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Biology

Reconstituição bioquímica de receptor de esteróide • Hsp90 Complexos de Proteínas e Reativação da ligação do ligando

doi: 10.3791/3059 Published: September 21, 2011

Summary

Um

Abstract

Hsp90 é uma proteína chaperone essenciais e muito abundantes molecular que foi encontrado para regular a mais de 150 eucarióticas proteínas sinalizadoras, incluindo fatores de transcrição (por exemplo, receptores nucleares, p53) e proteínas quinases (por exemplo, Src, Raf, Akt cinase) envolvidas no ciclo celular, tumorigênese, apoptose e sinalização 1,2 múltiplos eucarióticas caminhos. Muitos desses 'cliente' proteínas para hsp90, a montagem de receptores de esteróides • hsp90 complexos é o melhor definidos (Figura 1). Nós apresentamos aqui um receptor adaptável glicocorticóides (GR) ensaio de imunoprecipitação e in vitro GR • O método de reconstituição hsp90 que pode ser facilmente utilizado para investigar a atividade hsp90 eucarióticas funcional, hsp90 mediada ligante receptor esteróide vinculativo, e os requisitos de cofactor molecular acompanhante. Por exemplo, este ensaio pode ser usado para testar hsp90 requisitos cofactor e os efeitos da adição de compostos exógenos ao processo de reconstituição.

O GR foi um sistema particularmente útil para estudar hsp90 porque o receptor deve ser ligado a hsp90 de ter uma ligação do ligante fenda aberta que é acessível a 3 de esteróides. GR, endógena unliganded está presente no citoplasma de células de mamíferos não covalentemente ligado a hsp90. Como encontrado no GR endógena • heterocomplex hsp90, a ligação do ligante GR fenda está aberto e capaz de esteróides vinculativo. Se hsp90 se dissocia do GR, ou se a sua função é inibida, o receptor é incapaz de ligar esteróides e requer a reconstituição do GR • heterocomplex hsp90 antes da atividade de ligação de esteróides é restaurado 4. GR pode ser immunoprecipitated do citosol da célula usando um anticorpo monoclonal, e proteínas como a hsp90 complexado ao GR podem ser analisadas por western blot. Actividade de ligação de esteróides do GR immunoprecipitated pode ser determinada incubando a immunopellet com [3 H] esteróides.

Experimentos anteriores mostraram hsp90 mediada abertura da ligação do ligante GR fenda requer hsp70, um segundo chaperone molecular também essencial para a viabilidade das células eucarióticas. Atividade bioquímica de hsp90 e hsp70 são catalisadas por co-chaperone Hop proteínas, hsp40 e p23 5. A acompanhante máquinas multiprotein contendo hsp90, Hop, hsp70, hsp40 e são endogenamente presentes no citoplasma de células eucarióticas, e lisado de reticulócitos fornece um acompanhante rica fonte de proteínas 6.

No método apresentado, GR é imunoadsorvido do citosol celular e despojado da máquina chaperone endógena hsp90/hsp70 usando condições sal leve. O GR-sal despojado é então incubadas com lisado de reticulócitos, ATP e K +, o que resulta na reconstituição do GR • heterocomplex hsp90 e reativação da atividade de ligação de esteróides 7. Este método pode ser utilizado para testar os efeitos de vários cofatores acompanhante, novas proteínas e inibidores experimental hsp90 ou GR, a fim de determinar a sua importância funcional no hsp90 mediada por esteróides 11/08 vinculativo.

Protocol

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1. Preparação do citosol da célula contendo GR funcional

  1. Nota técnica: Todos os buffers deve ser refrigerado e cada passo deste protocolo, incluindo centrifugação e incubação, deve ser realizada no gelo ou a 4 ° C, salvo indicação em contrário. A baixa temperatura é essencial para prevenir a degradação dos complexos GR e proteínas.
  2. Usando uma centrífuga refrigerada, obter um ~ 1-5 ml pellet de células que expressa uma alta concentração de GR funcional. Exemplos de fontes de células ricas em GR incluem o mouse fibroblastos L929 células, que expressam uma alta concentração de GR endógena, e Sf9 células que foram infectadas com o baculovírus recombinante GR (por exemplo, o baculovírus p2Bac MGR-12). Cerca de 15-20 ml de hemácias obtidos por litro de cultura de células Sf9 baculovírus. As células devem estar crescendo exponencialmente antes da colheita. Centrifugar a suspensão celular a 5.000 × g por 5 min.
  3. Lave o pellet celular três vezes com 15 ml de solução tampão de Hanks salina. Entre as lavagens, delicadamente ressuspender o sedimento, seguido por centrifugação a 5000 × g por 5 min. Após a última lavagem, remover completamente o sobrenadante.
  4. Prepare 7,5 ml de um tampão de homogeneização contendo tampão HEM (10 mM HEPES, 1 mM EDTA, 20 mM de molibdato de sódio, pH 7,4), 1 mM de flúor fenilmetilsulfonil (PMSF), e 3 comprimidos de chão Complete-Mini inibidor da protease. O PMSF e Complete-Mini comprimidos prevenir a ocorrência de proteólise durante as etapas subseqüentes. Completa-Mini comprimidos podem ser facilmente transformadas em um pó fino com um almofariz e um pilão. Adicione 1,5 volumes de tampão de homogeneização para o pellet celular.
  5. Ruptura das células por homogeneização Dounce (50 cursos) ou congelamento / descongelamento (3 ciclos) técnica. Homogeneização Dounce podem manter melhor GR endógena • hsp90 complexos de proteína e é mais rápido para ser concluído. Congelamento / descongelamento pesquisador fornece uma oportunidade para suspender o protocolo nesta etapa e continuar em um momento posterior. Homogeneização Dounce deve ser realizada com o homogeneizador em um balde de gelo para evitar a degradação de proteínas. Congelamento / descongelamento pode ser feito através do congelamento de tubo de centrífuga contendo o pellet celular homogeneização da mistura tampão com nitrogênio líquido, gelo seco, ou -20 ° C de incubação, seguido de descongelamento em banho-maria a 30 ° C.
  6. Separar os citosol GR contendo a partir da matéria ruptura das células de partículas por ultracentrifugação. Transferir o homogeneizado para tubos de ultracentrífuga duráveis, tubos de equilíbrio em massa em pares, e centrifugar a 100.000 × g por 30 minutos.
  7. Remover o citosol (sobrenadante) e armazenar a -20 ° C em 500 mL em alíquotas de 1,5 ml tubos de microcentrífuga para armazenamento de longo prazo. Para manter a atividade da GR funcional máxima, flash-congelar as alíquotas em nitrogênio líquido ou incubar por 30 segundos em um metanol banho de gelo seco antes do armazenamento. Tome cuidado para evitar o contato direto da pele com o reagente de resfriamento.

2. Imunoadsorção de GR de célula citosol

  1. Nota técnica: A Figura 2 fornece uma visão esquemática das etapas 2-5 do presente protocolo.
  2. Prepare uma mistura contendo uma imunoadsorção monoclonal anticorpos imunoglobulina G (IgG) levantadas contra o GR para immunoadsorb o receptor preparado no Passo 1. Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, combine 100 ul de descongelado GR contendo citosol, 200 mL de buffer TEGM (8 TES mM, EDTA 4 mM, 50 mM NaCl, 20 mM de molibdato, 10% (v / v) de glicerol, pH 7,6) , 100 ml de uma proteína de 20% A-Sepharose (PAS) O chorume (v / v, preparada em tampão TEGM), e 5 mg de anti-GR anticorpos IgG monoclonal (por exemplo, BuGR2). Molibdato está incluído no buffer TEGM, a fim de ajudar a estabilizar o GR-hsp90 heterocomplex, que pode ser útil para ensaio de atividade endógena de esteróides heterocomplex vinculativa 13.
    1. Anti-GR anticorpo é comercialmente disponível como proteína purificada. Alternativamente, pode ser obtida pela adição de 10 ml de ascite contendo IgG anti-GR à mistura imunoadsorção. Ascite é produzido por camundongos injetados com células anti-GR hibridoma (por exemplo, células de hibridoma FiGR 14), ea concentração de anticorpos aproximado obtido a partir de ascite e utilizado nesses experimentos foi de 0,5 mcg / mL, medido pelo ensaio de Bradford.
    2. Preparar uma amostra de controle negativo usando GR contendo citosol, buffer TEGM e PAS (como descrito acima), e 5 mg de uma IgG que não reconhece o GR, hsp90, ou outras proteínas chaperone molecular (referido como um "não imunes" anticorpo).
    3. Devido ao tamanho relativamente grande talão PAS, use um corte P-200 ponta da pipeta na transferência de PAS da polpa de 20% para tubos de amostra. Pontas de pipeta de corte são preparados por corte 2-3 mm fora da final do comercialmente disponível P-200 dicas, aumentando assim a abertura ponta da pipeta.
  3. Colocar as amostras em uma roda girando verticais e incubar por um mínimo de duas horas com rotação constante. As amostras podemser incubado por até 8 horas sem perda de atividade.
  4. Na conclusão da incubação imunoadsorção, eliminar as proteínas desvinculado do pellet-anticorpo PAS ("immunopellet") por centrifugação. Separar os sobrenadantes de immunopellets por centrifugação utilizando uma centrífuga refrigerada programado para 1 minuto a 10.000 × g, e depois lave duas vezes com 1 ml de buffer TEGM e vortex. Após centrifugação e entre lavagens, desprezar o sobrenadante ser cauteloso para não perturbar o sedimento.
    1. Remova todas as sobrenadante na conclusão da segunda lavagem. A fim de garantir que nenhum dos pellet é aspirado inadvertidamente, use um frisado P-200 ponta da pipeta de aspiração sobrenadante final. Pontas de pipeta Crimped são preparados por achatamento comercialmente disponível P-200 dicas com a pinça.

3. Dissociação da hsp90 endógena de GR immunopellet ("Salt stripping")

  1. Ao immunopellet lavados preparada no passo 2, adicione 355 mL TEG buffer (buffer sem TEGM molibdato de sódio) e 45 mL de 5 M NaCl (NaCl concentração final = 0,5 M).
  2. Colocar as amostras em uma roda girando verticais e incubar por 1,5 horas com rotação constante. As amostras podem ser incubados por até 2 horas, no entanto, incubações mais pode levar à recuperação de proteína reduzida e menor atividade funcional.
  3. Eliminar as proteínas desvinculado do immunopellet por centrifugação. Spin-amostras por 1 minuto a 10.000 × g. Lavar uma vez com um buffer de TEG ml e uma vez com 1 ml de 10 mM tampão HEPES, pH 7.4.
  4. Remova todas as sobrenadante na conclusão da segunda lavagem, tomando cuidado para não perturbar o immunopellet, usando um P-200 crespo ponta da pipeta.

4. Reconstituição do GR • heterocomplex hsp90 usando chaperones moleculares, cofatores e ATP

  1. Nota técnica: A miríade de condições experimentais pode ser testada através da inclusão de proteínas adicionais, cofatores, ativadores ou inibidores de interesse para a mistura de reconstituição preparado abaixo. Volume total de misturas de reconstituição deve ser <120 mL.
  2. A cada sal despojado immunopellet preparada na Etapa 3, adicionar uma mistura contendo 50 ul de reconstituição de uma fonte de chaperone molecular, 5 l de um sistema de geração de ATP (10 HEPES mM, 50 mM ATP, 250 mM fosfato de creatina, 20 mM de acetato de magnésio , 100 creatinafosfoquinase U / ml, pH 7,4).
    1. Reações a reconstituição pode ser aumentada, completando a mistura reconstituição com 50 ul HKD tampão (10 mM HEPES, 100 mM KCl, 5 mM ditiotreitol (DTT), pH 7,4) e um adicional de 5 mL da ATP de geração do sistema. Este passo pode ser omitido se a reconstituição ampla e obrigatória esteróides são observados. KCl aumenta a atividade ATPase hsp70 e TDT protege-cisteína contendo proteínas da oxidação 9.
    2. Uma fonte de chaperone molecular é recomendado lisado de reticulócitos de coelho disponíveis comercialmente. Individuais chaperones moleculares purificada a partir de lisado de reticulócitos ou recombinante expressa (por exemplo, 15 mg hsp90, 15 mg hsp70, 0,6 mg Hop, 6 mcg p23, e 0,125 mg hsp40 em HKD buffer) também pode ser usado.
  3. Incubar as amostras em banho-maria a 30 ° C por exatamente 20 minutos. Tubos de filme a cada 1-2 minutos, a fim de perturbar o pellet delicadamente e misturar a solução de reconstituição.
  4. Adicionar 1 ml TEGM buffer, vortex, e centrifugar a 10.000 × g por 1 minuto. Remover o sobrenadante e descartar tomando cuidado para não perturbar o sedimento. Repita a operação para um total de três lavagens. Remover completamente todos os sobrenadante na conclusão da lavagem final com um frisado P-200 ponta da pipeta.

5. Análise dos complexos de proteína reconstituída e atividade ligante de ligação

  1. Proteínas no immunopellet reconstituído podem ser identificados por eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante convencional (SDS-PAGE), eletroforese microfluídicos (por exemplo, Bio-Rad Experion), e western blot (Fig. 3). Nota técnica: Excelente protocolos descrevendo SDS-PAGE 15 e western blotting 16 estão atualmente disponíveis, cortesia de outros investigadores.
    1. Adicionar 50 ul de SDS-PAGE tampão de amostra contendo β-mercaptoetanol e vortex. Receitas buffer específico amostra variar. Selecione um com base na recomendação do fabricante do sistema de eletroforese a ser empregada.
    2. Incubar por 5 minutos em um banho de água fervente ou 100 ° C bloco de aquecimento eletrônico.
    3. Centrifugar a 10.000 × g por 1 minuto. O anticorpo immunoadsorbing, GR, e proteínas complexada com o GR vai ser dissociadas uma da outra e liberados no sobrenadante tampão de amostra.
    4. Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga fresco utilizando uma ponta dobrada ponta P-200 pipeta. Descartar o pellet. A amostra está agora preparado para análise usando comercialmente disponíveis SDS-PAGE ou sistemas microfluídicos de eletroforese. Completa ou f técnicaepois instruções do fabricante.
    5. Ocidental blot seguintes SDS-PAGE permite a identificação definitiva do GR imunoadsorvido e chaperones moleculares complexado ao GR após a incubação a reconstituição. Use anticorpos monoclonais primários levantadas contra GR (BuGR2), hsp90 (AC88), hsp70 (N27F3-4) e co-chaperone proteínas para detectar os principais componentes da GR • complexo de proteína hsp90.
  2. Ativação funcional do GR-sal despojado após a reconstituição do GR • complexo de proteínas hsp90 podem ser identificados mediante a análise de actividade de ligação de esteróides utilizando a [3 H] esteróides (Fig. 4). Para o restante do protocolo, siga as precauções necessárias para manusear amostras tritiada e resíduos.
    1. Ao immunopellet reconstituído, adicionar 47,5 mL de buffer HEM e 2,5 mL de 2 M [3 H] dexametasona (concentração final de esteróides = 100 nM).
    2. Delicadamente misture o pellet tendo o cuidado de minimizar a quantidade de amostra deslocado para a parede do tubo de microcentrífuga.
    3. Incubar overnight no gelo. Não é necessário para rodar ou misturar os tubos de amostra durante a incubação.
    4. Adicionar um tampão TEGM ml, misture delicadamente, e centrifugar a 10.000 × g por 1 minuto. Desprezar o sobrenadante, lembrando que ele contém não ligados [3 H] esteróides. Repita a operação para um total de 3 lavagens com tampão TEGM.
    5. Remover completamente todos os sobrenadante na conclusão da lavagem final com um frisado P-200 ponta da pipeta. O pellet contém GR, hsp90 e outros chaperones moleculares complexado ao GR, e [3 H] esteróides, especificamente ligada ao receptor. Ligação não específica pode ser calculada através da inclusão de 1.000 vezes a dexametasona não-tritiada em excesso na mistura de incubação durante a noite. Como um controle alternativo negativo, o anticorpo anti-GR immunoadsorbing adicionado no Passo 2.2 poderá ser substituído por um não-GR-immunoadsorbing anticorpos (NI).
    6. Suspender a immunopellets lavados em 200 mL de buffer TEGM e transferência para frascos de 10 ml de cintilação usando um corte P-200 ponta da pipeta.
    7. Adicionar 4,8 ml de coquetel de cintilação os frascos e vortex.
    8. A quantidade de [3 H] vinculativo esteróides para o GR reconstituído • complexo de proteínas hsp90 podem ser analisadas por espectrometria de cintilação líquida.

6. Resultados representativos:

Representante SDS-PAGE e Western blot dados são apresentados na Figura 3. O GR endógena • heterocomplex hsp90 é imunoadsorvido do citosol de células utilizando anti GR-anticorpos e proteínas individuais que co-immunoadsorb com o GR são visualizados através da coloração Coomassie (Fig. 3A). Confirmação da identidade de proteína de qualquer componente do immunopellet em qualquer etapa do ensaio de reconstituição pode ser feita por SDS-PAGE cálculo do peso molecular e mata-borrão ocidental utilizando anticorpos monoclonais levantadas contra a proteína de interesse.

GR reconstituído • hsp90 heterocomplexes são apresentados usando dados Experion microfluídicos de eletroforese (Fig. 3C e 3D) e ocidental blot (Fig. 3B). A especificidade do imunoadsorção GR é confirmado através da substituição do immunoadsorbing anticorpo anti-GR com um anticorpo não imunes (Fig. 3C, pistas NI IgG). Mesmo quando quantidades excessivas de anticorpos não imunes são usados, não chaperones moleculares são GR ou immunoprecipitated (cf. na fig. 3C, a GR, hsp90, hsp70 e bandas de proteínas presentes nas pistas anti-GR imunoadsorção com a falta de banda observado no pistas NI IgG). Da mesma forma, é possível confirmar a dissociação de hsp90 e proteínas chaperone outra do GR-sal retirado por western blot (Fig. 3B) do immunopellets despojado e reconstituído. A cadeia pesada do anticorpo immunoadsorbing (HC) é detectável por ambos Coomassie mancha e western blotting, e serve para confirmar igual immunopellets porte estão sendo visualizados em cada pista.

Actividade de ligação de esteróides do GR imunoadsorvido podem ser analisadas por para todas as condições testadas, e representante de esteróides de ligação de dados são apresentados na Figura 4. GR endógena • hsp90 heterocomplexes são imunoadsorvido, sal-despojado, e reconstituído. Usando lisado de reticulócitos ou proteínas purificadas, a atividade de ligação de esteróides do GR reconstituído • heterocomplex hsp90 normalmente retorna para 75-100% da GR endógena • hsp90 nível de atividade obrigatória. Similar aos dados de eletroforese, um anticorpo não imunes (NI) pode ser usado no lugar do anticorpo anti-GR (I), a fim de servir como controle negativo e como uma medida de inespecífica [3 H] ligação de esteróides.

Figura 1
Figura 1. Modelo de GR montagem heterocomplex • hsp90 e abertura de ligação ao GR esteróides palatina. O maquinário chaperone hsp90/hsp70-based converte o domínio ligante GR de ligação de uma folded conformação em que a ligação de esteróides fenda está fechada e não acessíveis ao hormônio para uma conformação aberta fenda que pode ser acessado (ilustrado pelo ícone heterocíclicos esteróides). O maquinário é chaperone preassembled na célula e formam espontaneamente quando purificada hsp90, hsp70, e Hop são misturados em solução (reação 1). Hop contém uma repetição tetratricopeptide 34 aminoácidos (TPR) domínio (ilustrado como um crescente escuro), e depois é substituído durante o processo de maturação heterocomplex por uma proteína TPR domínio contendo imunofilina. O maquinário abre a ligação de esteróides fenda em um ATP e K + dependentes de forma, após o qual Hop e na maioria das hsp70 e hsp40 em última análise, deixar o complexo (ilustrado como um ícone tracejada). Mecanicamente, hsp70 interage com o GR antes hsp90 e apronta o receptor para hsp90 e abertura da fenda subseqüentes. Experimentalmente, a ligação de esteróides e abertura GR fenda são aumentadas se hsp90 e hsp70 estão simultaneamente presentes. O heterocomplex é estabilizado pela entrada da hsp90 p23 co-chaperone, que mantém hsp90 em uma conformação ATP-bound. Após a saída de Hop, um alto peso molecular imunofilina (IMM) pode ligar hsp90, formando a heterocomplex final como é recuperado a partir de células. Adaptado de Pratt e Toft 1.

Figura 2
Figura 2. Representação esquemática das etapas 2-5 do presente protocolo. A GR é imunoadsorvido do citosol da célula usando um anticorpo monoclonal levantadas contra o GR (FiGR) vinculado a um pellet de proteína A-Sepharose. Hsp90 e de proteínas chaperone outros presentes na GR endógena • heterocomplex hsp90 são co-imunoadsorvido com o GR, eo GR é capaz de se ligar a esteróides. Hsp90 é dissociada do GR através de um tratamento leve de sal, conhecido como sal-stripping (STR). A ligação de esteróides fenda da sal-despojado GR fecha, tornando-o incapaz de se ligar a esteróides. Intermediária GR • hsp90 heterocomplexes contendo hsp70, hsp40, e Hop, que são capazes de esteróides vinculativo, pode ser reconstituída (Recon), incubando-sal despojado GR com proteínas purificadas ou lisado de reticulócitos (Retic lisado) e cofatores. A atividade de esteróides vinculativo e immunopellet teor de proteína de cada etapa podem ser identificados por dia para o outro [3 H] de incubação de esteróides e mata-borrão ocidental, respectivamente.

Figura 3
Figura 3. Electrophoretic análise de proteínas de complexos imunoadsorvido. A, SDS-PAGE de GR reconstituído • heterocomplex hsp90 fotografada usando sistema de eletroforese convencional seguido por electrotransfer e coloração Coomassie. Além de GR, hsp90, hsp70 e, a cadeia pesada (HC) e cadeia leve (LC) dos anticorpos são visualizados. Migração de marcadores de peso molecular (expressa em kDa) são indicados à esquerda. B, Western blot de immunopellets contendo sal despojado GR (Str) e GR reconstituído • heterocomplex hsp90 (Recon). C, gel virtual de GR reconstituído • heterocomplex hsp90 gerado usando um sistema de eletroforese Experion microfluídicos. Duas concentrações diferentes de um não imunes (NI IgG) e imune (anti-GR) immunoadsorbing anticorpos estão incluídos. IgGs NI servir como controles negativos. D, electroferograma de GR reconstituído • heterocomplex hsp90 obtidos Experion amostra eletroforese microfluídicos mostrado na terceira faixa de Vantagens painel B. microfluídicos de eletroforese incluem a exigência de volumes menores de amostra, diminuiu para manipulação de líquidos e pós-run de limpeza, quantificação melhorada, e substancialmente menor amostra é executado.

Figura 4
Figura 4. Actividade de ligação de esteróides immunopellets seguintes imunoadsorção de GR endógenos (Enodg), sal-despojado GR (For), e reconstituído GR • heterocomplex hsp90 (Recon). Além immunoadsorbing o GR com um anticorpo monoclonal anti-GR immunoadsorbing (I), amostras de controlo negativo para cada condição foram preparadas utilizando uma imunoglobulina não imunes (NI).

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Discussion

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O ensaio descrito acima pode ser adaptado para testar uma miríade de condições que afetam as ações chaperone da máquina chaperone hsp90/hsp70-based bem como GR ligação de esteróides. É uma modificação dos métodos previamente relatado 4,8,9,17 e é projetado para tirar vantagem dos avanços recentes em tecnologia de eletroforese e ser acessível a uma comunidade mais ampla de pesquisa. Cofatores adicionais ou proteínas de interesse pode ser adicionado ao GR • hsp90 mistura reconstituição heterocomplex, descrito no Passo 4 do protocolo, a fim de observar os efeitos sobre esteróides vinculativo, heterocomplex interações proteína-proteína, e co-fator requisitos. Por exemplo, os efeitos da isquemia e reperfusão em hsp90 função pode ser modelado com a adição de concentrações crescentes de espécies reativas de oxigênio. Proteínas purificadas com um recurso específico (por exemplo hsp90 acetilada) ou potencial hsp90 inibidores (por exemplo, análogos geldanamycin novela) podem ser adicionados a fim de que seus efeitos sobre a formação de ligação e heterocomplex esteróide a ser determinado.

A jusante ensaios diferentes eletroforese, western blotting e ensaios de ligação de esteróides também podem ser empregadas. Por exemplo, complexos multiprotein immunoprecipitated foram analisados ​​por citometria de fluxo com sucesso substancial 18,19. O GR imunoadsorvido • hsp90 complexos também podem ser analisadas para o estado de nucleotídeos hsp90/hsp70 ou visualizados através de microscopia de força atômica 17. Hsp90 proteínas de outros clientes que o GR pode ser usado (por exemplo, chaperoning checkpoint kinase I (Chk1) 20), e pesquisa seminal foi realizado utilizando variações deste protocolo com o receptor de estrogênio, receptor de progesterona, e Src 1,13,21.

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Disclosures

Selecione reagentes eletroforese e software de análise de imagem foram fornecidos pela Bio-Rad.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health conceder GM086822, Coração Esperança Instituto Básico de Ciências prêmio, eo MJ Murdock Charitable Confiança Colégio Programa de Pesquisa em Ciências. Selecione reagentes eletroforese e software de análise de imagem foram generosamente fornecidos pela Bio-Rad.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sf9 insect cells Invitrogen for baculovirus expression of recombinant mouse GR
L929 cells ATCC CRL-2173 for endogenous mouse GR cytosol preparation (alternative to baculovirus expression)
FiGR hybridoma cells ATCC CRL-2173 for preparing ascites containing anti-GR monoclonal antibody (alternative to purified BuGR2 antibody)
Complete-Mini protease inhibitor, EDTA-free Roche Group 11836170001
protein A-Sepharose Sigma-Aldrich P3391
rabbit reticulocyte lysate Green Hectares (Oregon, WI) rich source of endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery
creatine phosphokinase Sigma-Aldrich C3755 for ATP-regenerating system
phosphocreatine Sigma-Aldrich P7936 for ATP-regenerating system
anti-GR mouse monoclonal antibody (BuGR2) Pierce, Thermo Scientific MA1-510 used for GR immunoadsorption and as primary antibody in western blotting
anti-hsp90 mouse monoclonal antibody (AC88) Enzo Life Sciences ADI-SPA-830 used as primary antibody in western blotting
anti-hsp70 mouse monoclonal antibody (N27F3-4) Enzo Life Sciences ADI-SPA-820 used as primary antibody in western blotting
IgG from mouse serum Sigma-Aldrich 038K7690 used as nonimmune antibody for negative control of immunoadsorption
anti-mouse IgG-peroxidase conjugate Sigma-Aldrich A4416 used as secondary antibody in western blotting
Experion microfluidic electrophoresis system Bio-Rad 7007001 alternative to conventional SDS-PAGE
[1,2,4,6,7-3H] dexamethasone PerkinElmer, Inc. NET1192001MC follow safety precautions

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References

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Reconstituição bioquímica de receptor de esteróide • Hsp90 Complexos de Proteínas e Reativação da ligação do ligando
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Murphy, P. J. M., Franklin, H. R., Furukawa, N. W. Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor•Hsp90 Protein Complexes and Reactivation of Ligand Binding. J. Vis. Exp. (55), e3059, doi:10.3791/3059 (2011).More

Murphy, P. J. M., Franklin, H. R., Furukawa, N. W. Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor•Hsp90 Protein Complexes and Reactivation of Ligand Binding. J. Vis. Exp. (55), e3059, doi:10.3791/3059 (2011).

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