Ein<em> In-vitro-</em> Verfahren zur Herstellung von funktionellen Glucocorticoid-Rezeptor (GR) • hsp90-Protein-Komplexe aus gereinigten Proteinen und zellulären Lysaten beschrieben. Das Verfahren nutzt Immunadsorption von rekombinantem GR durch Salz-Strippen und Protein-Komplex Rekonstitution gefolgt. Die Bedeutung von Kofaktoren und Puffer-Bedingungen diskutiert werden, wie potenzielle Methode geeignet sind.
Hsp90 ist ein wesentlicher und sehr reichlich molekularen Chaperon-Protein, das gefunden wurde, mehr als 150 eukaryotischen Signalproteine, einschließlich Transkriptionsfaktoren (zB nukleare Rezeptoren, p53) und Proteinkinasen (zB Src, Raf, Akt-Kinase) in Zellzyklus beteiligt zu regeln, Tumorgenese, der Apoptose, und mehrere eukaryotischen Signalwege 1,2. Von diesen vielen "Kunden" Proteine für hsp90, die Montage von Steroid-Rezeptor • hsp90-Komplexen ist die beste definiert (Abb. 1). Wir stellen Ihnen hier eine anpassungsfähige Glucocorticoid-Rezeptor (GR) Immunpräzipitationsassay und in vitro GR • hsp90 Rekonstitution Methode, die ohne weiteres eingesetzt werden kann, um eukaryotische hsp90 funktionelle Aktivität, hsp90-vermittelte Steroid-Rezeptor-Liganden-Bindung und der molekularen Chaperon-Cofaktor Anforderungen Sonde. Zum Beispiel kann dieses Tests verwendet werden, um hsp90 Cofaktor Anforderungen und die Auswirkungen der Zugabe von exogenen Verbindungen zur Rekonstitution Verfahren zu testen.
Der GR hat ein besonders nützliches System für das Studium hsp90 worden, weil der Rezeptor hsp90 gebunden sein muss, um eine offene Ligandenbindung Spalt, auf den Steroid-3 ist zu haben. Endogene, unliganded GR ist im Zytoplasma von Säugerzellen kovalent an hsp90 gebunden. Wie in den endogenen GR • hsp90 Heterokomplex gefunden, wird der GR-Liganden Bindungsschlucht öffnen und binden Steroid. Wenn hsp90 distanziert sich von der GR oder wenn seine Funktion ist gehemmt, ist der Rezeptor nicht binden Steroid und die Rekonstitution des GR • hsp90 Heterokomplex vor steroid-bindenden Aktivität ist 4 restauriert. GR aus Zellcytosol mit einem monoklonalen Antikörper immunpräzipitiert, und Proteine, wie zB hsp90 im Komplex mit dem GR mittels Western Blot getestet werden kann. Steroid Bindungsaktivität des immunpräzipitiert GR kann durch Inkubation der immunopellet mit [3 H] Steroid bestimmt werden.
Frühere Experimente haben hsp90-vermittelte Öffnung der GR Ligandenbindung Spalt gezeigt, erfordert hsp70, ein zweiter molekularer Chaperone auch wichtig für eukaryontische Lebensfähigkeit der Zellen. Biochemische Aktivität von hsp90 und hsp70 werden durch Co-Chaperon-Proteinen Hop, Hsp40 und p23 5 katalysiert. Ein Multiprotein Chaperon Maschinen mit hsp90, hsp70, Hop und Hsp40 sind endogen in eukaryotischen Zelle Zytoplasma vorhanden ist, und Retikulozytenlysat bietet ein Chaperon-reiches Protein Quelle 6.
In dem vorgestellten Verfahren ist GR aus Zellcytosol immunoadsorbed und gestrippt des endogenen hsp90/hsp70 Chaperon Maschinen mit einer milden Salz Bedingungen. Das Salz-abgestreift GR wird dann mit Retikulozytenlysat, ATP und K +, die in die Wiederherstellung der GR Ergebnisse inkubiert • hsp90 Heterokomplex und Reaktivierung von Steroid-bindenden Aktivität 7. Diese Methode kann genutzt werden, um die Auswirkungen der verschiedenen Chaperon-Cofaktoren, neuartige Proteine und experimentelle hsp90 oder GR-Inhibitoren zu testen, um ihre funktionelle Bedeutung auf hsp90-vermittelte Steroid verbindlich 8-11 zu bestimmen.
Die oben beschriebenen Test lässt sich an einer Vielzahl von Erkrankungen des Chaperon Aktionen der hsp90/hsp70-based Chaperon Maschinen sowie GR Steroid verbindlich zu testen. Es ist eine Abwandlung der zuvor beschriebenen Verfahren 4,8,9,17 und ist so konzipiert, um die Vorteile der jüngsten Fortschritte in der Elektrophorese-Technik zu nehmen und werden von einem breiteren Forschungsgemeinschaft. Weitere Cofaktoren oder Proteine von Interesse kann der GR hinzugefügt werden • hsp90 Heterokomplex …
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health gewähren GM086822, Hope Heart Institute Basic Sciences ausgezeichnet, und die MJ Murdock Charitable Trust Hochschule Science Research-Programm finanziert. Wählen Elektrophorese Reagenzien und Bildanalyse-Software wurden großzügigerweise von Bio-Rad zur Verfügung gestellt.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
Sf9 insect cells | Invitrogen | for baculovirus expression of recombinant mouse GR | |
L929 cells | ATCC | CRL-2173 | for endogenous mouse GR cytosol preparation (alternative to baculovirus expression) |
FiGR hybridoma cells | ATCC | CRL-2173 | for preparing ascites containing anti-GR monoclonal antibody (alternative to purified BuGR2 antibody) |
Complete-Mini protease inhibitor, EDTA-free | Roche Applied Science | 11836170001 | |
protein A-Sepharose | Sigma-Aldrich | P3391 | |
rabbit reticulocyte lysate | Green Hectares (Oregon, WI) | rich source of endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery | |
creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | for ATP-regenerating system |
phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | for ATP-regenerating system |
anti-GR mouse monoclonal antibody (BuGR2) | Pierce/Thermo Scientific | MA1-510 | used for GR immunoadsorption and as primary antibody in western blotting |
anti-hsp90 mouse monoclonal antibody (AC88) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-830 | used as primary antibody in western blotting |
anti-hsp70 mouse monoclonal antibody (N27F3-4) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-820 | used as primary antibody in western blotting |
IgG from mouse serum | Sigma-Aldrich | 038K7690 | used as nonimmune antibody for negative control of immunoadsorption |
anti-mouse IgG-peroxidase conjugate | Sigma-Aldrich | A4416 | used as secondary antibody in western blotting |
Experion microfluidic electrophoresis system | Bio-Rad | 7007001 | alternative to conventional SDS-PAGE |
[1,2,4,6,7-3H] dexamethasone | PerkinElmer | NET1192001MC | follow safety precautions |