol olarak hizmet vermek üzere ve nonspesifik [3 H] steroid bağlanma bir önlem olarak anti-GR antikor (I) yerine kullanılır .
Şekil 1. GR • hsp 90 heterocomplex montaj ve GR steroid bağlayıcı yarık açma Model. Hsp90/hsp70-based şaperon makine bir fol GR ligand bağlayıcı etki alanı dönüştürüryarık steroid bağlanma kapalı ve açık bir yarık konformasyon (heterosiklik steroid simgesi ile gösterilen) erişilebilir hormon erişilebilir olduğu ded konformasyon. Hastabakıcı makineleri hücre önceden monte edilmiş ve hsp70 hsp 90, saflaştırılmış kendiliğinden oluşturacak ve Hop (Reaksiyon 1) çözümü karıştırılır. Hop, 34 amino asit tetratricopeptide tekrar (TPR) etki alanı (karanlık hilal olarak gösterilen) içerir ve daha sonra bir TPR etki immünosüpresanlarla protein içeren heterocomplex olgunlaşma işlemi sırasında değiştirilir. Makine Hop ve hsp40 hsp70 ve sonuçta çoğu bırakın sonra, bir ATP-K +-bağımlı bir şekilde yarık steroid bağlanma açılır kompleksi (kesik bir simge olarak gösterilmiştir). Mekanistik, hsp70 hsp 90 reseptör ve sonraki yarık açma hsp 90 GR önce etkileşim ve asal. Hsp 90 ve hsp70 aynı anda mevcut Deneysel olarak, steroid bağlayıcı ve GR yarık açma artar. Heterocomplex bağlı bir ATP yapısındaki hsp 90 korur hsp 90 co-hastabakıcı P23, giriş tarafından stabilize edilir. Hop çıktıktan sonra, yüksek molekül ağırlıklı bir immünosüpresanlarla (İBB), son heterocomplex oluşturan hücrelerden kurtarılır, hsp 90 bağlayabilirsiniz. Pratt ve Toft 1 uyarlanmıştır.
Şekil 2 bu protokol Adımlar 2-5 şematik. GR protein A-sepharose bir pelet bağlı GR (FiGR) karşı yükseltilmiş bir monoklonal antikor kullanarak hücre sitoplazmada immunoadsorbed. Hsp90 ve diğer hastabakıcı proteinler • hsp 90 heterocomplex GR ile birlikte immunoadsorbed endojen GR, bugünü ve GR steroid bağlamak mümkün. Hsp90 GR (Str) tuz sıyırma olarak adlandırılan hafif bir tuz tedavi, ayrı. Tuz elimden GR yarık steroid bağlanma steroide bağlamak sağlayamıyordu kapatır. Orta GR bağlayıcı steroid yeteneğine sahip • hsp 90 hsp70 içeren heterocomplexes, hsp40, Hop, saflaştırılmış proteinler ya da retikülosit lizat (Retik lizat) ve kofaktör tuz elimden GR inkübe (Recon) sulandırılmış olabilir. Her adımın steroid bağlanma aktivitesi ve immunopellet protein içeriği gecede [3 H] steroid kuluçka ve batı sırasıyla, blot tespit edilebilir.
Şekil 3 immunoadsorbed kompleksleri Elektroforetik protein analizi. A, sulandırılmış GR SDS-PAGE • electrotransfer ve Coomassie boyama takip konvansiyonel elektroforez sistemi kullanarak görüntülü hsp 90 heterocomplex. GR, hsp 90 ve hsp70 ek olarak, ağır zincir (HC) ve antikor hafif zincir (LC) görselleştirilebilir. Molekül ağırlığı belirteçleri (kDa olarak ifade edilmiştir.) Göç soldaki gösterilir. B, tuz elimden GR (Str) ve suni GR • hsp 90 heterocomplex (Recon) içeren immunopellets Western Blot. C, sulandırılmış GR sanal jel • Experion mikroakışkan elektroforez sistemi kullanılarak oluşturulan hsp 90 heterocomplex. İki farklı konsantrasyonlarda (NI IgG) immün olmayan ve immunoadsorbing antikorları (anti-GR) bağışıklık dahildir. NI IgGs negatif kontrol olarak hizmet vermektedir. D, sulandırılmış GR Elektroferogram • mikroakışkan elektroforez paneli B. Avantajları küçük örnek hacimleri için gereklilik üçüncü şeritte gösterilen Experion mikroakışkan elektroforez örnek alınan hsp 90 heterocomplex, gelişmiş kantifikasyon sıvı taşıma ve işletilen sonrası temizlik azalma, büyük ölçüde kısa bir örnek çalışır.
Şekil 4, endojen GR immunoadsorption (Enodg), tuz elimden GR (Str) aşağıdaki immunopellets steroid bağlayıcı aktivite ve GR sulandırılmış • hsp 90 heterocomplex (Recon) . Bir anti-GR immunoadsorbing monoklonal antikor (I) ile GR immunoadsorbing yanı sıra, her durum için negatif kontrol örnekleri immün olmayan immünglobulin (NI) kullanılarak hazırlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıda açıklanan test hsp90/hsp70-based hastabakıcı makineleri şaperon yanı sıra eylemlerin GR steroid bağlanma etkileyen şartlar sayısız test etmek için adapte edilebilir. Bu, daha önce bildirilen yöntemler 4,8,9,17 bir değişiklik ve elektroforez teknolojisi son gelişmeler yararlanmak ve daha geniş bir araştırma topluluğu erişilebilir olması için tasarlanmıştır . Ek ilgi kofaktör veya protein GR eklenebilir steroid bağlayıcı, heterocomplex protein-protein etkileşimleri ve co-faktör gereksinimleri üzerine etkilerini gözlemlemek amacıyla protokol Adım 4 açıklanan • hsp 90 heterocomplex sulandırıldıktan karışımı,. Örneğin, iskemi-reperfüzyon hsp 90 fonksiyon üzerindeki etkileri, reaktif oksijen türlerinin artan konsantrasyonlarda ilavesi ile modellenebilir. Belirli bir özellik (örneğin asetillenmiş hsp 90) ya da potansiyel hsp 90 inhibitörleri (örneğin yeni geldanamycin analogları) Saf proteinler üzerindeki etkileri belirlenecek steroid bağlayıcı ve heterocomplex oluşumu için eklenebilir.
Elektroforez farklı aşağı akım deneyleri, batı, blot ve steroid bağlayıcı deneyleri de istihdam edilebilir. Örneğin, immunoprecipitated multiprotein kompleksleri ile önemli başarı 18,19 flow sitometri ile analiz edilmiştir. Immunoadsorbed GR • hsp 90 kompleksleri de hsp90/hsp70 nükleotid devlet için test veya atomik kuvvet mikroskobu 17 kullanılarak görüntülendi olabilir. GR başka Hsp90 istemci proteinler (chaperoning kontrol noktası kinaz (Chk1) 20 gibi) olabilir ve yeni ufuklar açan araştırma, östrojen reseptörü, progesteron reseptörü ve Src 1,13,21 bu protokol varyasyonları kullanılarak yapılmıştır .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Elektroforez reaktifler seçin ve görüntü analiz yazılımı, Bio-Rad tarafından sağlanmıştır.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık hibe GM086822, Umut Kalp Enstitüsü Temel Bilimler ödül, ve MJ Murdock Hayırsever Güven Koleji Bilim Araştırma Programı Enstitüleri tarafından finanse edildi. Elektroforez reaktifler seçin ve görüntü analiz yazılımı, Bio-Rad tarafından cömertçe verilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sf9 insect cells | Invitrogen | for baculovirus expression of recombinant mouse GR | |
| L929 cells | ATCC | CRL-2173 | for endogenous mouse GR cytosol preparation (alternative to baculovirus expression) |
| FiGR hybridoma cells | ATCC | CRL-2173 | for preparing ascites containing anti-GR monoclonal antibody (alternative to purified BuGR2 antibody) |
| Complete-Mini protease inhibitor, EDTA-free | Roche Group | 11836170001 | |
| protein A-Sepharose | Sigma-Aldrich | P3391 | |
| rabbit reticulocyte lysate | Green Hectares (Oregon, WI) | rich source of endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery | |
| creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | for ATP-regenerating system |
| phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | for ATP-regenerating system |
| anti-GR mouse monoclonal antibody (BuGR2) | Pierce, Thermo Scientific | MA1-510 | used for GR immunoadsorption and as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp90 mouse monoclonal antibody (AC88) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-830 | used as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp70 mouse monoclonal antibody (N27F3-4) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-820 | used as primary antibody in western blotting |
| IgG from mouse serum | Sigma-Aldrich | 038K7690 | used as nonimmune antibody for negative control of immunoadsorption |
| anti-mouse IgG-peroxidase conjugate | Sigma-Aldrich | A4416 | used as secondary antibody in western blotting |
| Experion microfluidic electrophoresis system | Bio-Rad | 7007001 | alternative to conventional SDS-PAGE |
| [1,2,4,6,7-3H] dexamethasone | PerkinElmer, Inc. | NET1192001MC | follow safety precautions |
References
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery. Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).
- Murphy, P. J. M. Regulation of glucocorticoid receptor steroid binding and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery: implications for clinical intervention. Leukemia. 19, 710-712 (2005).
- Pratt, W. B., Morishima, Y., Osawa, Y. The Hsp90 chaperone machinery regulates signaling by modulating ligand binding clefts. J. Biol. Chem. 283, 22885-22889 (2008).
- Dittmar, K. D., Hutchison, K. A., Owens-Grillo, J. K., Pratt, W. B. Reconstitution of the steroid receptorhsp90 heterocomplex assembly system of rabbit reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 271, 12833-12839 (1996).
- Morishima, Y. The Hsp organizer protein hop enhances the rate of but is not essential for glucocorticoid receptor folding by the multiprotein Hsp90-based chaperone system. J. Biol. Chem. 275, 6894-6900 (2000).
- Murphy, P. J. M., Kanelakis, K. C., Galigniana, M. D., Morishima, Y., Pratt, W. B. Stoichiometry, abundance, and functional significance of the hsp90/hsp70-based multiprotein chaperone machinery in reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 276, 30092-30098 (2001).
- Dittmar, K. D., Pratt, W. B. Folding of the glucocorticoid receptor by the reconstituted Hsp90-based chaperone machinery. The initial hsp90.p60.hsp70-dependent step is sufficient for creating the steroid binding conformation. J. Biol. Chem. 272, 13047-13054 (1997).
- Kanelakis, K. C. Differential effects of the hsp70-binding protein BAG-1 on glucocorticoid receptor folding by the hsp90-based chaperone machinery. J. Biol. Chem. 274, 34134-34140 (1999).
- Morishima, Y., Kanelakis, K. C., Murphy, P. J. M., Shewach, D. S., Pratt, W. B. Evidence for iterative ratcheting of receptor-bound hsp70 between its ATP and ADP conformations during assembly of glucocorticoid receptor.hsp90 heterocomplexes. Biochemistry. 40, 1109-1116 (2001).
- Murphy, P. J. M. Pifithrin-alpha inhibits p53 signaling after interaction of the tumor suppressor protein with hsp90 and its nuclear translocation. J. Biol. Chem. 279, 30195-30201 (2004).
- Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone. J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).
- Morishima, Y., Murphy, P. J. M., Li, D. P., Sanchez, E. R., Pratt, W. B. Stepwise assembly of a glucocorticoid receptorhsp90 heterocomplex resolves two sequential ATP-dependent events involving first hsp70 and then hsp90 in opening of the steroid binding pocket. J. Biol. Chem. 275, 18054-18060 (2000).
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones. Endocr. Rev. 18, 306-360 (1997).
- Bodwell, J. E. Identification of phosphorylated sites in the mouse glucocorticoid receptor. J. Biol. Chem. 266, 7549-7555 (1991).
- Penna, A., Cahalan, M. W. estern Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J. Vis. Exp. (7), e264-e264 (2007).
- Choo, Y. S., Zhang, Z.
- Murphy, P. J. M. Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor•Hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft. J. Biol. Chem. 278, 34764-34773 (2003).
- Schrum, A. G. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Sci STKE. 389, pl2-pl2 (2007).
- Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (46), e2066-e2066 (2010).
- Felts, S. J., Karnitz, L. M., Toft, D. O. Functioning of the Hsp90 machine in chaperoning checkpoint kinase I (Chk1) and the progesterone receptor (PR). Cell Stress Chaperones. 12, 353-363 (2007).
- Cintron, N. S., Toft, D. Defining the requirements for Hsp40 and Hsp70 in the Hsp90 chaperone pathway. J. Biol. Chem. 281, 26235-26244 (2006).
