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Biology

ステロイド受容体の生化学的再構成には、•Hsp90のタンパク質複合体とリガンド結合の再活性化

doi: 10.3791/3059 Published: September 21, 2011

Summary

不定冠詞

Abstract

Hsp90は、細胞周期に関与する転写因子(例えば核内受容体は、p53)およびプロテインキナーゼ(例えば、Srcの、Rafが、Aktキナーゼ)を含む150以上の真核生物のシグナル伝達タンパク質を、調節することが認可されていますが不可欠と非常に豊富な分子シャペロンタンパク質です。腫瘍形成、アポトーシス、および複数の真核生物のシグナル伝達経路の1,2。 HSP90のためのこれらの多くの"クライアント"タンパク質のうち、ステロイド受容体の組み立て•HSP90複合体( 図1)定義されているベストです。ここでは、順応性グルココルチコイド受容体(GR)免疫沈降アッセイを提示し、容易に真核生物のHSP90の機能的活性、HSP90を介したステロイド受容体のリガンド結合、および分子シャペロンの補因子の要件を調べるために使用される体外 GR•Hsp90の再構築の方法 。例えば、このアッセイは、Hsp90の補因子の要件と再構成のプロセスに外因性化合物を追加した場合の効果をテストするために使用できます。

受容体はステロイド3にアクセス可能なクレフトオープンリガンドの結合を持つことがHSP90にバインドする必要があるため、GRは、HSP90を研究するための特に有用なシステムとなっています。内因性、リガンド非結合GRは非共有結合的にHSP90に結合した哺乳動物細胞の細胞質に存在​​しています。内因性のGR•Hsp90のヘテロ複合体に見られるように、溝GRのリガンド結合は、オープンと結合ステロイドが可能です。 HSP90 GRから解離し、またはその機能が阻害されている場合、受容体はステロイド結合することができず、ステロイド結合アクティビティの前にGR•HSP90ヘテロ複合体の再構成を必要とする、4を復元している場合。 GRは、モノクローナル抗体を用いて細胞質ゾルから免疫沈降、およびウェスタンブロットによりアッセイすることができるようなHSP90のようなタンパク質は、GRに複合することができます。免疫沈降したGRのステロイド結合活性は[3 H]ステロイドでimmunopelletをインキュベートすることによって決定することができます。

以前の実験では、間隙GRのリガンド結合は、真核細胞の生存にも欠かせない第二の分子シャペロンをHSP70が必要なのHsp90 -介した開口部を示している。 HSP90とHSP70の生化学的活性はコシャペロンタンパク質のホップ、HSP40、およびp23の5によって触媒される。 HSP90、HSP70、ホップ、及びHSP40を含む多タンパク質シャペロンの機械は、真核細胞の細胞質内で内在的に存在し、網状赤血球は、シャペロンの豊富なタンパク質源6が用意されいます。

提示方法では、GRは細胞質ゾルからimmunoadsorbedさとマイルドな塩条件を用いて内因性hsp90/hsp70シャペロンの機械を剥奪。塩取り除かれたGRは、網状赤血球ライセート、ATP、およびステロイド結合活性7のGR•Hsp90のヘテロ複合体と再活性化の再構成で、その結果、K +、とインキュベートされる。このメソッドは、8月11日 HSP90を介したステロイド結合にその機能的意義を判断するために、様々なシャペロン補助因子、新規タンパク質、および実験的なHSP90またはGR阻害剤の効果をテストするために利用することができます。

Protocol

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1。機能的なGRを含む細胞質ゾルの調製

  1. テクニカルノート:特に断りのない限り、すべてのバッファは、遠心分離およびインキュベーションを含むこのプロトコルの冷蔵及び各ステップ、あるべきは、氷の上または4℃で行ってください。低温では、GRとタンパク質の複合体の劣化を防ぐために不可欠です。
  2. 冷却遠心機を使用して、機能的なGRの高濃度を表すセルの〜1〜5ミリリットルペレットを得る。 GRの豊富な細胞源としては、マウスの線維芽細胞内因性のGRの高濃度を表現するL929細胞、および組換えGRのバキュロウイルス(例えばp2Bac - MGRバキュロ12)に感染しているSf9細胞などがあります。パックされた細胞の約15〜20 mlのSf9細胞バキュロウイルスの細胞培養のリットル当たり得られる。細胞は、前の収穫に指数関数的に成長する必要があります。 5分間5,000 × gで細胞懸濁液を遠心してください。
  3. ハンクス緩衝生理食塩溶液15mlで細胞ペレットを3回洗浄する。洗浄の間に、穏やかに5分間5,000 × gで遠心分離に続いてペレットを、懸濁します。最後の洗浄に続いて、完全に上清を取り除く。
  4. HEMバッファー(10mMのHEPES、1mMのEDTA、20mMのモリブデン酸ナトリウム、pH7.4)を、1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)、および完全なミニプロテアーゼ阻害剤の3グランドの錠剤を含む均質化緩衝液7.5 mlを調製。 PMSFおよび完全なミニタブレットは、後続の手順中に発生するからタンパク質分解を防ぐ。完全なミニ錠剤は、簡単に乳鉢と乳棒で微粉末に粉砕することができます。細胞ペレットに均質化緩衝液の1.5倍量を追加。
  5. 破裂ダウンス均質化(50ストローク)または凍結/解凍(3サイクル)法による細胞。ダウンスの均質化が改善された内因性のGR•HSP90蛋白質複合体を維持し、完了するために高速ですがあります。凍結/融解の研究者のこの段階でプロトコルを中断し、後で継続する機会を提供しています。ダウンスの均質化は、タンパク質の分解を防ぐために、氷のバケツのホモジナイザーで実行する必要があります。凍結/融解を30℃の水浴で融解することによって続いて液体窒素、ドライアイス、または-20℃のインキュベーションで細胞ペレット-均質化緩衝液の混合物を含む遠心管を凍結することによって行うことができます。
  6. GR -を含む超遠心分離により破裂した細胞の粒子状物質から細胞質ゾルを区切ります。 30分間、100,000 × gで耐久性のある超遠心管、ペアの質量バランスの管、及び遠心分離機にホモジネートを移す。
  7. 長期保存のため1.5 mlのマイクロチューブに500μlのアリコートで-20細胞質ゾル(清)とストア° Cを取り外します。最大の機能GRの活性を保持するために、保管前にメタノール - ドライアイス浴中で30秒間液体窒素やインキュベートのアリコートを急速冷凍。冷却試薬との直接皮膚接触を避けるために注意してください。

2。細胞質ゾルからGRの免疫吸着

  1. テクニカルノート:図2は、このプロトコルのステップ2-5の回路図の概要を提供します。
  2. ステップ1で調製した受容体をimmunoadsorbするGRに対して惹起されたモノクローナル免疫グロブリンG(IgG)抗体を含む免疫吸着液を調製する。 1.5 mlのマイクロ遠心チューブに、解凍した100μlのGR -を含む細胞質ゾル、200μlのTEGMバッファを(8ミリのTES、4mMのEDTA、50mMのNaCl、20mMのモリブデン、10%(v / v)グリセロール、pH7.6)で組み合わせる、20%の蛋白質A -セファロース(PAS)スラリー(V / V、TEGMの緩衝液中で調製)、および抗GRモノクローナルIgG抗体(例えばBuGR2)の5μgを100μlの。モリブデン酸塩はGR - HSP90アッセイ内因性ヘテロステロイド結合活性を13〜ために有用である可能性がヘテロ複合体を、安定化を助けるためにTEGMバッファに含まれています。
    1. 抗GR抗体は、精製タンパク質として市販されている。また、それは免疫吸着の混合物に抗GR IgG抗体を含む腹水10μlを加えることによって得ることができる。腹水は抗GRハイブリドーマ細胞(例えばFiGRハイブリドーマ細胞14)を注射したマウスで生産され、腹水から得られた、これらの実験で使用されているおおよその抗体濃度は、ブラッドフォードアッセイにより測定された、0.5μgの/μlであったれている。
    2. GR -を含む細胞質ゾル、TEGMバッファ、およびPAS(上述)、およびGRを認識しないIgG抗体5μgの、HSP90、または"非免疫"と呼ばれる他の分子シャペロンタンパク質を(使用して陰性対照サンプルを準備する抗体)。
    3. 20%のスラリーからサンプルチューブにPASを転送する際に比較的大きなPASビーズの大きさのために、カットP - 200ピペットチップを使用してください。カットピペットチップはピペットチップの開口部を大きくするので、市販のP - 200のヒントの最後の2-3 mmをオフにスライスすることによって調製される。
  3. 一定回転で2時間の最小の垂直回転する車輪とインキュベート上の場所のサンプル。サンプル可能性があります活性の損失なしで最大8時間までインキュベートする。
  4. 免疫吸着のインキュベーションの終了時に、遠心分離によって抗体- PASペレット("immunopellet")から未結合のタンパク質を除去。 10,000 × gで1分のためにプログラム冷却遠心機を用いて遠心分離によりimmunopelletsから上清を分離し、1 mlのTEGMバッファーとボルテックスで2回洗浄。遠心分離と洗浄の間に続いて、ペレットを妨害しないように慎重になって上清を捨てます。
    1. 回目の洗浄の終了時にすべての上清を取り除きます。ペレットのいずれも誤って吸い出されていないことを確認するためには、圧着P - 200最後の上清を吸引するためのピペットチップを使用してください。クリンプピペットチップは、鉗子を用いて市販のP - 200のヒントをフラット化することによって調製される。

3。 GR immunopelletから内因性Hsp90の解離("塩の除去")

  1. ステップ2で調製した洗浄immunopelletに、355μlのTEGバッファー(モリブデン酸ナトリウムなしTEGMバッファ)との5M NaCl(最終NaCl濃度= 0.5 M)の45μlを加える。
  2. 一定回転で1.5時間、縦回転する車輪とインキュベート上の場所のサンプル。サンプルは2時間までインキュベートすることができますが、より長いインキュベーション時間が減少したタンパク質の回収率と低い機能活性につながる可能性があります。
  3. 遠心分離によってimmunopelletから未結合のタンパク質を取り除きます。 10,000 × gで1分間のサンプルをスピン1ミリリットルTEGバッファーと一度10mMのHEPES緩衝液(pH7.4)を1mlで1回洗浄。
  4. 圧着P - 200ピペットチップを使用して、immunopelletを乱さないように注意しながら、回目の洗浄の終了時にすべての上清を取り除きます。

4。 GR•HSP90ヘテロ複合体を使用して分子シャペロン、補因子、ATPの再構成

  1. テクニカルノート:実験条件の無数の下準備再構成の混合物に追加のタンパク質、補因子、活性剤、または関心の阻害剤を含むことによってテストすることができます。再構成の混合物の合計量は、<120μLにする必要があります。
  2. 各塩除去immunopelletはステップ3で準備したに、分子シャペロンのソースとATP生成システム(10mMのHEPES、50mMのATP、250mMのクレアチンリン酸、20mMの酢酸マグネシウムを5μlの50μlを含む再構成混合物を追加する、100 U / mlのクレアチンホスホキナーゼ、pH7.4)に。
    1. 再構成反応は50μlのHKD緩衝液(10mM HEPES、100mMのKCl、5mMジチオスレイトール(DTT)、pH7.4)およびATP生成システムの追加の5μlを持つ再構成の混合物を補うことで増加させることができる。十分な再構成やステロイド結合が観察されている場合、このステップを省略してもよい。塩化カリウムは、HSP70のATPase活性を増加させ、DTTは酸化9からシステイン含有タンパク質を保護します。
    2. 推奨される分子シャペロンのソースは、市販のウサギ網状赤血球ライセートです。個々の分子シャペロンは、網状赤血球ライセートから精製または組換え発現(例えば、15μgのHSP90、HSP7015μgを、0.6μgのホップ、6μgのP23、および0.125香港ドルバッファでμgのHSP40)を使用してもよい。
  3. 正確に20分間30℃の水浴でサンプルをインキュベートする。ごとに1〜2分は軽くペレットを乱さないと再構成の溶液を混合するためにチューブをフリック。
  4. 1ミリリットルTEGMバッファ、渦、そして1分間10,000 × gで遠心分離を追加。上清を除去し、ペレットを乱さないように注意して捨てます。 3回の洗浄の合計に対して、この手順を繰り返します。完全に圧着P - 200ピペットチップを使用して、最終的な洗浄の終了時にすべての上清を取り除く。

5。再構成タンパク質の複合体とリガンド結合活性の解析

  1. 再構成されたimmunopelletのタンパク質は、従来の変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS - PAGE)、マイクロ流体電気泳動(例えばBio - Rad社Experion)、およびウェスタンブロット法( 図3)によって識別することができます。テクニカルノート:SDS - PAGE 1516をウェスタンブロッティングを記述する優れたプロトコルは、現在他の研究者のご好意可能です。
    1. β-メルカプトエタノールと渦を含むSDS - PAGEサンプルバッファー50μlを添加します。特定のサンプルバッファーのレシピは変わる。採用される電気システムの製造業者の勧告に基づいていずれかを選択します。
    2. 沸騰水浴または100℃電子ヒートブロックで5分間インキュベートする。
    3. 1分間、10,000 × gで遠心する。 immunoadsorbing抗体、GR、そしてGRに複合タンパク質は互いに解離させ、サンプルバッファの上清中に放出されます。
    4. 圧着先端P - 200ピペットチップを使用して新しい微量遠心チューブに上清を移す。ペレットを捨てる。サンプルは、現在市販のSDS - PAGEまたはマイクロ流体電気泳動システムを使用して分析用に準備されています。どちらの方法fを完了メーカーの指示をollowing。
    5. SDS - PAGE後のウエスタンブロット分析は、immunoadsorbed GRと再構成のインキュベーション後のGRと複合分子シャペロンの決定的な同定が可能になります。 GR•HSP90タンパク質複合体の主要なコンポーネントを検出するモノクローナル一次GR(BuGR2)、HSP90(AC88)に対する抗体、HSP70(N27F3 - 4)と共同でシャペロンタンパク質を使用してください。
  2. GR•HSP90タンパク質複合体の塩ストリッピングGRに続く再構成の機能的活性化は、[3 H]を使用してステロイド結合活性を測定するステロイド(図4)で識別できます。プロトコルの残りの部分については、安全にトリチウムサンプルと廃棄物を処理するために必要な予防措置に従ってください。
    1. 再構成されたimmunopelletに、47.5μlのHEMのバッファと2μMの2.5μlの[3 H]デキサメタゾン(最後のステロイド濃度= 100 nM)を追加します。
    2. 静かにマイクロチューブの壁に変位サンプルの量を最小限に抑えるように注意してペレットを混ぜる。
    3. 氷上で一晩インキュベートする。それは、このインキュベーション中にサンプルチューブを回転させたり、混合する必要はありません。
    4. 1mlのTEGMのバッファを追加し、穏やかに混合し、1分間10,000 × gで遠心。を念頭に置き、上清を捨てることは、バインドされていない[3 H]ステロイドが含まれています。 TEGMバッファーで3回洗浄の合計に対して、この手順を繰り返します。
    5. 完全に圧着P - 200ピペットチップを使用して、最終的な洗浄の終了時にすべての上清を取り除く。ペレットは、GR、GRと複合Hsp90および他の分子シャペロン、および[3 H]ステロイド、特に受容体に結合が含まれています。非特異的結合は、一晩インキュベーション混合物中の1000倍過剰の非トリチウムデキサメタゾンを含むことによって計算することができます。別のネガティブコントロールとして、ステップ2.2で追加された抗GR immunoadsorbing抗体は、非GR - immunoadsorbing抗体(NI)に置き換えてもよい。
    6. 200μlのTEGMバッファとカットP - 200ピペットチップを使用して、10mlのシンチレーションバイアルへの転送で洗浄immunopelletsを一時停止します。
    7. バイアルおよび渦は4.8 mlのシンチレーションカクテルを添加。
    8. [3 H]再構成されたGRへのステロイド結合の量は、•HSP90蛋白質複合体は、液体シンチレーションスペクトロメトリーを用いてアッセイすることができます。

6。代表的な結果:

代表的なSDS - PAGEおよびウェスタンブロットのデータを図3に示されている。内因性のGRは•Hsp90のヘテロ複合体は抗GR抗体とGRとの共同immunoadsorbは、クマシー染色した(図3A)により可視化していること、個々のタンパク質を用いて細胞質ゾルからimmunoadsorbedている。再構成分析の任意のステップでimmunopelletの任意のコンポーネントのタンパク質の同一性の確認は、目的のタンパク質に対して惹起モノクローナル抗体を用いた分子量およびウェスタンブロッティングのSDS - PAGEの計算によって行うことができます。

再構成されたGRは•HSP90 heterocomplexesはExperionマイクロ流体電気泳動のデータ(図3Cおよび3D)とウェスタンブロット解析(図3B)を用いて提示されています。 GR免疫吸着の特異性は、非免疫抗体(図3C、NIのIgGレーン)でimmunoadsorbing抗GR抗体を置き換えることによって確認されている。非免疫抗体の過剰な量が使用されている場合でも、何GRまたは分子シャペロンを免疫沈降されていない(図3C、GR、HSP90、との観測バンドの欠如による抗GR免疫吸着レーンに存在するHSP70蛋白質のバンドで参照のことNI IgGのレーン)。同様に、それは取り除かれ、再構成されたimmunopelletsのウェスタンブロット解析による塩ストリッピングGR(図3B)からHSP90の解離および他のシャペロンタンパク質を確認することができる。 immunoadsorbing抗体の重鎖(HC)は、クーマシー染色およびウェスタンブロッティングの両方によって検出され、そしてそれは各レーンで視覚化されている同じサイズのimmunopelletsを確認するためのものです。

immunoadsorbed GRのステロイド結合活性は試験した全ての条件にすることによってアッセイすることができ、代表的なステロイド結合データを図4に示す。内因性のGRは•HSP90 heterocomplexesはimmunoadsorbed、塩除去、および再構成されています。網状赤血球溶解物または精製タンパク質、再構成されたGRのステロイド結合活性のいずれかを使用して•Hsp90のヘテロ複合体は、一般的に内因性のGRの百分の75から100に•Hsp90の結合活性のレベルを返します。電気泳動データと同様に、非免疫抗体(NI)はネガティブコントロールとして機能するために、非特異的[3 H]ステロイド結合の尺度として抗GR抗体(I)の代わりに使用することができます。

図1
図1。GR•Hsp90のヘテロ複合体のアセンブリおよびGRステロイド結合クレフト開口部のモデル。 hsp90/hsp70-basedシャペロンの機械は、次式からGRのリガンド結合ドメインに変換クレフトステロイド結合が閉じられており、(複素環ステロイドのアイコンで示される)でアクセスできるオープンな裂け目コンフォメーションへのホルモンからアクセスされていないDEDコンフォメーション。シャペロンの機械は、セル内にあらかじめ組み込まれていますし、HSP90を精製するときに自発的に形成することになる、HSP70、とホップは、溶液(反応1)で混合されています。ホップは、34アミノ酸テトラトリコペプチド反復配列(TPR)ドメインを(暗い三日月のように示される)が含まれており、後でTPRドメイン含有イムノフィリンの蛋白質でヘテロ複合体の成熟過程中に置換されます。機械は、ホップとHSP70とHSP40、最終的にはほとんどがままにした後、ATP -およびK +依存的に裂け目ステロイド結合を開き、複雑な(破線アイコンとして示される)。機構的に、HSP70は、HSP90の受容体とそれに続く裂開口部をHSP90する前にGRと相互作用し、素数。 HSP90とHSP70が同時に存在する場合、実験的に、ステロイド結合とGR裂開口が増加している。ヘテロ複合体はATP -結合配座のHsp90を維持するHSP90コシャペロンP23、のエントリによって安定化される。ホップの終了後は、高分子量イムノフィリン(IMM)は、それが細胞から回収される最終的なヘテロ複合体を形成し、HSP90が結合することができる。プラットとトフト1から適応。

図2
図2。このプロトコルのステップ2-5の模式図。 GRは、プロテインA -セファロースのペレットにバインドされたGR(FiGR)に対して生じたモノクローナル抗体を用いて細胞質ゾルからimmunoadsorbedている。 Hsp90および内因性のGRに存在する他のシャペロンタンパク質•HSP90ヘテロ複合体は、GRと共同immunoadsorbed、およびGRはステロイドに結合することができますされています。 Hsp90は(STR)塩 - ストリッピングと呼ばれるマイルドな塩処理を使用して、GRから解離する。塩ストリッピングGR裂ステロイド結合は、ステロイドに結合できなくなるため、クローズします。結合ステロイドが可能な中間GR•HSP90 HSP70含むheterocomplexes、HSP40、とホップは、、蛋白質または網状赤血球ライセート(Reticライセート)や補因子を精製した塩、最低限のGRをインキュベートすることにより、(偵察)再構成することができる。各ステップのステロイド結合活性とimmunopelletのタンパク質含有量は、一晩で識別することができる[3 H]ステロイドインキュベーションとウェスタンブロット法、それぞれ。

図3
図3。immunoadsorbed複合体の電気泳動タンパク質分析。 、再構成されたGRのSDS - PAGE electrotransferとクマシー染色に続いて、従来の電気泳動システムを用いて画像•Hsp90のヘテロ複合体。 GR、HSP90、およびHSP70に加えて、抗体の重鎖(HC)および軽鎖(LC)が視覚化されます。分子量マーカー(kDaので表される)の移行は、左側に表示されています。 B、​​塩を取り除いたGR(STR)と再構成されたGR•HSP90ヘテロ複合体(偵察)を含むimmunopelletsのウェスタンブロット。 C、再構成されたGRの仮想ゲルExperionマイクロ流体電気泳動システムを使用して生成•Hsp90のヘテロ複合体。 (NI IgG)の非免疫と抗体をimmunoadsorbing(抗GR)免疫の二つの異なる濃度が含まれています。 NIのIgGのは、ネガティブコントロールとして機能する。マイクロ流体電気泳動のパネルBの長所の第三レーンに示すようにExperionマイクロ流体電気泳動のサンプルから得られた•HSP90ヘテロ複合体が小さいサンプルボリュームの要件、液体ハンドリングと、実行後のクリーンアップを減少、改善された定量化、および、実質的に含まれるD、再構成されたGRの電気泳動図短いサンプルが実行されます。

図4
図4。内因性のGRの免疫吸着(Enodg)、塩を取り除いたGRを(STR)に続くimmunopelletsのステロイド結合活性、およびGRを再構成•HSP90ヘテロ複合体(偵察)。モノクローナル抗- GR immunoadsorbing抗体(I)でGRをimmunoadsorbingに加えて、条件ごとに陰性対照サンプルは、非免疫グロブリン(NI)を用いて調製した。

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Discussion

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上記のアッセイは、hsp90/hsp70-basedシャペロンの機械だけでなく、GRステロイド結合のシャペロンの行動に影響を与える条件の無数をテストするために適応させることができます。それは以前に報告された方法4,8,9,17の修正であり、電気泳動技術の最近の進歩を活用し、より広い研究コミュニティにアクセスできるように設計されています。関心の追加の補助因子やタンパク質は、ステロイド結合、ヘテロ複合体タンパク質 - タンパク質相互作用、および補因子の要件への影響を観察するためにプロトコルのステップ4で説明されているGR•Hsp90のヘテロ複合体の再構成の混合物、、に追加される可能性があります。例えば、HSP90の機能上の虚血 - 再灌流の効果は、活性酸素種の濃度の増加を追加してモデル化することができます。特定の機能(例えば、アセチル化HSP90)または潜在的なHsp90阻害剤(例えば、新規のゲルダナマイシン類縁体)、精製タンパク質が決定されるステロイド結合とヘテロ複合体形成への影響​​のための順序で追加することができます。

ダウンストリームの電気泳動とは異なるアッセイ、ウェスタンブロット法、およびステロイド結合アッセイを用いてもよい。例えば、免疫沈降した多タンパク質複合体は、実質的な成功18,19とフローサイトメトリーによって分析されている。 immunoadsorbed GRは•HSP90複合体もhsp90/hsp70ヌクレオチド状態を検定や原子間力顕微鏡17を使用して視覚化することができます。 GR以外のHsp90のクライアントタンパク質は、(chaperoningチェックポイントキナーゼI(Chk1タンパク質)20など) 使用すること、そして独創的な研究は、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、およびSrc 1,13,21とこのプロトコルのバリエーションを使用して行われてきた。

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Disclosures

電気泳動の試薬を選択して、画像解析ソフトウェアは、Bio - Rad社から提供されました。

Acknowledgments

この作品は、健康補助金GM086822、希望心臓研究所基礎科学賞、そしてMJマードック公益信託の大学の科学研究開発プログラムの国民の協会によって資金を供給された。電気泳動の試薬を選択して、画像解析ソフトウェアは、寛大にBio - Rad社から提供されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sf9 insect cells Invitrogen for baculovirus expression of recombinant mouse GR
L929 cells ATCC CRL-2173 for endogenous mouse GR cytosol preparation (alternative to baculovirus expression)
FiGR hybridoma cells ATCC CRL-2173 for preparing ascites containing anti-GR monoclonal antibody (alternative to purified BuGR2 antibody)
Complete-Mini protease inhibitor, EDTA-free Roche Group 11836170001
protein A-Sepharose Sigma-Aldrich P3391
rabbit reticulocyte lysate Green Hectares (Oregon, WI) rich source of endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery
creatine phosphokinase Sigma-Aldrich C3755 for ATP-regenerating system
phosphocreatine Sigma-Aldrich P7936 for ATP-regenerating system
anti-GR mouse monoclonal antibody (BuGR2) Pierce, Thermo Scientific MA1-510 used for GR immunoadsorption and as primary antibody in western blotting
anti-hsp90 mouse monoclonal antibody (AC88) Enzo Life Sciences ADI-SPA-830 used as primary antibody in western blotting
anti-hsp70 mouse monoclonal antibody (N27F3-4) Enzo Life Sciences ADI-SPA-820 used as primary antibody in western blotting
IgG from mouse serum Sigma-Aldrich 038K7690 used as nonimmune antibody for negative control of immunoadsorption
anti-mouse IgG-peroxidase conjugate Sigma-Aldrich A4416 used as secondary antibody in western blotting
Experion microfluidic electrophoresis system Bio-Rad 7007001 alternative to conventional SDS-PAGE
[1,2,4,6,7-3H] dexamethasone PerkinElmer, Inc. NET1192001MC follow safety precautions

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References

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ステロイド受容体の生化学的再構成には、•Hsp90のタンパク質複合体とリガンド結合の再活性化
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Murphy, P. J. M., Franklin, H. R., Furukawa, N. W. Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor•Hsp90 Protein Complexes and Reactivation of Ligand Binding. J. Vis. Exp. (55), e3059, doi:10.3791/3059 (2011).More

Murphy, P. J. M., Franklin, H. R., Furukawa, N. W. Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor•Hsp90 Protein Complexes and Reactivation of Ligand Binding. J. Vis. Exp. (55), e3059, doi:10.3791/3059 (2011).

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