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Biology

Ricostituzione biochimica dei recettori di steroidi • Complessi proteina Hsp90 e la riattivazione del Ligand Binding

doi: 10.3791/3059 Published: September 21, 2011

Summary

Un

Abstract

Hsp90 è una proteina essenziale ed estremamente abbondante chaperone molecolare che è stato trovato per regolare più di 150 proteine ​​eucariotiche di segnalazione, inclusi i fattori di trascrizione (es. recettori nucleari, p53) e di proteine ​​chinasi (es. Src, Raf, Akt chinasi) coinvolto nel ciclismo cellulare, tumorigenesi, l'apoptosi, e più eucarioti 1,2 vie di segnalazione. Di questi molti 'cliente' per le proteine ​​Hsp90, l'assemblea dei recettori steroidei • hsp90 complessi è la miglior definito (Figura 1). Vi presentiamo qui un recettore glucocorticoide adattabile (GR) immunoprecipitazione e analisi in vitro GR • hsp90 metodo di ricostituzione che possono essere facilmente utilizzati per sondare eucariotiche hsp90 attività funzionale, hsp90-mediata ligando del recettore leganti gli steroidi, e molecolari requisiti cofattore accompagnatore. Per esempio, questo test può essere usato per testare hsp90 requisiti cofattore e gli effetti dell'aggiunta di composti esogeni al processo di ricostituzione.

Il GR è un sistema particolarmente utile per lo studio hsp90 perché il recettore deve essere associata a hsp90 di avere un legame aperto ligando fessura che sia accessibile a steroidi 3. Endogeno, GR unliganded è presente nel citoplasma delle cellule di mammifero noncovalently legato a hsp90. Come si trova nel GR endogeno • hsp90 heterocomplex, il legame con il ligando GR fessura è aperta e capace di steroidi vincolanti. Se hsp90 dissocia dalla GR o se la sua funzione è inibita, il recettore non è in grado di legare steroidi e richiede la ricostituzione del GR • hsp90 heterocomplex prima di steroidi attività di legame viene ripristinato 4. GR possono essere immunoprecipitato dal citoplasma delle cellule utilizzando un anticorpo monoclonale, e proteine ​​come hsp90 complessato al GR possono essere analizzati mediante western blot. Steroidi attività di legame della GR immunoprecipitato può essere determinato tramite l'incubazione del immunopellet con [3 H] steroidi.

Precedenti esperimenti hanno dimostrato hsp90-mediata apertura del legame con il ligando GR leporino richiede hsp70, un chaperone molecolare secondo anche essenziale per la vitalità delle cellule eucariotiche. Attività biochimica di Hsp90 e hsp70 sono catalizzate da co-chaperone Hop proteine, hsp40 e P23 5. Un macchinario chaperone multiproteici contenenti hsp90, hsp70, Hop, e hsp40 sono endogenamente presenti nel citoplasma delle cellule eucariotiche, e lisato di reticolociti fornisce una chaperone ricca fonte di proteine ​​6.

Nel metodo presentato, GR è immunoadsorbed dal citoplasma cellulare e spogliato della macchina endogeno chaperone hsp90/hsp70 utilizzando condizioni di sale mite. Il GR sale così estratto è poi incubato con lisato di reticolociti, ATP, e K +, che comporta la ricostituzione della GR • hsp90 heterocomplex e riattivazione di steroidi attività di legame 7. Questo metodo può essere utilizzato per verificare gli effetti di cofattori chaperone diverse, nuove proteine ​​e sperimentali inibitori Hsp90 o GR al fine di determinare la loro importanza funzionale hsp90-mediata steroidi 8-11 vincolanti.

Protocol

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1. Preparazione del citosol delle cellule contenenti GR funzionale

  1. Nota tecnica: Tutti i buffer devono essere refrigerati e ogni passo di questo protocollo, compresi centrifugazioni e l'incubazione, devono essere eseguiti su ghiaccio o a 4 ° C, salvo diversa indicazione. La bassa temperatura è essenziale per prevenire il degrado dei complessi GR e proteine.
  2. Utilizzando una centrifuga refrigerata, ottenere un ~ 1-5 ml di pellet di cellule che esprime una elevata concentrazione di GR funzionale. Esempi di fonti di cellule ricche di GR comprendono topo fibroblasti cellule L929, che esprimono una elevata concentrazione di GR endogeni, e SF9 cellule che sono state infettate con baculovirus ricombinante GR (ad esempio il p2Bac-MGR baculovirus 12). Circa 15-20 ml di cellule confezionato è ottenuto per litro di SF9 cultura baculovirus cellulare. Le cellule devono essere in crescita esponenziale prima della raccolta. Centrifugare la sospensione cellulare a 5.000 × g per 5 min.
  3. Lavare il pellet di cellule per tre volte con 15 ml di soluzione salina tamponata Hanks '. Tra un lavaggio e, delicatamente risospendere il pellet, seguita da centrifugazione a 5.000 g per 5 min. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere completamente il sopranatante.
  4. Preparare 7,5 ml di un buffer di omogeneizzazione contenente tampone HEM (10 HEPES mM, 1 mM EDTA, 20 mM molibdato di sodio, pH 7,4), 1 fluoruro phenylmethylsulfonyl mM (PMSF), e 3 compresse terra di completa-Mini inibitore della proteasi. Il PMSF e completa-Mini compresse prevenire proteolisi che si verifichino durante le fasi successive. Completa mini-compresse possono essere facilmente ridotto in polvere fine con un mortaio e pestello. Aggiungere 1,5 volumi di buffer di omogeneizzazione al pellet cellulare.
  5. Rottura delle cellule di omogeneizzazione Dounce (50 colpi) o di gelo / disgelo (3 cicli) tecnica. Omogeneizzazione Dounce può mantenere una migliore GR endogeno • hsp90 complessi proteici ed è più veloce da completare. Gelo / disgelo ricercatore offre l'opportunità di sospendere il protocollo di questo passaggio e continuare in un secondo momento. Omogeneizzazione Dounce dovrebbe essere eseguita con l'omogeneizzatore nel secchiello del ghiaccio per evitare la degradazione delle proteine. Gelo / disgelo può essere realizzato congelando i provetta contenente il pellet di cellule-omogeneizzazione miscela tampone con azoto liquido, ghiaccio secco, o -20 ° C di incubazione, seguita da scongelamento in un bagno d'acqua 30 ° C.
  6. Separare il GR contenenti citosol dalla materia rottura particolato cella ultracentrifugazione. Trasferire l'omogeneizzato ai tubi ultracentrifuga durevoli, tubi di equilibrio di massa in coppia, e centrifugare a 100.000 × g per 30 minuti.
  7. Rimuovere il citosol (surnatante) e conservare a -20 ° C in 500 microlitri aliquote in provette da 1,5 ml microcentrifuga per conservazione a lungo termine. Per mantenere la massima attività funzionale GR, flash-congelare le aliquote in azoto liquido o incubare per 30 secondi in un metanolo-bagno di ghiaccio secco prima di stoccaggio. Fare attenzione per evitare il contatto diretto della pelle con il reagente di raffreddamento.

2. Immunoadsorbimento di GR dalla cellula citosol

  1. Nota tecnica: La figura 2 offre una panoramica schematica delle fasi 2-5 di questo protocollo.
  2. Preparare un impasto immunoadsorbimento contenente un anticorpo monoclonale immunoglobulina G (IgG) di anticorpi sollevate contro il GR di immunoadsorb il recettore preparata nella fase 1. In una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, unire 100 l di scongelato GR contenenti citosol, 200 microlitri di buffer TEGM (8 TES mm, 4 mm EDTA, 50 mM NaCl, 20 mM molibdato, 10% (v / v) glicerolo, pH 7,6) , 100 ml di una proteina del 20% A-Sepharose (PAS) mcg liquami (v / v, preparato in tampone TEGM), e 5 di anti-GR anticorpo monoclonale IgG (ad es BuGR2). Molibdato è incluso nel buffer TEGM al fine di contribuire a stabilizzare il GR-hsp90 heterocomplex, che può essere utile per l'attività endogena saggio heterocomplex leganti gli steroidi 13.
    1. Anticorpi anti-GR è disponibile in commercio come le proteine ​​purificate. In alternativa, può essere ottenuto aggiungendo 10 l di IgG anti-GR-ascite contenente la miscela immunoadsorbimento. Ascite è prodotto da topi trattati con anti-GR ibridomi (ad esempio FiGR ibridomi 14), e la concentrazione di anticorpi approssimativa ottenuta da ascite e utilizzata in questi esperimenti era di 0,5 mg / mL, misurata con il saggio Bradford.
    2. Preparare un campione di controllo negativo utilizzando GR contenenti citosol, tampone TEGM, e PAS (come descritto sopra), e 5 mg di IgG che non riconosce la GR, hsp90, o altre proteine ​​chaperone molecolare (indicato come un "immune" anticorpi).
    3. A causa delle dimensioni relativamente grandi PAS perlina, utilizzare un taglio P-200 punta della pipetta durante il trasferimento PAS dal liquame 20% a provette. Puntali taglio sono preparate mediante tranciatura di 2-3 mm al largo della fine del commercio P-200 suggerimenti, aumentando così l'apertura punta della pipetta.
  3. I campioni su una ruota verticale rotante e incubare per un minimo di 2 ore con rotazione costante. I campioni possonoessere incubate per un massimo di 8 ore senza perdita di attività.
  4. Al termine della incubazione immunoadsorbimento, rimuovere le proteine ​​dissociato dal anticorpo-PAS pellet ("immunopellet") per centrifugazione. Separare i surnatanti da immunopellets per centrifugazione utilizzando una centrifuga refrigerata programmato per 1 minuto a 10.000 × g, e poi lavare due volte con buffer di 1 ml e TEGM vortice. In seguito a centrifugazione e tra un lavaggio e, scartare il surnatante essere cauti per non disturbare il pellet.
    1. Rimuovere tutti i supernatante alla conclusione del secondo lavaggio. Al fine di garantire nessuno dei pellet è inavvertitamente aspirati, utilizzare un graffato P-200 punta della pipetta di aspirazione finale supernatante. Puntali crimpati sono preparati da appiattendo disponibili in commercio P-200 con pinze punte.

3. Dissociazione di Hsp90 endogeno da GR immunopellet ("Salt stripping")

  1. Per il immunopellet lavato preparata al punto 2, aggiungere 355 microlitri TEG tampone (buffer TEGM senza molibdato di sodio) e 45 ml di NaCl 5 M (concentrazione finale NaCl = 0,5 M).
  2. I campioni su una ruota verticale rotante e incubare per 1,5 ore con rotazione costante. I campioni possono essere incubate per 2 ore, tuttavia, più incubazioni possono portare al recupero di proteine ​​è diminuito e la minore attività funzionale.
  3. Eliminare le proteine ​​dissociato dal immunopellet per centrifugazione. Spin campioni per 1 minuto a 10.000 x g. Lavare una volta con 1 ml di tampone TEG e una volta con 1 ml di buffer di 10 mm HEPES, pH 7,4.
  4. Rimuovere tutti i supernatante alla conclusione del secondo lavaggio, facendo attenzione a non disturbare il immunopellet, utilizzando un graffato P-200 punta della pipetta.

4. Ricostituzione della GR • hsp90 heterocomplex utilizzando chaperon molecolari, cofattori, e ATP

  1. Nota tecnica: una miriade di condizioni sperimentali possono essere testati da comprese le proteine ​​addizionali, cofattori, attivatori o inibitori di interesse nella miscela preparata ricostituzione di seguito. Il volume totale di miscele ricostituzione deve essere <120 microlitri.
  2. Per ciascun sale spogliato immunopellet preparata al punto 3, aggiungere una miscela ricostituzione contenente 50 ml di una fonte di chaperone molecolare e 5 ml di un ATP sistema di generazione (10 HEPES mm, 50 mm ATP, 250 creatina fosfato mM, 20 mM acetato di magnesio , 100 U / ml creatina fosfochinasi, pH 7,4).
    1. Reazioni ricostituzione può essere aumentata di integrare la miscela ricostituzione con 50 microlitri di buffer HKD (10 HEPES mm, 100 mm KCl, 5 mM ditiotreitolo (DTT), pH 7,4) e altri 5 ml di ATP sistema di generazione. Questo passaggio può essere omesso se la ricostituzione ampio e vincolante steroidi sono stati osservati. KCl aumenta l'attività hsp70 ATPasi e DTT protegge cisteina contenenti proteine ​​dall'ossidazione 9.
    2. Una fonte raccomandata chaperone molecolare è disponibile in commercio lisato di reticolociti di coniglio. Individuale chaperon molecolari purificato da lisato di reticolociti o ricombinante espresso (ad esempio 15 mcg hsp90, hsp70 15 mg, 0.6 mg Hop, 6 mg P23, e 0,125 mg hsp40 in HKD buffer) possono anche essere utilizzati.
  3. Incubare i campioni in un bagno d'acqua 30 ° C per 20 minuti esatti. Tubi Flick ogni 1-2 minuti per disturbare delicatamente il pellet e mescolare la soluzione ricostituzione.
  4. Aggiungere 1 ml TEGM tampone, vortex e centrifugare a 10.000 × g per 1 minuto. Rimuovere il supernatante ed eliminarlo facendo attenzione a non disturbare il pellet. Ripetere l'operazione per un totale di tre lavaggi. Rimuovere completamente tutti i supernatante alla conclusione del lavaggio finale, con un crimpati P-200 punta della pipetta.

5. Analisi di complessi proteici ricostituito e l'attività di legame

  1. Proteine ​​nel ricostituito immunopellet può essere identificato dal convenzionale elettroforesi su gel di poliacrilammide denaturante (SDS-PAGE), elettroforesi microfluidica (ad esempio, Bio-Rad Experion) e western blotting (Fig. 3). Nota tecnica: i protocolli Eccellente descrivere SDS-PAGE 15 e western blotting 16 sono attualmente disponibili, per gentile concessione di altri ricercatori.
    1. Aggiungere 50 ml di SDS-PAGE tampone campione contenente β-mercaptoetanolo e vortice. Specifiche ricette tampone campione variare. Selezionare uno sulla base della raccomandazione del costruttore del sistema di elettroforesi da impiegare.
    2. Incubare per 5 minuti in un bagno d'acqua bollente o 100 ° C di calore blocco elettronico.
    3. Centrifugare a 10.000 × g per 1 minuto. L'anticorpo immunoadsorbing, GR, e le proteine ​​complessato a GR saranno dissociati gli uni dagli altri e rilasciato nel supernatante buffer di campione.
    4. Trasferire il supernatante in una provetta fresco con una punta crimpati P-200 punta della pipetta. Eliminare il pellet. Il campione è ora pronto per l'analisi disponibili in commercio con SDS-PAGE o sistemi di elettroforesi microfluidica. La redazione delle f tecnicaopo le istruzioni del produttore.
    5. Western blot seguenti SDS-PAGE permette un'identificazione definitiva del GR immunoadsorbed e chaperon molecolare complessato al GR segue l'incubazione ricostituzione. Utilizzare gli anticorpi monoclonali primario sollevata contro GR (BuGR2), Hsp90 (AC88), hsp70 (N27F3-4) e co-chaperone proteine ​​per rilevare i principali componenti della GR • hsp90 complesso proteico.
  2. Attivazione funzionale del sale-spogliato GR Dopo la ricostituzione del GR • hsp90 complesso proteico può essere identificato dal dosaggio di steroidi attività di legame con una [3 H] steroide (Fig. 4). Per il resto del protocollo, seguire le precauzioni necessarie per la movimentazione in sicurezza dei campioni triziata e rifiuti.
    1. Per la immunopellet ricostituito, aggiungere 47,5 microlitri di buffer HEM e 2,5 l di 2 mM [3 H] desametasone (concentrazione finale di steroidi = 100 nM).
    2. Mescolare delicatamente il pellet facendo attenzione a minimizzare la quantità di campione sfollati alla parete della provetta.
    3. Incubare per una notte sul ghiaccio. Non è necessario per ruotare o miscelare i tubi campione durante questa incubazione.
    4. Aggiungere 1 ml di tampone TEGM, mescolare delicatamente e centrifugare a 10.000 × g per 1 minuto. Eliminare il supernatante, memori contiene legato [3 H] steroidi. Ripetere l'operazione per un totale di 3 lavaggi con tampone TEGM.
    5. Rimuovere completamente tutti i supernatante alla conclusione del lavaggio finale, con un crimpati P-200 punta della pipetta. Il pellet contiene GR, chaperon molecolari Hsp90 e altri complessato per il GR, e [3 H] steroide specificamente legato al recettore. Legame aspecifico può essere calcolato includendo 1000-fold in eccesso non triziata desametasone nella miscela di incubazione durante la notte. Come controllo negativo si alternano, l'anti-GR anticorpi immunoadsorbing aggiunto nel passaggio 2.2 possono essere sostituite con un non-GR-immunoadsorbing anticorpi (NI).
    6. Sospendere il immunopellets lavati in 200 microlitri di buffer TEGM e trasferimento in fiale da 10 ml a scintillazione con un taglio P-200 punta della pipetta.
    7. Aggiungere 4,8 ml di cocktail di scintillazione le fiale e vortice.
    8. La quantità di [3 H] vincolante di steroidi per il GR ricostituito • hsp90 complesso di proteine ​​possono essere analizzati con spettrometria di liquido di scintillazione.

6. Rappresentante dei risultati:

Rappresentante SDS-PAGE e Western Blot dati sono presentati nella Figura 3. Il GR endogeno • hsp90 heterocomplex è immunoadsorbed dal citoplasma cellulare utilizzando anticorpi anti-GR e delle singole proteine ​​che co-immunoadsorb con il GR sono visibili con la colorazione Coomassie (Fig. 3A). La conferma dell'identità di proteine ​​di qualsiasi componente del immunopellet in qualsiasi fase del test ricostituzione può essere effettuata mediante SDS-PAGE calcolo del peso molecolare e Western blotting utilizzando anticorpi monoclonali sollevate contro la proteina di interesse.

GR ricostituito • hsp90 heterocomplexes sono presentati utilizzando Experion dati elettroforesi microfluidica (Fig. 3C e 3D) e l'analisi western blot (Fig. 3B). La specificità del immunoadsorbimento GR è confermata sostituendo la immunoadsorbing anticorpi anti-GR con un anticorpo non immune (Fig. 3C, NI corsie IgG). Anche quando una quantità eccessiva di anticorpi non immune vengono utilizzati, non chaperon GR o molecolari sono immunoprecipitati (cfr. in fig. 3C, il GR, hsp90, hsp70 e bande proteiche presenti nel campo anti-GR corsie immunoadsorbimento con la mancanza di banda osservata nel NI corsie IgG). Allo stesso modo, è possibile confermare la dissociazione di Hsp90 e delle proteine ​​chaperone altro dal sale spogliato GR mediante analisi western blot (Fig. 3B) del immunopellets spogliato e ricostituito. La catena pesante dell'anticorpo immunoadsorbing (HC) è rilevabile sia da Coomassie macchia e western blotting, e serve a confermare immunopellets uguali dimensioni vengono visualizzati in ogni corsia.

Steroidi attività di legame della GR immunoadsorbed possono essere analizzati da per tutte le condizioni testate, e del rappresentante dati leganti gli steroidi sono presentati nella Figura 4. GR endogeno • hsp90 heterocomplexes sono immunoadsorbed, sale spogliati, e ricostituita. Utilizzando lisato di reticolociti o proteine ​​purificate, steroidi attività di legame della GR ricostituito • hsp90 heterocomplex genere restituisce al 75-100% della GR endogeno • hsp90 livello di attività vincolanti. Simile ai dati elettroforesi, un anticorpo non immune (NI) possono essere utilizzati al posto di anticorpi anti-GR (I) al fine di servire come controllo negativo e come misura di non specifico [3 H] vincolante steroidi.

Figura 1
Figura 1. Modello di GR • Hsp90 montaggio heterocomplex e GR steroidi apertura vincolante leporino. La macchina chaperone hsp90/hsp70-based converte il dominio di legame GR da un folDED conformazione in cui il legame steroide fessura è chiuso e non accessibile al ormone per una conformazione aperta fessura che si può accedere (illustrato dall'icona eterociclici steroidi). La macchina chaperone è preassemblato in cella e si formano spontaneamente quando purificata hsp90, hsp70 e Hop sono mescolati in soluzione (reazione 1). Hop contiene 34 aminoacidi ripetere tetratricopeptide acido (TPR) dominio (illustrato come una mezzaluna scura), e viene poi sostituito durante il processo di maturazione heterocomplex da un dominio contenente proteine ​​TPR immunofillina. La macchina si apre il legame steroide in una fessura ATP-e K +-dipendente, dopo di che Hop e la maggior parte del fine hsp70 e hsp40 lasciare il complesso (illustrato come icona tratteggiata). Meccanicisticamente, hsp70 interagisce con la GR prima di hsp90 e innesca il recettore per Hsp90 e la successiva apertura di fessura. Sperimentalmente, vincolante steroidi e apertura GR leporino sono aumentate se hsp90 e hsp70 sono simultaneamente presenti. Il heterocomplex è stabilizzato ingresso del co-chaperone Hsp90 p23, che mantiene Hsp90 in un ATP-bound conformazione. Dopo l'uscita di Hop, un alto peso molecolare immunofillina (IMM) può legare hsp90, formando la heterocomplex finale perché è recuperato dalle cellule. Adattato da Pratt e Toft 1.

Figura 2
Figura 2. Rappresentazione schematica delle fasi 2-5 di questo protocollo. Il GR è immunoadsorbed dal citoplasma delle cellule utilizzando un anticorpo monoclonale sollevate contro la GR (FiGR) legato a una pallina di proteina A-Sepharose. Hsp90 e proteine ​​chaperone altri presenti nel GR endogeno • hsp90 heterocomplex sono co-immunoadsorbed con il GR, e la GR è in grado di legarsi a steroidi. Hsp90 è dissociato dalla GR con un trattamento dolce di sale, di cui come sale-stripping (Str). Il legame steroide fessura del sale spogliato GR chiude, rendendola incapace di legarsi a steroidi. Intermedio GR • hsp90 heterocomplexes contenente hsp70, hsp40 e luppolo, che sono in grado di steroidi vincolante, può essere ricostituito (Recon) tramite l'incubazione del sale spogliato GR con proteine ​​purificate o lisato reticolociti (Retic lisato) e cofattori. L'attività di steroidi vincolante e contenuto proteico immunopellet di ogni passo può essere identificata da una notte [3 H] incubazione di steroidi e di Western blotting, rispettivamente.

Figura 3
Figura 3. Analisi elettroforetica delle proteine ​​dei complessi immunoadsorbed. A, SDS-PAGE di GR ricostituito • hsp90 heterocomplex ripreso utilizzando il sistema tradizionale elettroforesi seguita da electrotransfer e colorazione Coomassie. Oltre a GR, hsp90 e hsp70, la catena pesante (HC) e catena leggera (LC) degli anticorpi sono visualizzati. La migrazione dei marcatori di peso molecolare (espresso in kDa) sono indicati sulla sinistra. B, Western blot di immunopellets contenente sali-spogliato GR (Str) e GR ricostituito • hsp90 heterocomplex (Recon). C, gel virtuale di GR ricostituito • hsp90 heterocomplex generato usando un elettroforesi microfluidica Experion sistema. Due concentrazioni diverse di un non immune (NI IgG) e immunitarie (anti-GR) immunoadsorbing anticorpi sono inclusi. IgG NI servono come controlli negativi. D, elettroferogramma di GR ricostituito • hsp90 heterocomplex ottenuto dal campione Experion elettroforesi microfluidica mostrato nella terza corsia del pannello Vantaggi B. elettroforesi microfluidica figura anche l'obbligo per i volumi campione più piccolo, è diminuito di gestione dei liquidi e post-run di pulizia, una migliore quantificazione, e sostanzialmente più breve esempio viene eseguito.

Figura 4
Figura 4. Steroidi attività di legame di immunopellets seguenti immunoadsorbimento di GR endogeni (Enodg), sale spogliato GR (Str), e ricostituito GR • hsp90 heterocomplex (Recon). Oltre a immunoadsorbing la GR con un anticorpo monoclonale anti-GR anticorpi immunoadsorbing (I), campioni di controllo negativo per ogni condizione sono stati preparati con una immunoglobulina non immune (NI).

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Discussion

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Il test di cui sopra può essere adattato per testare una miriade di malattie che interessano l'azione chaperone della macchina chaperone hsp90/hsp70-based così come vincolanti GR steroidi. Si tratta di una modifica dei metodi precedentemente segnalato 4,8,9,17 ed è progettato per sfruttare i recenti progressi nella tecnologia elettroforesi ed essere accessibili a una comunità di ricerca più ampio. Cofattori aggiuntivi o proteine ​​di interesse possono essere aggiunti alla miscela GR • hsp90 ricostituzione heterocomplex, descritto al punto 4 del protocollo, al fine di osservare gli effetti sulla steroidi vincolanti, heterocomplex interazioni proteina-proteina, e co-fattore di requisiti. Per esempio, gli effetti di ischemia-riperfusione in hsp90 funzione può essere modellata con l'aggiunta di concentrazioni crescenti di una specie reattive dell'ossigeno. Proteine ​​purificate con una funzione specifica (per esempio acetilati hsp90) o potenziali hsp90 inibitori (ad esempio gli analoghi Geldanamycin romanzo) possono essere aggiunti in modo che i loro effetti sul steroidi formazione vincolante e heterocomplex da determinare.

A valle test diverso da elettroforesi, saggi di binding western blotting, e steroidi possono anche essere impiegati. Per esempio, complessi multiproteici immunoprecipitati sono stati analizzati mediante citometria di flusso con sostanziale successo 18,19. Il GR immunoadsorbed • hsp90 complessi possono essere analizzati per hsp90/hsp70 stato nucleotidi o visualizzate utilizzando la microscopia a forza atomica 17. Hsp90 proteine ​​cliente diverso dal GR possono essere utilizzati (ad es chaperoning checkpoint chinasi I (Chk1) 20), e la ricerca seminale è stata condotta utilizzando varianti di questo protocollo con il recettore degli estrogeni, recettore del progesterone, e Src 1,13,21.

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Disclosures

Seleziona reagenti elettroforesi e software di analisi dell'immagine sono stati forniti da Bio-Rad.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health concedere GM086822, Hope Heart Institute di base Scienze premio, e il MJ Murdock Charitable Fiducia Science Program College di ricerca. Seleziona reagenti elettroforesi e software di analisi immagine sono stati generosamente forniti da Bio-Rad.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sf9 insect cells Invitrogen for baculovirus expression of recombinant mouse GR
L929 cells ATCC CRL-2173 for endogenous mouse GR cytosol preparation (alternative to baculovirus expression)
FiGR hybridoma cells ATCC CRL-2173 for preparing ascites containing anti-GR monoclonal antibody (alternative to purified BuGR2 antibody)
Complete-Mini protease inhibitor, EDTA-free Roche Group 11836170001
protein A-Sepharose Sigma-Aldrich P3391
rabbit reticulocyte lysate Green Hectares (Oregon, WI) rich source of endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery
creatine phosphokinase Sigma-Aldrich C3755 for ATP-regenerating system
phosphocreatine Sigma-Aldrich P7936 for ATP-regenerating system
anti-GR mouse monoclonal antibody (BuGR2) Pierce, Thermo Scientific MA1-510 used for GR immunoadsorption and as primary antibody in western blotting
anti-hsp90 mouse monoclonal antibody (AC88) Enzo Life Sciences ADI-SPA-830 used as primary antibody in western blotting
anti-hsp70 mouse monoclonal antibody (N27F3-4) Enzo Life Sciences ADI-SPA-820 used as primary antibody in western blotting
IgG from mouse serum Sigma-Aldrich 038K7690 used as nonimmune antibody for negative control of immunoadsorption
anti-mouse IgG-peroxidase conjugate Sigma-Aldrich A4416 used as secondary antibody in western blotting
Experion microfluidic electrophoresis system Bio-Rad 7007001 alternative to conventional SDS-PAGE
[1,2,4,6,7-3H] dexamethasone PerkinElmer, Inc. NET1192001MC follow safety precautions

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References

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Ricostituzione biochimica dei recettori di steroidi • Complessi proteina Hsp90 e la riattivazione del Ligand Binding
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Murphy, P. J. M., Franklin, H. R., Furukawa, N. W. Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor•Hsp90 Protein Complexes and Reactivation of Ligand Binding. J. Vis. Exp. (55), e3059, doi:10.3791/3059 (2011).More

Murphy, P. J. M., Franklin, H. R., Furukawa, N. W. Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor•Hsp90 Protein Complexes and Reactivation of Ligand Binding. J. Vis. Exp. (55), e3059, doi:10.3791/3059 (2011).

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