Summary
En automatiserad metod för att identifiera lämpliga hydrofoba interaktionskromatografi (HIC)-media kan användas i förfarandet för proteinrening presenteras. Metoden utnyttjar en medellång trycksystem vätskekromatografi med automatiserad buffert blandning, dynamisk Provslinga injektion, sekventiell kolumnen urval, flera våglängder analys och delad bråkdel eluat samling.
Abstract
I motsats till andra kromatografiska metoder för rening av proteiner (t.ex. gelfiltrering, affinitets-och jonbyteskromatografi), kräver hydrofob interaktionskromatografi (HIC) som vanligen experimentell bestämning (hänvisad till som screening eller "spana") för att välja den mest lämpliga kromatografiska mediet för rening av ett givet protein 1. Den metod som presenteras här beskriver en automatiserad metod för scouting för en optimal HIC-media kan användas vid rening av proteiner.
HIC separerar proteiner och andra biomolekyler från en rått lysat baserade på skillnader i hydrofobicitet. Liknande affinitetskromatografi (AC) och jonbyteskromatografi (lEX) är HIC som kan koncentrera proteinet av intresse när det fortsätter genom det kromatografiska processen. Proteiner är bäst lämpade för rening genom HIC inkluderar de med hydrofoba ytan regioner och som kan motstå exponering för salt halter som överskrider 2 M ammonium-sulfat ((NH4) 2 SO4). HIC väljs ofta som en reningsmetod för proteiner som saknar en affinitetsmärkning, och sålunda olämpligt för växelström, och när lEX inte tillhandahåller tillräcklig rening. Hydrofoba delar på proteinytan binda temporärt till en icke-polär ligand kopplad till en inert, orörlig matris. Interaktionen mellan proteinet och liganden är starkt beroende på saltkoncentrationen i bufferten strömmar genom kromatografi kolonn med höga jonkoncentrationer som stärker protein-ligand-interaktion och att göra proteinet orörliga (dvs. bundet inuti kolonnen) 2. Såsom salt koncentrationer minskar, det protein-ligand-interaktion avleder, proteinet blir åter rörlig och eluerar från kolonnen. Flera HIC medier är kommersiellt tillgängliga i förväg packade kolonner, vardera innehållande en av flera hydrofoba ligander (t.ex. S-butyl, butyl, oktyl och fenyl) tvärbunden med varierande densiteter till agarospärlor av en spekific diametern 3. Automatiserad kolumnen scouting möjliggör en effektiv metod för att avgöra vilka HIC media bör användas för framtida, mer uttömmande optimering experiment och proteinrening kör 4.
Det specifika proteinet som renas här är rekombinant grönt fluorescerande protein (GFP), dock kan det tillvägagångssätt anpassas för rening av andra proteiner med en eller flera hydrofoba ytområden. GFP fungerar som en användbar modell protein, på grund av dess stabilitet, unika Ijusabsorbans topp vid 397 nm, och fluorescens när den utsätts för UV-ljus 5. Bakterielysat innehållande vildtyp-GFP framställdes i en buffert med hög salthalt, laddas in i en Bio-Rad DuoFlow mediumtryck-vätskekromatografi-system, och adsorberades på HiTrap HIC-kolonner innehållande olika HIC medier. Proteinet eluerades från kolonnerna och analyserades genom in-line-och post-run detektionsmetoder. Buffert blandning, dynamisk Provslinga injektion, sekventiell colkolumnval selektion, för flera våglängder analys, och delad fraktion eluatet uppsamling ökade funktionaliteten hos systemet och reproducerbarheten av den experimentella tillvägagångssätt.
Protocol
1. Buffert och Provberedning
- Teknisk anm: Alla buffertar bör kylas och varje steg i detta protokoll bör utföras på is eller vid 4 ° C, om inte annat anges. Den låga temperaturen är nödvändig för att förhindra nedbrytning av proteinet som skall renas och för att säkerställa optimala driftsförhållanden. HIC medier kan producera olika separationsmetoder resultat om den drivs vid rumstemperatur, och kromatografin systemet bör användas i en 4 ° C kallt rum eller kall låda.
- Framställ 500 ml av följande buffertar: 200 mM NaH 2 PO 4 (Buffert A 1) 200 mM Na-HPO 2 4, (Buffert A2) och 4,8 M (NH4) 2 SO4 (Buffert B2). Avjoniserat vatten (buffert B1) kommer också att användas. Degas bufferten för att säkerställa optimala kromatografiska driftsförhållanden. Systemet Maximizer smälter samman Buffertar A1 och A2 för att generera en låg saltbuffert fosfat eluering, och det kommer att smälta Buffertar B1 och B2för att generera den med hög salthalt ammoniumbuffert sulfat början (2,4 M (NH4) 2 SO4).
- Framställ 20 ml prov, som skall lastas genom att blanda 10 ml av cell-lysat innehållande proteinet som skall renas med 10 ml buffert B2. Den slutliga ammoniumsulfatkoncentrationen av cellysatet provlösningen bör vara ungefär 2,4 M (NH4) 2 SO4, vilket gör det ungefär motsvarar den startbuffert. Cell-lysat kan framställas genom att återsuspendera bakterier cellpelleten i TE-buffert (10 mM Tris 1 mM EDTA, pH 8,0) följt av sonikering eller genom tillsats av 1 mg / ml lysozym och centrifugering vid 3700 x g under 10 minuter.
- Filtrera lysatet-buffert blandningen genom ett lågproteinbindande 0,45 fim sprutfilter för att avlägsna partiklar från lösningen. Hålla provet på is tills det är redo att laddas in i systemet.
2. Fysisk installation och VVS i DuoFlow kromatografi System
- Se till att alla enheter makt och kommunikation anslutningar har gjorts. Produkter bör synas i den biologiska DuoFlow kromatografi mjukvara manuell kontroll fönster. En sammanfattning av anordningar är listade i tabell 1. En illustration av systemet och rördragningsschema är i figur 2.
- Fäst elektriska anslutningar för ventiler till pumpen arbetsstationer och system Maximizer portar så att porten numreringen följer en logisk följd. Märk varje ventil med sin respektive port nummer för framtida referens. Pumpen arbetsstationen och systemet Maximizer fungera som de viktigaste kommunikation anslutningarna mellan datorn / controller och kromatografi system. Ventiler kommer automatiskt erkännas och visas i programvaran när den är ansluten till någon enhet.
- Teknisk anmärkning: När du använder kromatografi systemet i manuellt läge är ventilerna regleras oberoende. Var noga med att kontrollera att önskat flöde banan konfigureras, speciellt vid byte av ventiler, innan den inleder buffER flöde.
- Dränka rör av Teflon i buffertar A1, A2, B1 och B2. Säkerställa tillräckliga volymer buffert finns för hela protokollet och att slangen kommer att fortsätta att vara under vatten. Framställning 500 ml Buffertar A1, A2 och B2 och 1 liter buffert B1 att vara tillräcklig.
- Lod provladdning ventil och dynamisk provslinga såsom visas i fig 2 och enligt tillverkarens instruktioner. Ansluta provslingan till provet ventilinloppet (läge 3) med den minsta längd av slangen möjligt. Detta minimerar prov utspädning under provet lasten processen.
- Minimera slangen längden mellan provet, prov lastning pump, och prov lastning ventilinloppet (läge 2). Detta kommer att minska den mängd prov som krävs för att ladda provet slingan.
- Framställ 8 identiskt stora par av 1/16 "OD PEEK slang, varvid varje par förbundna med varandra medelst en 1/4-28 female-to-1/4-28 kvinnlig förening. Anslut paren till positioner 1-8 i två kolonnen val ventiler. 7 fackets anslutna i linje med ventil kolumnen urval positioner 2-8 kommer senare att ersättas av kromatografipelarna som skall provas. Förbundet anslutna inline med position 1 kommer att bibehållas som en kromatografikolonn bypass.
- Teknisk anm: Se varje par av slangen är ansluten till samma position på båda ventilerna kolumn val.
- Slå på både 4-våglängd UV / Vis detektor (QuadTec) lampa och fast våglängd 280 nm UV-detektor lampa. De våglängder som skall mätas genom QuadTec för detta protokoll innefattar 214 nm, 280 nm och 397 nm. Mätning 280 nm med både fast våglängd UV-detektor och QuadTec ger systemet redundans och säkerställer uppgifternas rimlighet.
- Bekräfta alla detektorer är kalibrerade enligt tillverkarens instruktioner. Övertrycksventilen är nödvändig för att minska luftbubbla ackumulering i detektorerna och monteras nedströms av detektorerna men uppströms om den pH-monitorn.
- Systemet som presenteras här innefattar två fraction samlare, vilket ger betydande bekvämlighet för post-run eluat analys. Fäst fraktionen samlare, ström splitter ventil, och splitter regulatorn som visas i figur 2. Fraktionssamlaren ansluten till position 1 i fördelningsventilen samlar 900 ^ eluatfraktioner i 12 ml kultur, medan fraktionen kollektor ansluten till position 2 samlar 100 ^ eluatfraktioner i mikrotiterplattor med 96 brunnar.
- Position 2 fraktionssamlare, splitter ventil, och splitter controller drivs inte av kromatografi arbetsstationen. Uppdelaren styrenheten är innesluten i en Bio-Rad Econo gradientpump, men är pumpen komponenten hos anordningen ej används. En "% Split" inställningsalternativ visas på Econo gradientpump när fördelningsventilen är ansluten till den.
- Ställ% Split 10. Position 1 fraktionsuppsamlare samlar 90% av eluatet (900 pl / fraktion) och position 2 fraktionsuppsamlare samlar10% (100 ^ il / fraktion). Andelarnas samlare kommer att utvecklas i synkront möjliggör fraktion antal av båda samlare att motsvara varandra.
- Byt standard fraktionen huvudet uppsamlare droppe på Position 2 fraktionssamlaren med en mikroplatta droppe huvud. Mikroplattan droppe huvudet har en mindre öppning, som medger insamling av 50% mindre droppstorlek (dvs. 25 ^ istället för standard 50 pl) och är särskilt fördelaktigt vid insamling ≤ 500 il fraktioner.
- Använda skärmen kontrollpanelen ställer du in Position 2 fraktionsuppsamlaren att samla fraktioner i 96-brunnars plattor och tid med en hastighet av 1 prov / minut. Uppdelaren styrenheten och position 2 fraktionsuppsamlare startas manuellt omedelbart efter början av den första körningen kromatografi.
- Spola Position 2 fraktionsuppsamlare och mikroplatta släpp huvudet med buffert B1.
3. Tändningssystemet Lines, Programmering Run-metoden och EquilibratIng HIC-kolonner
- Med systemet Maximizer inloppsledningarna nedsänkt i avgasade Buffertar A1, A2, B1 och B2, huvudentreprenörer arbetsstationens pumpar, skölj prov slinga, och spola kromatografisystemet enligt tillverkarens instruktioner. Komplett priming steg med alla 4 inlopp Maximizer systemet (A1, A2, B1 och B2) för att avlägsna kvarvarande luftbubblor.
- Förbereda systemet kräver manuell manövrering av systemstyrenheten via den biologiska mjukvara. Bekräfta korrekt placering av prov last ventil och kolumner ventiler val före startbuffert flöde.
- Förbereda för att starta en manuell 1 ml / minut flöde av elueringsbuffert (0% B) genom systemet, såsom beskrivs i steg 3,4-3,5.
- I Setup fönstret den biologiska programvara, välj "Använd buffert Blending" och "fosfatbuffert med Ammonium Sulfate". Bekräfta Buffertar A1, A2, B1 och B2 anges i Setup fönstret motsvarar förberedda.
- Manuellt ställa in flödet till 1 ml / minut av elueringsbuffert(0% B). Observera mottryck, konduktivitet, UV spårningar och pH förblir konsekvent och inom normala gränser. Avvikelser indikerar luft eller kolumnen blockering som bör tas upp innan du fortsätter.
- Spola alla 8 rader kolonn urval med 5 ml elueringsbuffert. Gör detta genom att först stoppa flödet, inställning båda ventilerna kolumn val till Position 2 och återuppta 1 ml / minut flöde, 0% B. Upprepa för linjer kolumnen urval i positionerna 3-8.
- Anslut 1 ml kolumner HiTrap HIC till positioner 2-8 av ventiler kolumn urval. Utför steg 3.8-3.13 med en kolonn vid en tidpunkt. Ta del av vilka HIC kolonnen placeras i vilket val ventilposition. En sammanfattning av HIC-kolonn media egenskaperna anges i tabell 2.
- Den fysiska anslutningen av GE Healthcare HiTrap kolumner till Bio-Rad DuoFlow kräver en serie av armaturer använder 1/4-28, M6 och Luer beslag. Ta bort facket som förbinder Position 2 ventiler kolumn val. Enlign av Bio-Rad-och GE Healthcare rördelar som illustreras i figur 3.
- Fäst uppströms kolumnen beslag till DuoFlow. Undvik att droppa luftbubblor i kolumnen eller slangen genom att kraftigt fästa uppströms kolumnen kopplingar för att uppströms valet ventilen montering. Springa elueringsbuffert genom beslagen tills all luft drivs ut och en stor droppe buffert är närvarande. Tillfälligt stoppbuffert flöde.
- Avlägsna proppen ansluten till kolonnens inlopp och placera en stor droppe svag saltbuffert (0% B) på toppen av kolonnen. Fäst kolumnen till uppströms beslag. Med både kolonnens inlopp och inloppet montering överfyllda med droppar av buffert säkerställer en anslutning utan luftbubblor.
- Om kolumnen används för första gången, snäpps slutet kolumnen utlopp. Fäst utlopp till nedströms kolumnen inredning och val av ventil slangar. Kontrollera att alla kopplingar är ordentligt åtdragna.
- Ställa mottrycket gräns till 40 psi. Tvätta kolonnen wed 5 kolonnvolymer (5 kolonnvolymer = 5 ml) av elueringsbuffert (0% B) vid en flödeshastighet av 1 ml / minut. Fortsätt kolumnen tvätta, om så behövs, tills pH har UV-kurvor och mottryck stabiliserats.
- Tvätta kolonnen med 10 kolonnvolymer (10 ml) startbuffert (100% B) vid en flödeshastighet av 1 ml / minut. Fortsätt kolumnen tvätt, om nödvändigt, tills systemets parametrar som anges i föregående steg, liksom konduktivitet har stabiliserats.
- HIC-kolonnen som framställts ovan är nu redo för laddning av prov. När alla kolumner som ska testas är beredda manuellt byta ventilerna kolumnen val till position 1 (union) och stoppa buffert flöde.
4. Provet laddas
- Dränka prov inloppsslang i 20 ml prov för att påbörja processen för lastning provet i den dynamiska provslinga. Från manuell inställning fönster den biologiska programvaran, byta last Provslinga / tvätta ventilen Position 1 (prov) och provet lastning ventilen för att rensa.
- Initiera åtgärderprovslingan laddningspump, upprättande provet i pumpslangen vid en flödeshastighet av 1 ml / minut tills omedelbart efter det att provet når ventilen provladdning. Detta avlägsnar buffert och / eller luft från provet belastningslinjen.
- Stoppa flödet av lastning pumpen och byta ventilen provet belastningen från Purge att ladda. Starta om provtagningspumpen slingan belastning vid ett flöde på 1 ml / minut tills 10 ml av provet har dragits in den dynamiska provet slingan.
- Tillräcklig mängd prov nu laddas in i dynamisk provslingan för upp till 10 HIC-kolonn spana körningar.
5. Programmering Programvaran metoden och köra Column Scouting protokollet
- Från Setup fönstret på den biologiska programmet, välj systemenheter markerade med en asterisk i tabell 1.
- Välj 6 HIC kolumner för analys. Programmet en linjär nedåtgående saltgradient och 6-kolonn scouting metod illustreras i tabell 3. Metoden programmet är en modification av den biologiska programvaran HIC kolonnen installation och har optimerats för det aktuella programmet.
- En 6-kolonn spana metod rekommenderas på grund av begränsningar fraktionsuppsamlare. Alla 7 kolumner kan spanade om programmet metoden justeras för att samla större andel volymer. Lägger inte scouting steg tills programmet är i övrigt klar som att välja scouting funktion förhindrar senare redigering.
- Påbörja scouting körningen. Manuellt starta startbuffert (100% B) flöde, 1 ml / minut. Tryck på start på splitter registeransvarige att påbörja 90% -10% eluat stream-delning mellan 12 ml kulturen rör fraktionssamlare (Position 1) och 96-brunnar fraktionssamlare (Position 2), respektive. Teknisk anmärkning: Minns 96-brunnar fraktionssamlare drivs inte från den biologiska programmet.
- Kör programmet metoden. Omedelbart efter start av loppet programmet metoden, trycker du börja på skärmen kontrollpanel offline 96-brunnar fraction kollektor. Om de två fraktionen samlare är inte 100% synkrona manuellt föra offline 96-brunns koUektorplatta bråkdel som de andra förskott fraktionssamlare till andra fraktionen provröret.
- Observera realtidsvisning att bekräfta förväntade köra parametrar. Mottryck, ledningsförmåga, och% B (figur 4) drivs parametrar som kan övervakas för att säkerställa kolonn-till-kolonn reproducerbarhet run betingelser. Valve positionering, pH, och prov lastning bör också övervakas. UV-kurvor kan jämföras för att verifiera liknande genomströmning eluerings toppar.
- Utnyttja in-line och efter run eluat tekniker för analys för att identifiera elueringsprofilen och rening av proteinet av intresse (dvs. "target protein").
- För prover som innehåller GFP, observera eluering in-line med hjälp av proteinet unika UV-absorbans vid 397 nm. Jämför GFP-specifika 397 nm absorbans spåra den allmänna proteinet 280 nm absorbansen spåra att uppskatta relativa separationoch rening med användning av de olika HIC medierna är rekognocerade (figur 5).
- Efter körningen analys av GFP och andra proteiner målet kan åstadkommas genom flera metoder. Alikvoter av 5-50 | il från 96-brunnars platta fraktioner kan överföras till en ny platta, och analyserades med avseende på specifik protein-innehåll genom ELISA eller Western blöt, och den totala proteinhalten i varje fraktion kan analyseras genom användning av konventionell SDS-PAGE eller en Experion mikrofluidisk elektroforessystem. GFP-fluorescens kan detekteras i 12 ml kultur med användning av UV-ljus (Figur 6).
- Identifiering av de flesta lovande HIC medier kan bestämmas genom jämförelse av GFP eluering i förhållande till andra proteiner som finns i provet. Rening med de mest lovande HIC media kan sedan optimeras enligt andra parametrar, däribland typ och koncentration av start buffert och pH.
- Teknisk anmärkning: Vid slutet av experimentet placera alla in-linjer i Buffer B1 (avgasasH2O) och skölj de pumpar, ventiler och alla slangar med vatten. Följ tillverkarens anvisningar för rengöring och långsiktig lagring av kromatografi system och HIC kolumner.
6. Representativa resultat:
Representativ HIC saltgradient, konduktivitet och kolonntrycket av spana körningar visas i figur 4. Förändringen i saltkoncentration (blå linje), mätt genom den procentuella andelen av buffert dras från buffert med hög salthalt linjer är typiskt för HIC metod. När saltkoncentrationen minskar, proteiner bundna till kolonnen elueras. Konduktivitet (röd), som motsvarar observerades saltkoncentration, mäts i-linje omedelbart efter QuadTec och UV-detektorer. Off-set mellan salt gradient och spårningar ledningsförmåga anger den tid som krävs för buffert att resa från bufferten inloppet, genom systemet, och till ledningsförmåga monitorn. Hela provkörningen, tHan systemtryck (grå linjer) och pH förblir relativt konstant.
Figur 5 visar kromatogram av sekventiella HIC-kolonn spana körningar. Den in-line-detektion av totalt protein (A 280, blå linje) och GFP (A 397, grön linje) åstadkommes genom att mäta absorbansen av ljus vid 280 nm och 397 nm, respektive. Det är möjligt att approximera den relativa GFP överflöd och separation för varje scouting körning genom att jämföra de två linjerna. GFP bundna till de testade HIC kolumner med olika grader skiftande affinitet och elueringsprofilen. Val av en föredragen HIC-kolonn för framtida reningar bygger på att identifiera kolumnen som producerar den skarpaste toppen GFP eluering och största separation från andra proteiner.
I figur 6, var odlingsrör för fraktionerna 10, 12, 14, 16 och 18 i Fenyl FF (hög under) spana loppet visualiserades under omgivande rummet (fluorescerande) ljuset och ultraviolett ljus (UV). Rör sågs både ansikte framåt (vänster paneler) och uppifrån och ner (höger paneler) för att observera det karakteristiska spektrumet GFP utsläpp. GFP (grönt) är tydligt detekteras i Fraktion 14 i båda UV-bilder. Dessa post-löpdata motsvarar fint med in-line detektering av GFP genom att mäta eluatet absorbansen vid 397 nm (A 397, grön linje), som också identifierar Fraktion 14 som innehåller den största toppen av eluerad GFP. Den diffusa blå i det vänstra UV panelen ljus som emitteras från UV-lampan.
Figur 1. Schematisk representation av detta protokoll. Bakterielysat innehållande protein av intresse (GFP, målprotein) framställes, späddes i en buffert med hög salthalt ekvivalent med kromatografi startbuffert och filtrerades. När väl vätskekromatografisystem framställes, är provet laddades och målproteinet separeras från andra proteiner som finns in lysatet med användning av en hydrofob kromatografi mediet som finns i en färdigpackad HIC-kolonn. Separationen Metoden upprepas flera gånger med olika kromatografiska medier (kallas som kolumn scouting) för att bestämma vilka medier ger den bästa GFP separation. De eluerade proteinerna (eluat) analyseras i linje med detektorer som ingår i kromatografi systemet och det samlas i mindre fraktioner för senare (efter run) analys. Baserat på in-line och efter körningen analys av GFP aktivitet och separation, en optimal HIC-kolonn och kromatografiska mediet identifieras.
Tabell 1. Viktiga kromatografisystemet komponenter som används i detta protokoll.
Figur 2. Diagram av Bio-Rad DuoFlow medeltryck vätska som användes kromatografisystem. Viktiga funktioner i syhejda inkluderar automatisk buffert blandning, lastning av prov för sekventiella kolumn körningar, automatisk urval av olika kromatografikolonner, in-line analys av eluatet, och tandem uppsamling av fraktionerade eluatet. Se text och tabell 1 för detaljer.
Tabell 2. Biofysiska egenskaper HIC media testas. Namnet på HiTrap HIC-kolonnen är en indikation på liganden, ligandtäthet och pärlstorlek.
* FF = snabbt flöde, HP = hög prestanda. Större pärlstorlek ökar ligandbindning kapacitet och flödeshastighet. Mindre pärla storlek ökar kromatografisk upplösning. Information från litteratur som tillhandahålls av tillverkaren.
Figur 3. Anslutning av GE Healthcare HiTrap HIC kolumn till Bio-Rad DuoFlow system.To uppströms 1/4-28 Delrin mutternnd hylsa (A1), en hane Luer-till-kvinna 1/4-28 montering (B1) och manliga 1/16 "till honluerkoppling (C) är anslutna. Armaturerna fäster vid HiTrap kolonnen efter att spolas med buffert och med alla bubblor bort. Pelaren utlopp är anslutet till en kvinnlig 1/16 "-till-man M6 montering (D), hane Luer-till hona M6 montering (E) och kvinnligt Luer-till-tik 1 / 4-28 montering (B 2). Hela detta aggregat är ansluten till den nedströms 1/4-28 Delrin mutter och beslaget (A 2). Det övre fältet visar beslagen separerades och den undre delen visar kopplingar monterade.
| Steg # | Volym (ml) | Beskrivning | Parametrar | |
| 1 | 0,00 | Samla 1,0 ml fraktioner under hela körningen | ||
| 2 | 0,00 | Switch kolumner | HIC-kolonnen 1 (Plats 2) | |
| 3 | 0,00 | Isokratisk Flöde | pH: 6,80 100% B | Volym: 2,00 ml Flöde: 1,00 ml / min |
| 4 | 2,00 | Noll Baslinje | QuadTec | |
| 5 | 2,00 | Noll Baslinje | UV-detektor | |
| 6 | 2,00 | Injicera prov | Provet Belastning Dynamisk Loop | Auto Injicera Ventil Volym: 0,50 ml Flöde: 1,00 ml / min |
| 7 | 3,00 | Isokratisk Flöde | pH: 6,80 100% B | Volym: 5,00 ml Flöde: 1,00 ml / min |
| 8 | 8,00 | Linjär Gradient | pH: 6,80 100% B -> 0% B | Volym: 10,00 ml Flöde: 1,00 ml/ Minut |
| 9 | 18,00 | Isokratisk Flöde | pH: 6,80 0% B | Volym: 3,00 ml Flöde: 1,00 ml / min |
| 10 | 21,00 | Isokratisk Flöde | pH: 6,80 100% B | Volym: 5,00 ml Flöde: 1,00 ml / min |
| 11 | 26,00 | Switch kolumner | Förbundet (Position 1) | |
| Änden | 26,00 | Slut på protokoll | Automatiskt Upprepar med ytterligare 5 HIC kolumner (Positioner 3-7) | |
| Spana typ | Antalet körningar: 6 | Antalet steg rekognocerade: 1 | ||
Tabell 3. Biologisk mjukvara protokoll för HIC anställda scouting metod.
<img alt = "Bild 4" src = "/ files/ftp_upload/3060/3060fig4.jpg" />
Figur 4. Representativa HIC saltgradient, konduktivitet och kolonntrycket. Eftersom saltkoncentrationen (blå linje) minskar, gör konduktivitet (röd linje) också. Off-set mellan salt gradient och spårningar konduktivitet indikerar tiden som krävs för buffert för att resa från bufferten inloppet till ledningsförmåga monitorn. Systemtryck (grå linjerna) är relativt konstant under varaktigheten av den scouting körningen.
Figur 5. Kompilerade kromatogram av sekventiell HiTrap HIC-kolonn scouting körningar. Den in-line-detektion av totalt protein (A 280, blå linje) och GFP (A 397, grön linje) åstadkommes genom att mäta absorbansen av ljus vid 280 nm och 397 nm, respektive. I denna serie av experiment, var den kraftigaste GFP elueringstoppen som observerades med Fenyl FF (hög under) column. Den Fenyl FF (hög under) kolonn visade också att tillhandahålla den största separationen mellan GFP och andra proteiner. Ytterligare 1 ml HiTrap HIC kolumner testas ingår Phenyl snabbt flöde lågt substitution (Fenyl FF (låg sub)), butyl snabbt flöde (butyl FF), butyl-S fast flöde (butyl-S FF) och oktyl snabbt flöde (oktyl FF) .
Figur 6. Representant efter loppet visualisering av GFP i provet eluat. Eluatfraktioner uppsamlades vid en hastighet av 1/minute, och var och analyserades med avseende på GFP-innehåll. I detta representativa figur, var odlingsrör för fraktionerna 10, 12, 14, 16 och 18 i Fenyl FF (hög under) spana loppet visualiserades under omgivande rummet (fluorescerande) ljuset och ultraviolett (UV) ljus. Rör sågs både ansikte framåt (vänster paneler) och uppifrån och ner (höger paneler). Den diffusa blå i det vänstra UV panelen ljus som emitteras från UV-lampan. GFP (grön) är tydligt påvisas i Fracning 14 i båda UV-bilder. Den övre panelen anger den totala proteinet (A280, blå linje) och GFP (A 397, grön linje) kromatogram tracings av de 5 fraktioner är visualiseras.
Discussion
Vätskekromatografi tekniker har visat sig ovärderlig för framställning av höggradigt renade proteiner som är nödvändiga för att genomföra immunologiska 6, biokemiska 7 och strukturella 8 studier. HIC reningsmetoder oftast kräver empirisk bestämning av en föredragen medium och ligandstruktur, ligandtäthet och matris bead egenskaper alla har visat sig påverka kromatografiska resultat 2, 3. Automatiserad kolumnen scouting är en effektiv metod för att välja en HIC medium för efterföljande optimering och proteinrening 4. Den automatiserade kolonn spana metod som presenteras kan lätt anpassas till olika HIC strategier proteinreningstekniker. Förändringar i saltkoncentration, val av salt, salt gradient, och pH kan ytterligare förbättra rening villkor, och effekterna av varierande dessa viktiga parametrar har tidigare granskats 13,14. HIC-eluat innehållande en partiellt renad målsubstans protei kan renas ytterligare med användning av en komplementär kromatografisk teknik, såsom jonbyteskromatografi (lEX) eller gelfiltrering / storleksuteslutningskromatografi 9,10.
På grund av sin unika ljusabsorbans och egenskaper utsläpp kan elueringsprofilen för GFP kan identifieras med hjälp av in-line och efter-run metoder. För detta ändamål, kan detta protokoll vidare anpassas för rening av rekombinanta GFP-fusionsproteiner, i vilka en obesläktad målproteinet är "taggade" med GFP. GFP-märkta mål-proteiner kan detekteras med UV-ljus 11 och renades med hjälp av olika kromatografiska metoder, inklusive HIC rening som beskrivs ovan. GFP rening har också blivit en pedagogisk stapelvara i biokemi laboratorier för undervisning av modern teknik Protein Science 12.
Medan den grundläggande HIC proteinrening kan utföras med hjälp av en betydligt mindre robust kromatografi systam har instrumentering som presenteras här ett antal distinkta fördelar för att hjälpa till att erhålla gynnsamma resultat. Noterbara fördelarna med att använda ett mycket automatiserat system inkluderar förbättrade kör-to-köra villkor reproducerbarhet tidsbesparingar och minskad möjlighet för luft att införas i systemet 10. Systemet kontrollerad buffert blandning, vilket underlättas av att systemet Maximizer, ger ökad konsistens i buffert framställning och experimentell reproducerbarhet. Ritning tillräckligt prov last i det dynamiska provslingan för alla spana löper vidare säkerställer likformighet av provet sätts till varje kolonn och medger sekventiella körningar utan avbrott eller manuell lastning. Kontrollerad prov injektion från provet slingan på kolonnen minskar variationen som kan uppstå med manuell prov belastning. Ett par ventiler kolumn val tillåta varandra följande prov körningar, var med en annan HIC-kolonn, utan att behöva replumb systemet. Utföra Mul Ti-våglängd analys är särskilt fördelaktigt när analys av ett protein med en unik spektrofotometrisk profil. Förutom GFP, kan cytokromer och flavoproteins och andra heme-innehållande proteiner omfattas av denna teknik. Konduktivitet och pH övervakningsanordningar möjliggör verifiering av realtid experimentella betingelser. Split bråkdel Eluatuppsamlingen möjliggör förbättrad bråkdel hantering och möjliggör enkel överföring för post-run analysmetoder som kräver en minimal prov volym (t.ex. ELISA, SDS-PAGE, Western blot och Experion mikroflödessystem elektrofores). När du använder den andra offline fraktionsuppsamlaren kräver manuell synkronisering, gör det för maximal flexibilitet i fraktionssamlare val. De viktigaste nackdelarna att utnyttja ett sådant robust kromatografi för HIC kolonnen scouting och proteinrening omfattar den första tiden och budgetutgifter i samband med instrumentet förvärv och utbildning av operatörer.
t "> Protokollet presenteras här använder en Bio-Rad DuoFlow kromatografi systemet,. men kan lika robust instrument från andra tillverkare, till exempel ÄKTA Avant från GE Healthcare, även tas tillvara och är kapabla att producera likvärdiga resultat även jämförbara kromatografisystemet har unika egenskaper (t.ex. metod programmering, komponenter nomenklatur, operatör företräde och skalbarhet begränsningar) som bör beaktas innan man inleder en reningsprocedur eller instrument förvärv.Disclosures
Välj kromatografi reagenser och kompletterande instrument lämnades av Bio-Rad.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av National Institutes of Health bidrag GM086822 och National Science Foundation stora forsknings instrumentering bidrag DBI-0.960.313. Författarna vill tacka Dr. Jon Miyake & Donna Hardy (Bio-Rad) och Jennifer Loertscher (Seattle University) för sin tekniska kompetens. Välja kromatografi reagensen och supplementära instrumentering var generöst tillhandahållet av Bio-Rad.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioLogic DuoFlow Pathfinder 20 System | Bio-Rad | 7602257 | Includes system maximizer, mixer, F10 workstation, AVR7-3 valve, QuadTec UV/Vis detector with flow cell, BioFrac fraction collector, BioLogic software, and starter kit |
| AVR9-8 stream-select valve | Bio-Rad | 7600408 | |
| Diverter valve SV3-2 | Bio-Rad | 7500410 | |
| Stream splitter valve | Bio-Rad | 7410017 | |
| DynaLoop 25 Kit | Bio-Rad | 7500451 | |
| BioFrac Fraction Collector | Bio-Rad | 7410002 | Two fraction collectors used |
| BioFrac microplate drop head adapter | Bio-Rad | 74010088 | |
| BioFrac microtiter plate adapter | Bio-Rad | 7410017 | |
| UV Optics Module | Bio-Rad | 7500202 | |
| Halogen lamp | Bio-Rad | 7601331 | |
| Econo Gradient Pump | Bio-Rad | 7319001 | |
| Experion System | Bio-Rad | 7007001 | |
| Experion Pro260 Analysis Kit | Bio-Rad | 7007102 | |
| HiTrap HIC column selection kit | GE Healthcare | 28-4110-07 | Includes 7 x 1 ml pre-packed columns of HIC media for scouting |
| GE Healthcare-to-Bio-Rad column fittings | GE Healthcare | 18111251 and 18111257 |
References
- Cummins, P. M., O'Connor, B. F.
- Nagrath, D., Xia, F., Cramer, S. M. Characterization and modeling of nonlinear hydrophobic interaction chromatographic systems. J. Chromatogr. A. 1218, 1219-1226 (2011).
- To, B. C., Lenhoff, A. M. Hydrophobic interaction chromatography of proteins. IV. Protein adsorption capacity and transport in preparative mode. J. Chromatogr. A. 1218, 427-440 (2011).
- Huddleston, J. G., Wang, R., Lyddiatt, A. On the use of mild hydrophobic interaction chromatography for "method scouting" protein purification strategies in aqueous two-phase systems: a study using model proteins. Biotechnol Bioeng. 44, 626-635 (1994).
- Arun, K. H., Kaul, C. L., Ramarao, P. Green fluorescent proteins in receptor research: an emerging tool for drug discovery. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 1-23 (2005).
- Terrizzi, S. C., Banh, C., Brossay, L.A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer. J. Vis. Exp. (35), e1701-e1701 (2010).
- Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone. J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).
- Zeytuni, N., Zarivach, R. Purification of the M. magneticum strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAΔ41. J. Vis. Exp. (37), 10-3791 (2010).
- Kong, Y., Li, X., Bai, G., Ma, G., Su, Z. An automatic system for multidimensional integrated protein chromatography. J. Chromatogr. A. 1217, 6898-6904 (2010).
- Camper, D. V., Viola, R. E.
- Hammon, J., Palanivelu, D. V., Chen, J., Patel, C., Minor, D. L. A green fluorescent protein screen for identification of well-expressed membrane proteins from a cohort of extremophilic organisms. Protein Sci. 18, 121-133 (2009).
- Wu, Y. Using green and red fluorescent proteins to teach protein expression, purification, and crystallization. Biochem. Mol. Biol. Educ. 36, 43-54 (2008).
- Queiroz, J. A., Tomaz, C. T., Cabral, J. M.
- McCue, J. T. Theory and use of hydrophobic interaction chromatography in protein purification applications. Methods Enzymol. 463, 405-414 (2009).
