Summary
En automatisert metode for å identifisere egnede hydrofobe interaksjoner kromatografi (HIC) media som skal brukes i prosessen med proteinrensing presenteres. Metoden utnytter et middels trykk væskekromatografi system inkludert automatisert buffer blending, dynamisk prøve sløyfe injeksjon, sekvensiell kolonne valg, multi-bølgelengde analyse, og split brøkdel eluatet samling.
Abstract
I motsetning til andre kromatografiske metoder for rensing av proteiner (f.eks gel filtrering, slektskap, og ionebytting), krever hydrofob interaksjon kromatografi (HIC) vanligvis eksperimentell bestemmelse (referert til som screening eller "speiding") for å velge den mest egnede kromatografiske medium for rensing av en gitt protein 1. Metoden som presenteres her beskriver en automatisert tilnærming til speiding for et optimalt Hic medier skal brukes i protein rensing.
HIC skiller proteiner og andre biomolekyler fra en rå lysate basert på forskjeller i hydrofobisitet. I likhet med affinitet kromatografi (AC) og ionebytting kromatografi (IEX), er HIC stand til å konsentrere protein av interesse som det skrider frem gjennom kromatografisk prosess. Proteiner best egnet for rensing av HIC omfatter de med hydrofob overflate regioner og i stand til å tåle eksponering til salt konsentrasjoner i overkant av 2 M ammunisjonnium sulfat ((NH 4) 2 SO 4). HIC blir ofte valgt som en metode for rensing for proteiner som mangler en affinitet tag, og dermed uegnet for AC, og når IEX unnlater å gi tilstrekkelig rensing. Hydrofobe moieties på protein overflaten midlertidig binde seg til en polare ligand koblet til en inert, immobile matrise. Samspillet mellom protein og ligand er svært avhengig av salt konsentrasjonen av buffer strømmer gjennom kromatografi kolonnen, med høye ioniske konsentrasjoner styrking protein-ligand samhandling og gjøre protein immobile (dvs. bundet inne i kolonne) 2. Som salt konsentrasjoner nedgang, protein-ligand interaksjon forsvinner, proteinet blir igjen mobil og elutes fra kolonnen. Flere Hic media er kommersielt tilgjengelig i pre-pakkede kolonner som hver inneholder en av flere hydrofobe ligander (f.eks S-butyl, butyl, octyl, og fenyl) krysskoblet ved varierende tettheter til agarose perler av en specific diameter tre. Automatisert kolonne speiding gir en effektiv tilnærming for å bestemme hvilke Hic medier bør benyttes for fremtidige, mer uttømmende optimalisering eksperimenter og proteinrensing kjører fire.
Den spesifikke protein blir renset her er rekombinant grønt fluorescerende protein (GFP), men kan tilnærmingen være tilrettelagt for rensing av andre proteiner med en eller flere hydrofobe overflaten regioner. GFP fungerer som en nyttig modell protein, på grunn av sin stabilitet, unike lys absorbans topp på 397 nm, og fluorescens når det utsettes for UV-lys 5. Bakteriell lysate inneholder villtype GFP ble utarbeidet i en høy-salt buffer, lastet inn en Bio-Rad DuoFlow middels trykk væskekromatografi system, og adsorbert til HiTrap Hic kolonner som inneholder ulike Hic medier. Proteinet ble elueres fra kolonnene og analyseres av in-line og post-styrte deteksjonsmetoder. Buffer blending, dynamisk prøve sløyfe injeksjon, sekvensiell colUMN valg, multi-bølgelengde analyse, og split brøkdel eluatet samling økte funksjonaliteten i systemet og reproduserbarheten til eksperimentell tilnærming.
Protocol
1. Buffer og Prøvepreparering
- Teknisk merknad: Alle buffere skal være nedkjølt og hvert trinn av denne protokollen skal utføres på is eller ved 4 ° C, med mindre annet er nevnt. Den lave temperaturen er avgjørende for å hindre nedbrytning av protein for å bli renset og for å sikre optimale driftsforhold. Hic media kan gi ulike atskillelse skyldes hvis operert ved romtemperatur, og kromatografi system skal drives i en 4 ° C kaldt rom eller kald boks.
- Forbered 500 ml av følgende buffere: 200 mm NaH 2 PO 4 (Buffer A1), 200 mm Na 2 HPO 4, (Buffer A2), og 4,8 M (NH 4) 2 SO 4 (Buffer B2). Avionisert vann (Buffer B1) vil også bli brukt. Degas buffer for å sikre optimale kromatografiske driftsforhold. Systemet MAXIMIZER vil blande sammen Buffers A1 og A2 for å generere en lav-salt fosfat eluering buffer, og det vil blande buffere B1 og B2å generere høy salt ammoniumsulfat start buffer (2,4 M (NH 4) 2 SO 4).
- Forbered 20 ml av prøven som skal lastes ved å blande 10 ml celle lysate inneholder proteinet skal renses med 10 ml buffer B2. Den endelige ammoniumsulfat konsentrasjon av cellen lysate prøveløsningen skal være omtrent 2,4 M (NH 4) 2 SO 4, slik at det tilsvarer omtrent starten buffer. Cell lysate kan tilberedes ved resuspending bakteriecellen pellet i TE buffer (10 mM Tris 1 mM EDTA, 8,0 pH) etterfulgt av sonikator eller tilsetning av 1 mg / ml lysozyme og sentrifugering på 3700 × g i 10 minutter.
- Filtrer lysate-buffer blandingen gjennom en lav proteinbinding 0,45 mikrometer sprøyte filter for å fjerne svevestøv fra løsningen. Hold prøven på is inntil den er klar til å bli lastet inn i systemet.
2. Fysisk Oppsett og Rørleggertjenester av DuoFlow Kromatografi System
- Sørg for all enhet makt og kommunikasjon tilkoblinger er gjort. Enheter skal være synlig i Biologisk DuoFlow kromatografi programvaren manuell kontroll vinduet. En oppsummering av enhetene står i Tabell 1. En illustrasjon av systemet og avløp diagram er i figur 2.
- Fest elektriske tilkoblinger for ventiler til pumpen arbeidsstasjonen og system Maximizer porter slik at havnen Nummereringen følger en logisk rekkefølge. Label hver ventil med sitt respektive portnummer for fremtidig referanse. Pumpen arbeidsstasjonen og system MAXIMIZER tjene som de viktigste kommunikasjons-forbindelser mellom datamaskinen / kontrolleren og kromatografi system. Ventiler blir automatisk gjenkjent og vises i programvaren når den er koblet til enten enhet.
- Teknisk merknad: Når du bruker kromatografi system i manuell modus, ventiler styres uavhengig av hverandre. Vær nøye med å kontrollere at ønsket strømningsbanen er konfigurert, spesielt når du bytter ventiler, før oppstart buffER flyt.
- Senk Teflon slangen inn buffere A1, A2, B1, og B2. Sørg for tilstrekkelig volum av buffer er tilgjengelig for hele protokollen, og at slangen vil fortsette å være under vann. Forbereder 500 ml av buffere A1, A2, og B2 og en L av bufferen B1 vil være tilstrekkelig.
- Plumbo prøven lasting ventil og dynamisk prøve sløyfe som illustrert i figur 2 og per produsentens anvisninger. Koble prøven loop til prøven ventilen innløpet (Posisjon 3) med den minste lengden på slangen mulig. Dette vil minimere prøvefortynning under prøven belastning prosessen.
- Minimer slangelengde mellom prøven, prøven lasting pumpe, og prøve lasting ventil innløp (posisjon 2). Dette vil redusere mengden av prøven nødvendig å laste prøven loop.
- Forbered 8 identisk par av 1/16 "OD PEEK tubing, med hvert par knyttes sammen med en 1/4-28 female-to-1/4-28 kvinnelig fagforening. Koble parene til posisjoner 1-8 av de to kolonne utvalg ventiler. De syv tillitsvalgteer koblet i serie til kolonne valg ventil Posisjoner 2-8 vil senere bli erstattet av kromatografi kolonner som skal testes. Unionen knyttet inline med Posisjon 1 vil bli opprettholdt som et kromatografi kolonne bypass.
- Teknisk merknad: Sørg for hvert par av slangen er koblet til samme stilling på begge kolonne utvalg ventiler.
- Slå på både 4-bølgelengde UV / Vis Detektor (QuadTec) lampe og fast bølgelengde 280 nm UV detektor lampe. De bølgelengdene som skal måles ved QuadTec for denne protokollen omfatter 214 nm, 280 nm og 397 nm. Måling 280 nm med både fast bølgelengde UV detektor og QuadTec gir redundans og sikrer data gyldighet.
- Bekreft alle detektorene er kalibrert i henhold til produsentens instruksjoner. Kontrollventilen er nødvendig for å redusere luft boble akkumulering i detektorer og bør installeres ned-stream av detektorene, men opp-stream av pH skjermen.
- Systemet som presenteres her inkluderer to fraction samlere, noe som gir betydelig enklere for post-run eluatet analyse. Fest denne andelen samlere, strøm splitter ventil, og splitter kontrolleren som vist i Figur 2. Fraksjonen samleren knyttet til posisjon 1 av kløyver ventilen vil samle 900 mL eluatet fraksjoner i 12 ml kultur rør, mens andelen samleren koblet til posisjon 2 vil samle 100 mL eluatet fraksjoner i 96 vel mikrotiterplater.
- Posisjon 2 brøkdel oppsamler, splitter ventil, og splitter controller drives aktiv i kromatografi arbeidsstasjonen. Den splitter kontrolleren finnes innenfor en Bio-Rad Econo Gradient Pump, men er pumpen komponenten av enheten ikke brukes. En "% Split" innstilling alternativet vil bli vist på Econo Gradient Pump når splitteren ventilen er koblet til den.
- Set% Split til 10 år. Posisjon 1 brøkdel solfangeren vil samle 90% av eluatet (900 mL / fraksjon), og stillingen 2 brøkdel solfangeren vil samle10% (100 mL / fraksjon). Denne andelen samlere vil avansere i synkronisert slik at for brøk antall begge samlere å tilsvare hverandre.
- Bytt standard brøkdel samleren slipp hodet på Posisjon 2 brøkdel oppsamler med en mikroplate dråpe hode. Mikroplate slipp hodet har en mindre blenderåpning, noe som tillater innsamling av 50% mindre slipp størrelser (dvs. 25 mL stedet for standard 50 mL), og er spesielt gunstig når innsamling ≤ 500 mL fraksjoner.
- Bruke den elektroniske kontrollpanelet, angi posisjonen 2 brøkdel oppsamler å samle fraksjoner i 96-brønn plater og tid med en rate på en prøve / minutt. Den splitter kontrolleren og posisjon 2 brøkdel solfangeren vil bli startet manuelt umiddelbart etter starten av den første kromatografi løp.
- Skyll Stilling 2 brøkdel solfangeren og mikroplate slipp hodet med Buffer B1.
3. Priming System Lines, programmering Run metoden, og Equilibrating Hic Kolonner
- Med systemet Maximizer inlet linjene nedsenket i avgasset Buffers A1, A2, B1, og B2, prime arbeidsstasjonen pumper, skyll prøve loop, og skyll kromatografi system per produsentens anvisninger. Komplett grunning takt med alle 4 Maximizer system viker (A1, A2, B1, og B2) for å fjerne gjenværende luftbobler.
- Klargjøre systemet krever manuell betjening av systemet kontrolleren via Biologisk-programvaren. Bekreft korrekt plassering av prøven last ventil og kolonne valg ventiler før start buffer flyt.
- Forbered deg på å starte en manuell 1 ml / minutt flyt av eluering buffer (0% B) gjennom systemet, som beskrevet i trinn 3.4-3.5.
- I Setup vinduet på Biologisk program programvare, velg "Bruk Buffer Blending" og "fosfatbuffer med Ammonium Sulfate". Bekreft Buffers A1, A2, B1, B2 og oppført i Setup vinduet tilsvarer de forberedt.
- Manuelt sette strømningshastigheten til 1 ml / minutt eluering buffer(0% B). Observer mottrykk, konduktivitet, UV tracings, og pH forblir konsistente og innenfor normale grenser. Abnormaliteter indikere luft eller kolonne blokkering som bør rettes før du fortsetter.
- Skyll alle 8 kolonne utvalg linjer med 5 ml eluering buffer. Gjør dette ved først å stoppe flyten, setter begge kolonne valg ventilene til posisjon 2, og gjenoppta den 1 ml / minutt flyt, 0% B. Gjenta for kolonne utvalg linjer i posisjoner 3-8.
- Connect 1 ml HiTrap Hic kolonner til posisjoner 2-8 kolonnen valg ventiler. Fullfør trinnene 3.8-3.13 med en kolonne av gangen. Ta note av som HIC kolonne er plassert der utvalget ventil posisjon. En oppsummering av Hic kolonnen media egenskaper er oppført i Tabell 2.
- Den fysiske tilkoblingen av GE Healthcare HiTrap kolonner til Bio-Rad DuoFlow system krever en rekke beslag som utnytter 1/4-28, M6 og luer beslag. Fjern unionen koble Posisjon 2 kolonne utvalg ventiler. Align Bio-Rad og GE Healthcare beslag som illustrert i figur 3.
- Fest oppstrøms kolonne beslag til DuoFlow. Unngå fangst luftbobler i kolonnen eller slangen ved godt feste oppstrøms kolonnen beslag til oppstrøms utvalget ventilen montering. Kjør eluering buffer gjennom beslag til all luften er utvist og en stor dråpe buffer er til stede. Midlertidig stopp buffer flyt.
- Fjern stopperen koblet til kolonnen innløp og plasser en stor dråpe av lav-salt-buffer (0% B) på toppen av kolonnen. Fest kolonnen til oppstrøms beslag. Å ha både kolonne inntaket og innløpet montering overfylte med dråper buffer sikrer en forbindelse uten luftbobler.
- Hvis kolonnen brukes for første gang, sprette av kolonnen uttaket slutten. Fest utløpet til nedstrøms kolonnen beslag og utvalg ventil rør. Kontroller alle koblinger er tett festet.
- Sett backpressure grensen til 40 psi. Vask kolonnen wed 5 kolonnen volumer (5 kolonne volumer = 5 ml) av eluering buffer (0% B) på en strømningshastighet på 1 ml / minutt. Fortsett kolonne vask, om nødvendig, til pH, har UV tracings og mottrykk stabilisert.
- Vask kolonnen med 10 kolonnen volumer (10 ml) start buffersoner (100% B) med en strømningshastighet på 1 ml / minutt. Fortsett kolonne vask, om nødvendig, til parametre oppført i foregående trinn, samt konduktivitet har stabilisert seg.
- Den HIC kolonnen forberedt ovenfor er nå klar for prøve lasting. Når alle kolonner som skal testes er forberedt, manuelt bytte merke kolonner ventilene til Posisjon 1 (union) og stoppe buffer flyt.
4. Eksempel Loading
- Senk prøve innløpsslangen inn 20 ml prøve å starte prosessen med lasting prøve til den dynamiske prøven loop. Fra manuell innstilling vinduet på Biologisk programvare, bytter prøve sløyfe belastning / vask ventil til posisjon 1 (Utvalg) og prøven lasting ventilen å rense.
- Iverksette tiltak forprøven Loop lasting pumpe, utarbeide prøven inn i pumpen slangen med en strømningshastighet på 1 ml / minutt til umiddelbart etter prøven når prøven lasting ventilen. Dette fjerner buffer og / eller luft fra prøven lasten linjen.
- Stopp strømmen av lasting pumpen og slå prøven lasting ventilen fra Rydd å laste. Start prøven sløyfen lasting pumpen på en strømningshastighet på 1 ml / minutt til 10 ml av prøven har vært trukket inn i dynamiske prøven loop.
- Tilstrekkelig prøven er nå lastet inn i dynamiske prøven løkke for opptil 10 sekvensielle Hic kolonnen speiderrapporter runs.
5. Programmering Programvaren Metode og kjøre kolonne Speiderbevegelsen protokollen
- Fra Setup vinduet på Biologisk programvaren, velger de systemenheter merket med en stjerne i Tabell 1.
- Velg 6 Hic kolonner til analysen. Program en lineær nedadgående salt gradient og 6-kolonne speiding metode, som illustrert i tabell 3. Metoden Programmet er en modification av den biologiske programvare HIC kolonne oppsett og er optimalisert for det gjeldende programmet.
- En 6-kolonne speiding metoden anbefales på grunn av Fraction Collector begrensninger. Alle 7 kolonner kan speidet om programmet metoden er justert for å samle større del volumer. Ikke legg til speiding trinnet før programmet er ellers komplett, som å velge speiding funksjonen hindrer påfølgende redigering.
- Begynn speiding løp. Manuelt starte start buffer (100% B) flyt, 1 ml / minutt. Trykk start på splitteren kontrolleren til å starte 90% -10% eluatet stream-splitting mellom 12 ml kultur tube brøkdel samler (posisjon 1) og den 96-brønnen plate fraksjon samler (posisjon 2), henholdsvis. Teknisk note: Tenk på 96-brønnen plate brøkdel samleren drives aktiv fra den biologiske programvaren.
- Kjør programmet metoden. Umiddelbart etter oppstart av programmet metoden, trykk på start på skjermtastaturet kontrollpanelet på offline 96-brønn plate fraction oppsamler. Hvis de to brøkdel samlere er ikke 100% synkront, manuelt fremme aktiv 96-brønnen plate brøkdel solfangeren som de andre Fraction Collector videre til andre fraksjonen samlingen tube.
- Observer sanntid displayet for å bekrefte forventede kjøre parametere. Mottrykk, ledningsevne, og% B (figur 4) er kjørt parametere som kan overvåkes for å sikre kolonne-til-kolonne reproduserbarhet kjøre forhold. Valve posisjonering, pH, og prøve lasting bør også overvåkes. UV tracings kan sammenlignes bekrefte lignende gjennomstrømning eluering topper.
- Utnytte in-line og post-run eluatet analyseteknikker for å identifisere eluering profil og rensing av protein av interesse (dvs. "target protein").
- For prøver som inneholder GFP, observere eluering i-linje ved hjelp av protein unike UV absorbans ved 397 nm. Sammenlign GFP-spesifikke 397 nm absorbans tracing til den generelle protein 280 nm absorbans tracing å estimere relativ separasjonog rensing ved hjelp av de ulike Hic media blir speidet (figur 5).
- Post-run analyse av GFP og andre target proteiner kan oppnås gjennom flere metoder. Alikvoter av 5-50 mL fra de 96-brønns plate fraksjoner kan overføres til en frisk plate og analysert for bestemt protein innhold av ELISA eller Western blot, og total protein innhold av hver fraksjon kan analyseres ved hjelp av konvensjonell SDS-PAGE eller en Experion microfluidic elektroforese system. GFP fluorescens kan påvises i 12 ml kultur rør med UV-lys (figur 6).
- Identifisering av mest lovende Hic media kan bestemmes ved sammenligning av GFP eluering forhold til andre proteiner som finnes i prøven. Rensing med de mest lovende Hic medier kan så være optimalisert i henhold til andre parametere, inkludert type og konsentrasjon av start buffer og pH.
- Teknisk merknad: Ved avslutningen av forsøket, plassere alle innløp linjene inn buffer B1 (avgassetH 2 O) og grundig skyll pumper, ventiler, og alle rør med vann. Følg produsentens anvisninger for rengjøring og langsiktig lagring av kromatografi system og Hic kolonner.
6. Representative Resultater:
Representant HIC salt gradient, ledningsevne, og kolonne press av speidere kjører presenteres i figur 4. Endringen i salt konsentrasjon (blå linje), målt ved andel av buffer trukket fra high-salt buffer linjene er typisk for HIC metodikk. Som salt konsentrasjonen synker, proteiner bundet til kolonnen Eluer. Ledningsevne (rød linje), som tilsvarer observert saltkonsentrasjon, måles i-linje rett etter de QuadTec og UV detektorer. Den off-set mellom salt gradient og konduktivitet tracings indikerer tiden som kreves for buffer for å reise fra buffer inlet, gjennom systemet, og til ledningsevne skjermen. Gjennom prøven run, than trykket i systemet (grå linjer) og pH holder seg relativt konstant.
Figur 5 viser kromatogrammer av sekvensielle Hic kolonnen speiderrapporter runs. Den in-line påvisning av total protein (A 280, blå linje) og GFP (A 397, grønn linje) oppnås ved å måle absorbansen av lys på 280 nm og 397 nm, henholdsvis. Det er mulig å omtrentlig den relative GFP overflod og separasjon for hver speiding løp ved å sammenligne de to linjene. GFP bundet til de testede Hic kolonnene med ulike grader av tilhørighet og dens eluering profil varierte. Valg av en foretrukket HIC kolonnen for fremtidige renselser er basert på å identifisere kolonnen som produserer den skarpeste GFP eluering topp og størst atskillelse fra andre proteiner.
I figur 6, kultur rør for brøk 10, 12, 14, 16, og 18 av Phenyl FF (høy sub) speiderrapporter løp var visualisert i henhold værelsestemperatur (fluorescerende) lys og ultrafiolett (UV) lys. Rør ble vist både ansikt-forward (venstre panel) og top-down (høyre panel) for å observere den karakteristiske GFP utslipp spektrum. GFP (green) er tydelig påvist i Fraction 14 i begge UV bilder. Disse post-løpsdataene samsvarer fint med in-line deteksjon av GFP ved å måle eluatet absorbans ved 397 nm (A 397, grønn linje), som også identifiserer Brøk 14 som inneholder den store toppen av eluted GFP. Den diffuse blå i venstre UV panelet lys fra UV-lampen.
Figur 1. Skjematisk fremstilling av denne protokollen. Bakteriell lysate inneholder protein av interesse (GFP, mål protein) er forberedt, fortynnet i en høy-salt buffer tilsvarende den kromatografi start buffer, og filtrert. Når væskekromatografi systemet er forberedt, blir prøven lastet og målet protein er atskilt fra andre proteiner inneholdt in lysate med en hydrofob kromatografi medium som finnes i en ferdigpakket HIC kolonne. Utskillelsen Metoden er gjentatt flere ganger med forskjellige kromatografidatasystemer medier (kalt kolonne speiding) for å avgjøre hvilken media gir best GFP separasjon. De eluted proteiner (eluatet) blir analysert på linje med detektorer som inngår i kromatografi system og det er samlet inn i mindre fraksjoner for etterfølgende (post-run) analyse. Basert på in-line og post-run analyse av GFP aktivitet og separasjon, en optimal HIC kolonne og kromatografisk medium blir identifisert.
Tabell 1. Viktige kromatografi system komponenter som brukes i denne protokollen.
Figur 2. Diagram av Bio-Rad DuoFlow middels trykk væskekromatografi system ansatt. Viktige trekk ved sydemme omfatte automatisert buffer blanding, lasting av utvalget for sekvensielle kolonne kjører, automatisert utvalg av forskjellige kromatografidatasystemer kolonner, in-line analyse av eluatet, og tandem samling av fraksjonert eluatet. Se teksten og tabell 1 for detaljer.
Tabell 2. Biofysiske egenskapene Hic media testet. Navnet på HiTrap HIC kolonnen er beskrivende for ligand, ligand tetthet, og perle størrelse.
* FF = rask flyt, HP = høy ytelse. Større perle størrelse øker ligand binding kapasitet og strømningsrate. Mindre perle størrelse øker kromatografisk oppløsning. Informasjon hentet fra litteraturen gitt av produsenten.
Figur 3. Tilkobling av GE Healthcare HiTrap HIC kolonnen til Bio-Rad DuoFlow system.To oppstrøms 1/4-28 Delrin mutter ennd ferrule (A1), en hann Luer-til-kvinne 1/4-28 montering (B1) og mannlig 1/16 "-til-kvinne Luer montering (C) er koblet til. Beslagene er feste til HiTrap kolonnen etter å ha blitt skylles med buffer og ha alle bobler fjernet. Kolonnen uttaket er koblet til en kvinnelig 1/16 "-til-hann M6 montering (D), male Luer-til kvinne M6 montering (E), og kvinnelige Luer-til-kvinne en / 4-28 beslaget (B 2). Hele denne forsamlingen er koblet til nedstrøms 1/4-28 Delrin mutter og hylse (A 2). Det øverste panelet viser beslag separert og nedre panel viser beslag montert.
| Step # | Volum (ml) | Beskrivelse | Parametere | |
| 1 | 0,00 | Samle 1,0 ml fraksjoner under hele kjøringen | ||
| 2 | 0,00 | Switch Kolonner | HIC Kolonne 1 (Posisjon 2) | |
| 3 | 0,00 | Isocratic Flow | pH: 6,80 100% B | Volum: 2,00 ml Flow: 1,00 ml / min |
| 4 | 2,00 | Zero Baseline | QuadTec | |
| 5 | 2,00 | Zero Baseline | UV-detektor | |
| 6 | 2,00 | Injiser Sample | Eksempel Load Dynamisk Loop | Auto Injiser Valve Volum: 0,50 ml Flow: 1,00 ml / min |
| 7 | 3,00 | Isocratic Flow | pH: 6,80 100% B | Volum: 5,00 ml Flow: 1,00 ml / min |
| 8 | 8,00 | Lineær gradient | pH: 6,80 100% B -> 0% B | Volum: 10,00 mL Flow: 1,00 ml/ Min |
| 9 | 18.00 | Isocratic Flow | pH: 6,80 0% B | Volum: 3,00 ml Flow: 1,00 ml / min |
| 10 | 21.00 | Isocratic Flow | pH: 6,80 100% B | Volum: 5,00 ml Flow: 1,00 ml / min |
| 11 | 26.00 | Switch Kolonner | Union (Posisjon 1) | |
| Slutt | 26.00 | Slutt av protokoll | Automatisk Gjentas med ytterligere 5 Hic kolonner (Posisjoner 3-7) | |
| Speider typen | Antall nedfarter: 6 | Antall trinn speidet: 1 | ||
Tabell 3. Biologisk programvare protokoll for HIC speiding metode som anvendes.
<img alt = "Figur 4" src = "/ files/ftp_upload/3060/3060fig4.jpg" />
Figur 4. Representant HIC salt gradient, ledningsevne, og kolonne press. Som salt konsentrasjonen (blå linje) reduseres, gjør konduktivitet (rød linje) i tillegg. Den off-set mellom salt gradient og konduktivitet tracings indikerer tid som kreves for buffer for å reise fra buffer innløpet til ledningsevne skjermen. System trykk (grå linjer) forblir relativt konstant for varigheten av speiding løp.
Figur 5. Kompilerte kromatogrammer av sekvensiell HiTrap HIC kolonne speiding runs. Den in-line påvisning av total protein (A 280, blå linje) og GFP (A 397, grønn linje) oppnås ved å måle absorbansen av lys på 280 nm og 397 nm, henholdsvis. I denne serien av eksperimenter, ble det skarpeste GFP eluering topp observert med Phenyl FF (høy sub) column. Den Phenyl FF (høy sub) kolonnen også ut til å gi størst skille mellom GFP og andre proteiner. Ytterligere 1 ml HiTrap Hic kolonner testet inkludert Phenyl rask flyt lav substitusjon (Phenyl FF (lav sub)), butyl rask flow (butyl FF), butyl-S rask flyt (butyl-S FF), og octyl rask flyt (octyl FF) .
Figur 6. Representant post-run visualisering av GFP i prøven eluatet. Eluatet fraksjoner ble samlet til en rate på 1/minute, og hver ble analysert for GFP innhold. I denne representanten tallet, var kultur rør for brøk 10, 12, 14, 16, og 18 av Phenyl FF (høy sub) speiderrapporter run visualisert henhold værelsestemperatur (fluorescerende) lys og ultrafiolett (UV) lys. Rør ble vist både ansikt-forward (venstre panel) og top-down (høyre paneler). Den diffuse blå i venstre UV panelet lys fra UV-lampen. GFP (green) er tydelig påvist i Fracsjon 14 i begge UV bilder. Den øvre panelet angir totalt protein (A280, blå linje) og GFP (A 397, grønn linje) kromatogram tracings av de 5 fraksjoner blir visualisert.
Discussion
Væskekromatografi teknikker har vist seg uvurderlig for å forberede høyt rensede proteiner er nødvendige for å gjennomføre immunologisk 6, biokjemiske 7, og strukturelle 8 studier. Hic rensemetoder som oftest krever empirisk bestemmelse av en foretrukket medium, og ligand struktur, ligand tetthet, og matrise perle egenskaper alle har vist seg å påvirke kromatografiske resultater 2, 3. Automatisert kolonne speiding er en effektiv metode for å velge en HIC medium for senere optimalisering og proteinrensing 4. Den automatiserte kolonnen speiding metoden presenteres lett kan tilpasses ulike Hic proteinrensing strategier. Endringer i salt konsentrasjon, valg av salt, salt gradient, og pH kan ytterligere forbedre rensing forholdene, og effekten av varierende disse viktige parametre, har tidligere blitt anmeldt 13,14. HIC eluatet inneholder en delvis renset mål Protei kan renses ytterligere ved hjelp av en komplementær kromatografisk teknikk, for eksempel ionebytting kromatografi (IEX) eller gel filtrering / størrelse utestenging kromatografi 9,10.
På grunn av sin unike lys absorbans og utslipp egenskaper, kan eluering profilen GFP bli identifisert ved hjelp av in-line og post-run tilnærminger. For dette formål kan denne protokollen videre være tilrettelagt for rensing av rekombinante GFP-fusion proteiner, som et uavhengig mål protein er "tagget" med GFP. GFP-merket target proteiner kan oppdages med UV lys 11 og renset ved hjelp av forskjellige kromatografiske metoder, inkludert HIC rensing strategien beskrevet ovenfor. GFP rensing har også blitt en pedagogisk stift i biokjemi laboratorier for undervisning i moderne protein vitenskap teknikker 12.
Mens grunnleggende HIC proteinrensing kan bli utført ved hjelp av en vesentlig mindre robust kromatografi systammen, har instrumentering presenteres her en rekke klare fordeler å hjelpe med å skaffe gode resultater. Kjente fordelene ved å benytte en svært automatisert system inkluderer forbedret kjøre-til-serie tilstand reproduserbarhetsforhold, tid-sparing, og redusert mulighet for luft til å bli introdusert inn i systemet 10. System-kontrollert buffer blanding, som er tilrettelagt av systemet MAXIMIZER, åpner for økt konsistens i buffer forberedelse og eksperimentell reproduserbarhet. Tegning nok prøve laste inn i dynamiske prøven løkke for all speiding går videre sikrer ensartethet av prøven blir lagt til hver kolonne og gir mulighet for sekvensielle kjører uten avbrudd eller manuell omlasting. Kontrollert prøve injeksjon fra prøven sløyfen på kolonnen reduseres variasjonen som kan oppstå med manuell prøven lasting. Et par kolonne utvalg ventiler tillate påfølgende prøven nedfarter, hver med en annen HIC kolonne, uten å replumb systemet. Utføre mul TI-bølgelengde analyse er spesielt gunstig når analysere et protein med en unik Spektrofotometrisk profil. I tillegg til GFP kan cytokromer, flavoproteins og andre heme som inneholder proteiner dra nytte av denne teknikken. Ledningsevne og pH overvåkingsutstyr tillater verifisering av sanntids eksperimentelle forhold. Split brøkdel eluatet samling muliggjør forbedret brøkdel håndtering og muliggjør enkel overføring til post-run analysemetoder som krever en minimal prøvevolum (f.eks ELISA, SDS-PAGE, western blot, og Experion microfluidic elektroforese). Når du bruker andre fraksjonen samleren offline krever manuell synkronisering, gir det mulighet for maksimal fleksibilitet i fraksjonen kollektoren valg. De mest betydelige ulemper til å utnytte et slikt robust kromatografi system for HIC kolonne speiding og proteinrensing inkludere den opprinnelige tiden og budsjettmessige utgifter forbundet med instrument oppkjøp og opplæring av operatører.
t "> Protokollen presenteres her utnytter en Bio-Rad DuoFlow kromatografi system;. men kan like robust instrumentering fra andre produsenter, som for eksempel AKTA Avant fra GE Healthcare, også bli utnyttet og er i stand til å produsere tilsvarende resultater Selv sammenlignbare kromatografi system har unike egenskaper (f.eks metode programmering, komponent nomenklatur, operatør preferanse, og skalerbarhet begrensninger) som bør vurderes før du starter en renselse prosedyre eller instrument oppkjøp.Disclosures
Velg kromatografidatasystemer reagenser og supplerende instrumentering ble gitt av Bio-Rad.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health stipend GM086822 og National Science Foundation større forskningsprosjekt instrumentering stipend DBI-0960313. Forfatterne ønsker å takke legene. Jon Miyake & Donna Hardy (Bio-Rad) og Jennifer Loertscher (Seattle University) for sin tekniske ekspertise. Velg kromatografidatasystemer reagenser og supplerende instrumentering ble sjenerøst gitt av Bio-Rad.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioLogic DuoFlow Pathfinder 20 System | Bio-Rad | 7602257 | Includes system maximizer, mixer, F10 workstation, AVR7-3 valve, QuadTec UV/Vis detector with flow cell, BioFrac fraction collector, BioLogic software, and starter kit |
| AVR9-8 stream-select valve | Bio-Rad | 7600408 | |
| Diverter valve SV3-2 | Bio-Rad | 7500410 | |
| Stream splitter valve | Bio-Rad | 7410017 | |
| DynaLoop 25 Kit | Bio-Rad | 7500451 | |
| BioFrac Fraction Collector | Bio-Rad | 7410002 | Two fraction collectors used |
| BioFrac microplate drop head adapter | Bio-Rad | 74010088 | |
| BioFrac microtiter plate adapter | Bio-Rad | 7410017 | |
| UV Optics Module | Bio-Rad | 7500202 | |
| Halogen lamp | Bio-Rad | 7601331 | |
| Econo Gradient Pump | Bio-Rad | 7319001 | |
| Experion System | Bio-Rad | 7007001 | |
| Experion Pro260 Analysis Kit | Bio-Rad | 7007102 | |
| HiTrap HIC column selection kit | GE Healthcare | 28-4110-07 | Includes 7 x 1 ml pre-packed columns of HIC media for scouting |
| GE Healthcare-to-Bio-Rad column fittings | GE Healthcare | 18111251 and 18111257 |
References
- Cummins, P. M., O'Connor, B. F.
- Nagrath, D., Xia, F., Cramer, S. M. Characterization and modeling of nonlinear hydrophobic interaction chromatographic systems. J. Chromatogr. A. 1218, 1219-1226 (2011).
- To, B. C., Lenhoff, A. M. Hydrophobic interaction chromatography of proteins. IV. Protein adsorption capacity and transport in preparative mode. J. Chromatogr. A. 1218, 427-440 (2011).
- Huddleston, J. G., Wang, R., Lyddiatt, A. On the use of mild hydrophobic interaction chromatography for "method scouting" protein purification strategies in aqueous two-phase systems: a study using model proteins. Biotechnol Bioeng. 44, 626-635 (1994).
- Arun, K. H., Kaul, C. L., Ramarao, P. Green fluorescent proteins in receptor research: an emerging tool for drug discovery. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 1-23 (2005).
- Terrizzi, S. C., Banh, C., Brossay, L.A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer. J. Vis. Exp. (35), e1701-e1701 (2010).
- Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone. J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).
- Zeytuni, N., Zarivach, R. Purification of the M. magneticum strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAΔ41. J. Vis. Exp. (37), 10-3791 (2010).
- Kong, Y., Li, X., Bai, G., Ma, G., Su, Z. An automatic system for multidimensional integrated protein chromatography. J. Chromatogr. A. 1217, 6898-6904 (2010).
- Camper, D. V., Viola, R. E.
- Hammon, J., Palanivelu, D. V., Chen, J., Patel, C., Minor, D. L. A green fluorescent protein screen for identification of well-expressed membrane proteins from a cohort of extremophilic organisms. Protein Sci. 18, 121-133 (2009).
- Wu, Y. Using green and red fluorescent proteins to teach protein expression, purification, and crystallization. Biochem. Mol. Biol. Educ. 36, 43-54 (2008).
- Queiroz, J. A., Tomaz, C. T., Cabral, J. M.
- McCue, J. T. Theory and use of hydrophobic interaction chromatography in protein purification applications. Methods Enzymol. 463, 405-414 (2009).
