Summary
Proteinin saflaştırılması işleminde kullanılmak üzere uygun hidrofobik etkileşim kromatografısi (HIC) ortam tanımlanması için otomatik bir yöntem sunulmaktadır. Otomatik bir yöntem tampon karışım, dinamik bir örnek enjeksiyon döngüsü, ardışık sütun seçimi, çoklu dalga boyu analizi, ve iki fraksiyon eluat toplama dahil olmak üzere, orta basınçlı sıvı kromatografisi sistemi kullanır.
Abstract
Temizleyici proteinleri (örneğin, jel filtrasyonu, afinite, ve iyon değişimi) için diğer kromatografik metodlar aksine, hidrofobik etkileşim kromatografısi (HIC) yaygın olarak en uygun kromatografik orta seçmek için deneysel tayini (tarama ya da "izcilik" olarak anılacaktır) gerektirir Verilen bir proteinin saflaştırılması için 1. Burada anlatılan yöntem proteinin saflaştırılması kullanılmak üzere en uygun HIC ortam için izcilik için otomatik bir yaklaşımı tarif eder.
HIC hidrofobiklik farklılıklara bağlı olarak bir ham lizat proteinleri ve diğer biyomoleküllerin ayırır. Afinite kromatografisi (AC) ve iyon değişimi kromatografisi (IEX) benzer şekilde, bu HIC kromatografi işlemi boyunca ilerlerken ilgili proteini konsantre yeteneğine sahiptir. Iyi HIC tarafından arıtma için uygundur Proteinler hidrofobik yüzey bölgeler ve 2 M cephane aşan konsantrasyonlarda tuz maruz dayanabilmesi olanlar dahilNeodinyum sülfat ((NH4) 2 SO4). HIC genellikle bir yakınlık etiketi eksik proteinler için bir arınma yöntemi olarak seçilmiş, ve AC için böylece uygun ve IEX yeterli arıtma sağlamak için başarısız olduğunda edilir. Proteininin yüzeyde hidrofobik yarımlar geçici bir inert, hareketsiz matris şekilde bağlanmış bir polar olmayan ligant bağlama. Protein ve ligand arasındaki etkileşimi protein-ligand etkileşimi güçlendirmek ve hareketsiz protein (yani sütun içindeki bağlı) 2 yaparak yüksek iyonik konsantrasyonları, kromatografi sütunu akan tampon tuz konsantrasyonu son derece bağımlıdırlar. Tuz konsantrasyonu düşüş olarak, protein-ligand etkileşimi dağıtır, protein tekrar sütundan mobil ve elutes hale gelir. Çeşitli HIC ortam önceden paketlenmiş kolon, ticari olarak mevcuttur, birkaç hidrofobik ligandları (örn. oktil S-butil, butil, ve fenil) her birinin içeren bir spec agaroz boncukları üzere yoğunlukları değişen çapraz-bağlantılıIFIC çapı 3. Izcilik Otomatik sütun HIC medyanın geleceği, daha ayrıntılı bir optimizasyon denemeleri için istihdam ve protein saflaştırma 4 çalışır gereken belirlemek için etkin bir yaklaşım getirmektedir.
Burada saflaştırılmış olan özel protein rekombinant yeşil flöresanlı protein (GFP) 'dir, ancak bir yaklaşım, bir veya daha fazla hidrofobik yüzey bölgeleri ile diğer proteinleri saflaştırılması için adapte edilmiş olabilir. GFP UV ışığı 5 maruz kaldığında kendi istikrar, 397 nm'de benzersiz ışık absorbansı tepe, ve floresan nedeniyle yararlı bir model protein olarak hizmet vermektedir. Wild tip GFP içeren bakteri lisatı, yüksek tuz tamponu içinde hazırlanan bir Bio-Rad Çift Geçişli orta basınçlı sıvı kromatografisi sisteme yüklenir ve farklı bir ortam ihtiva HIC HiTrap HIC kolonlara adsorbe edildi. Protein kolonlardan elüt ve in-line ve post-çalıştırma tespit yöntemleri ile analiz edildi. Tampon karıştırma, dinamik örnek döngü enjeksiyon, sıralı colUMN seçimi, çoklu dalga boyu analizi, ve iki fraksiyon eluat toplama deneysel yaklaşımın sistemi ve çoğaltılabilirlik işlevselliği artmıştır.
Protocol
1. Tampon ve Numune Hazırlama
- Teknik not: Tüm tamponlar buzdolabında edilmeli ve aksi belirtilmediği sürece, bu protokolünün her adım, buz üzerinde ya da 4 ° C de yapılmalıdır. Düşük sıcaklıkta saflaştırılmak protein bozulmasını önlemek için, optimum çalışma koşulları sağlamak için gereklidir. HIC ortam oda sıcaklığında çalıştırılırsa, farklı ayırma sonuçlar elde edildi, ve kromatografi sistemi 4 ° C soğuk depo veya soğuk kutusuna çalıştırılmalıdır.
- Aşağıdaki tamponların 500 ml hazırlamak: 200 mM NaH 2 PO 4 (Tampon A1), 200 mM 2 HPO 4 Na, (A2 Buffer) ve 4.8 M (NH4) 2 SO4 (Tampon B2). Deiyonize su (Tampon B1) de kullanılır. Degas tampon optimum kromatografik çalışma koşulları sağlamaktır. Sistem arttıran düşük tuz fosfat elüsyon tampon oluşturmak için A1 ve A2 Tamponlar araya geliyor olacak ve Tamponlar B1 ve B2 karışımı olacakyüksek tuz amonyum sülfat başlangıç tamponu (2.4 M (NH4) 2 SO4) üretmek için.
- Tampon B2 10 ml ile saflaştırılmak proteini içeren bir hücre lizatı 10 ml karıştırılarak tarafından yüklenecek Örnek 20 ml hazırlayın. Hücre lizatı örnek solüsyon, nihai konsantrasyonu amonyum sülfat başlangıç tampon için denk verme, yaklaşık 2.4 M (NH4) 2 SO4 olmalıdır. Hücre lizatı sonikasyon veya 10 dakika boyunca 3700 az 1 mg / ml lizozim ve santrifüjleme x g eklenmesi takip TE tamponunda bakteriyel hücre peleti (10 mM Tris 1 mM EDTA, pH 8,0) resuspending hazırlanabilir.
- Çözüm partiküler madde kaldırmak için filtre 0.45 mikron şırınga bağlayan düşük protein ile lizat-tampon karışımı filtre. Bu sisteme yüklenecektir hazır olana kadar buz içinde Örnek tutmak.
2. Çift Geçişli Kromatografi Sistemi Fiziksel Kurulum ve Tesisat
- Tüm cihaz güç sağlamak ve iletişim bağlantıları yapılır. Cihazlar Biyolojik Çift Geçişli kromatografi yazılımı manuel kontrol penceresinde görünür olmalıdır. Cihazların özeti Tablo 1'de verilmiştir. Sistemi ve sıhhi diyagramı bir örneği Şekil 2 içindedir.
- Port numaraları mantıksal bir sıra takip ettiği gibi pompa istasyonu ve sistem arttıran limanlarına valfler için elektrik bağlantıları takın. Ileride kendi ilgili port numarası ile her vana etiketleyin. Pompa istasyonu ve sistem arttıran bilgisayar / denetleyici ve kromatografi sistemi arasındaki temel iletişim bağlantıları olarak hizmet vermektedir. Ya cihaza bağlandığında Vanalar otomatik olarak tanınır ve yazılım görüntülenir.
- Teknik not: manuel modda kromatografi işletim sistemi iken, vana bağımsız olarak kontrol edilir. Vanalar anahtarlama özellikle tutkunu başlamadan önce, istenilen akış yolu yapılandırılmış olduğunu doğrulamak için özener akışı.
- Tamponlar A1, A2, B1 ve B2 inmeye Teflon tüp. Tampon yeterli hacimleri tüm protokolü için kullanılabilir ve bu boru su altında kalmaya devam edecektir emin olun. 500 ml Tamponlar A1, A2 ve B2 ve Tampon B1 1 L hazırlanması yeterli olacaktır.
- Şekil 2 ve üreticinin talimatlarına göre gösterildiği gibi Çekül numune vana ve dinamik örnek döngü yükleniyor. Olası boru en küçük boyu ile numune vana giriş (Pozisyon 3) örnek döngü bağlayın. Bu örnek yükleme işlemi sırasında dilusyonun en aza indirecektir.
- Boru örnek arasındaki uzunluk, örnek yükleme pompası, ve örnek yükleme Valf giriş (Pozisyon 2) en aza indirin. Bu örnek loop yüklemek için gerekli olan numune miktarı azalır.
- Her çift, 1/16 "OD PEEK boru 8 eşit boyutlardaki çiftleri hazırlayın 1/4-28 female-to-1/4-28 kadın sendika tarafından birlikte katıldı. Iki sütun Pozisyonlar 1-8 için çiftleri bağlayın vanaları. 7 sendikalar daha sonra test edilecek kromatografi sütunları yerini alacaktır sütun seçimi vana Pozisyonlar 2-8-line bağlı. Sendika Pozisyon 1 ile bağlı satıriçi bir kromatografi kolonundan bypass olarak muhafaza edilecektir.
- Teknik not: tüplerin her çifti sütun seçimi valf hem de aynı konuma bağlı sağlanması.
- 4-dalga boylu UV / Vis Detektör (QuadTec) lambası ve sabit dalga boyu 280 nm UV Dedektör lambası hem de açın. Bu protokolün QuadTec ile ölçülebilir için dalga boyları 214 nm, 280 nm ve 397 nm içerir. Sabit dalga boylu UV Dedektör ve QuadTec her ikisi ile 280 nm Ölçüm sistemi artıklık sağlar ve veri geçerliliği sağlar.
- Tüm dedektörleri onaylayın üreticinin talimatlarına göre kalibre edilir. Geri basınç regülatörü dedektörleri hava kabarcığı birikimini azaltmak için gereklidir ve dedektör aşağı akım ancak pH monitörün yukarı akım yüklü olmalıdır.
- Burada sunulan sistem iki fraksiyonu içerenpost-run eluat analizi için önemli bir kolaylık sağlar n kolektörleri,. Fraksiyon toplama, dere ayrıştırıcı vana ve Şekil 2'de gösterildiği gibi ayırıcı denetleyici takın. Fraksiyon toplayıcı 96 microtiter plakalar 100 ul eluat kesirler toplayacak Pozisyon 2 bağlıyken ayrıştırıcı vana 1 yerleştirin bağlı fraksiyon toplayıcı, 12 ml kültür tüplerde 900 ul eluat kesirler toplayacaktır.
- Pozisyon 2 fraksiyon toplayıcı, ayrıştırıcı vana ve ayırıcı denetleyici kromatografisi istasyonunun çevrimdışı işletilmektedir. Ayırıcı denetleyicisi bir Bio-Rad Econo Gradyan Pompa içinde bulunur, ancak, cihaz pompa bileşeni kullanılmaz. Ayrıştırıcı vana bunu bağlıyken bir "% Split" ayar seçeneği Econo Gradient Pompası gösterilecektir.
- Set% 10 Böl. Pozisyon 1 fraksiyon toplayıcı eluat (900 ul / fraksiyon)% 90 toplayacak ve Pozisyon 2 fraksiyon toplayıcı toplayacak% 10 (100 ul / fraksiyonu). Fraksiyon toplama birbirlerine karşılık hem koleksiyonerlerin fraksiyonu sayılar için izin eşzamanlı ilerler.
- Bir mikro damla kafa Pozisyon 2 fraksiyon toplayıcı üzerindeki standart fraksiyon toplayıcı damla kafa değiştirin. Mikroplak damla baş% 50 daha küçük damla boyutları (yani 25 ul yerine standart 50 ul) toplanması izin verir ve ≤ 500 ul kesirleri toplarken özellikle faydalı olan daha küçük bir diyafram vardır.
- Ekrandaki kontrol panelini kullanarak, 1 örnek / dakika hızında plakaları 96-iyi ve önceden kesirleri toplamak için Pozisyon 2 fraksiyon toplayıcı ayarlayın. Splitter denetleyici ve Pozisyon 2 fraksiyon toplayıcı ilk kromatografisi run start ardından elle hemen başlanacaktır.
- Tampon B1 Pozisyon 2 fraksiyon toplayıcı ve mikro damla kafa yıkayın.
3. Astar Sistem Hatları, Programlama Run Yöntem ve Equilibrating HIC Sütunlar
- Sistem arttıran giriş hatları vakum gazından arındırılmış Tamponlar A1, A2, B1 ve B2, asal istasyonu pompaları batırılan ile, örnek döngü durulayın ve üreticinin talimatlarına göre kromatografi sistemi yıkayın. Tüm 4 arttıran sistem girişleri ile komple astar adım (A1, A2, B1 ve B2) kalan hava kabarcıklarını çıkarmak için.
- Sistemin Hazırlanması Biyolojik yazılımı ile sistem kontrol manuel operasyon gerektirir. Önce tampon akışı başlamadan örnek yük valfi ve sütun seçimi vanaların doğru konumlandırma onaylayın.
- Gibi Steps 3,4-3,5 açıklanan sistem, bir el aracılığıyla 1 ml / dakikalık bir işlem tampon maddesi ile akışı (% 0 B) başlatmak için hazırlayın.
- Biyolojik program yazılım Kurulum penceresinde, "Amonyum Sülfat ile Fosfat Tampon" ve "Tampon Blending kullan" seçeneğini seçin. A1 Tamponlar, A2, B1 ve Setup penceresinde listelenen B2 bu Hazırlanan karşılık onaylayın.
- El ile 1 ml / elüsyon tampon dakika akış hızını ayarlamak(% 0 B). Backpressure dikkat edin, iletkenlik, UV izlemleri ve pH tutarlı ve normal çalışma sınırları içinde kalır. Anomaliler öncesinde davasının ele alınmalıdır hava veya sütun tıkanma göstermektedir.
- 5 ml işlem tampon maddesi ile, tüm 8 kolon seçimi hatları boşaltır. İlk, akış durdurma Pozisyon 2 sütun seçimi vanalar hem ayarlamak ve 1 ml / dakika akış,% 0 B. sürdürmeden bu mu Pozisyonlar 3-8 sütun seçimi hatları için tekrarlayın.
- Sütun seçimi vana pozisyonları 2-8 1 ml HiTrap HIC sütun bağlayın. Bir seferde bir sütun ile adımları 3,8-3,13 tamamlayın. HIC sütünunda seçimi vana pozisyonda yerleştirildiği dikkat edin. HIC sütun medya özelliklerinin bir özeti Tablo 2'de yer almaktadır.
- Bio-Rad Çift Geçişli sistemine GE Healthcare HiTrap sütunların fiziksel bağlantı 1/4-28 kullanarak parçaları, M6 ve Luer parçaları bir dizi gerektirir. Pozisyon 2 sütun seçimi vanaları bağlamak sendika çıkarın. AŞekil 3'te gösterildiği gibi Bio-Rad ve GE Healthcare parçaları Satır.
- Çift Geçişli için yukarı sütun parçaları ekleyin. Sıkıca yukarı seçim vana montaj için yukarı sütun parçaları ekleyerek sütun veya tüp içinde hava kabarcıkları yakalama kaçının. Tüm hava sınırdışı ve tampon büyük bir düşüş mevcut kadar parçaları üzerinden işlem tampon çalıştırın. Geçici tampon akışı durabilir.
- Sütun girişine bağlanır durdurucu kaldırmak ve kolon üzerinde düşük tuzlu tampon büyük bir damla (% 0 B) yerleştirin. Memba parçaları için sütun ekleyin. Sütun giriş ve tampon damla ile taşan girişi bağlantısı hem de sahip hava kabarcıkları serbest bir bağlantı sağlar.
- Sütun, ilk kez kullanıldığı takdirde, kolon çıkış ucundan koparmak. Aşağı sütun parçaları ve seçim vana boru için prize takın. Tüm parçaları sıkıca bağlanır doğrulayın.
- Backpressure sınırı 40 psi olarak ayarlayın. Sütun w yıkayın1 ml / dakikalık bir akış hızında işlem tampon maddesi ile i 5 kolon hacmi (5 kolon hacmi = 5 ml) bir (% 0 B). PH kadar, UV ve iz backpressure stabilize edilmiş olan, gerektiği takdirde, kolon yıkama devam etmektedir.
- 10 sütun hacmi (10 ml) bir 1 ml / dakikalık bir akış hızında başlangıç tamponu (% 100 B) ile sütun yıkanır. Önceki aşamanın da iletkenliği gibi listelenmiş sistem parametrelerinin stabilize kadar, gerektiği takdirde, kolon yıkama devam etmektedir.
- Yukarıda hazırlanan HIC sütunu artık Örnek yüklenmesi için hazırdır. Test edilecek tüm sütunları hazırlanır sonra, elle Pozisyon 1 (sendika) için sütun seçimi vanaları geçiş ve tampon akışı durabilir.
4. Örnek Yükleme
- 20 ml örnek inmeye örnek giriş hortumunu dinamik örnek döngü içine yükleme örnek işlemine başlamak için. Biyolojik yazılım manuel ayar penceresinden, örnek döngü yük geçiş / Pozisyon 1 (Örnek) ve temizleyin için örnek yükleme valf vana yıkayın.
- Eylem başlatmaÖrnek döngü yükleme pompası, hemen örnek kadar sonra 1 ml / dakika akış hızında pompa hortumunu içine numune hazırlanması numune yüklemesi vana ulaşır. Bu, tampon ve / veya Örnek yük hattı içindeki hava kaldırır.
- Yükleme pompa akışını durdurun ve Load Temizle gelen numune yüklemesi vana geçiş. Örnek 10 ml dinamik bir numune loop içine çekilir dek 1 ml / dakikalık bir akış hızında Örnek loop yükleme pompası başlatmalısınız.
- 10'a kadar sıralı HIC sütun izcilik koşular için yeterli örnek şimdi dinamik örnek döngü içine yüklenir.
5.. Yazılım Yöntem Programlama ve Sütun İzcilik Protokolü Koşu
- Biyolojik yazılım Kurulum penceresinden, Tablo 1 de yıldız işareti ile işaretlenmiş sistem aygıtları seçin.
- Tahlil için 6 HIC sütunları seçin. Program bir doğrusal gradyan azalan tuzu ve 6-sütunu izcilik yöntemi, Tablo 3 de gösterilmiştir. Program bir yöntem olup modificatBiyolojik yazılım HIC sütun kurulum iyon ve geçerli uygulama için optimize edilmiştir.
- A 6-sütun izcilik metodu fraksiyon toplayıcı sınırlamalar nedeniyle tavsiye edilir. Program yöntemi büyük kısmını hacimleri toplamak için ayarlanır durumunda, her sütun 7 scouted edilebilir. Izcilik özelliği seçerek izleyen düzenleme engeller gibi program, aksi tamamlanana kadar izcilik adım katmayın.
- Izcilik çalışma başlayın. Elle başlama tampon başlaması (% 100 B) akım, 1 ml / dakika. 12 ml kültür tüpünün fraksiyon toplayıcı (Pozisyon 1) ve sırasıyla 96-plaka fraksiyon toplayıcı (Pozisyon 2) arasındaki 90% -10% eluat akışı-bölme başlaması ayırıcı denetleyicisinde başlatmak basın. Teknik not: 96-plaka fraksiyon toplayıcı Biyolojik yazılım isimli işletilmektedir hatırlayın.
- Program yöntemi çalıştırın. Hemen program yöntemi çalışma başladıktan sonra, çevrimdışı 96-plaka fraksiyonu ile ekrandaki kontrol panelinde başlamak içinn kollektör. İki fraksiyon toplama% 100 uyumlu değilse, elle, ikinci fraksiyon toplama tüpüne diğer fraksiyon toplayıcı ilerledikçe çevrimdışı 96-plaka fraksiyon toplayıcı ilerlemek.
- Beklenen çalışma parametreleri onaylamak için gerçek zamanlı görüntü gözlemleyin. Backpressure, iletkenlik ve% B (Şekil 4) Çalışma koşullarının kolon-to-sütun tekrarlanabilirliği sağlamak için izlenebilir parametreleri çalıştırılır. Vana konumlandırma, pH ve örnek yükleme de izlenmelidir. UV iz Elüsyon pikleri akışı-benzer doğrulamak için karşılaştırılabilir.
- Ilgi protein (yani "hedef protein") ve elüsyon profiline ve saflaştırma tanımlamak için in-line ve post-run eluat analiz teknikleri yararlanın.
- GFP içeren numuneler için 397 nm de proteinin benzersiz UV absorbans kullanarak in-line elüsyon gözlemlemek. Göreceli ayrılması tahmin etmek izleme genel protein 280 nm absorbans izlemeyi GFP özgü 397 nm absorbans karşılaştırınve farklı HIC ortam olarak kullanılarak saflaştırma (Şekil 5) scouted.
- GFP ve diğer hedef proteinin post-çalıştırma analizi, çeşitli yöntemler vasıtasıyla gerçekleştirilebilir. 96-kuyulu plakalı fraksiyonlar 5-50 ul hacimde taze bir levhaya transfer edilir ve ELISA ve Western blot ile belirli bir protein içeriği için tahlil, ve her bir fraksiyonun toplam protein içeriğinin SDS-PAGE konvansiyonel veya bir kullanılarak analiz edilebilir edilebilir Experion mikroakışkan elektroforez sistemi. GFP flöresanı UV ışığı (Şekil 6) kullanılarak 12 mL kültür tüplerine tespit edilebilir.
- En umut verici HIC ortam tanımlanması örnek içinde bulunan diğer proteinleri göre GFP elüsyon karşılaştırılması ile tespit edilebilir. En umut verici HIC ortam ile saflaştırma sonra tipi ve başlangıç tamponu, pH konsantrasyonu da dahil olmak üzere diğer parametreler göre optimize edilebilir.
- Teknik not: Deneyin sonunda, (gazı Tampon B1 içine tüm giriş hatları yerleştirmekH 2 O) ve iyice su ile pompa, valf ve tüm boru durulayın. Kromatografi sistemi ve HIC sütun temizleme ve uzun süreli depolama için üreticilerin yönergeleri izleyin.
6. Temsilcisi Sonuçları:
Temsilci HIC tuzu gradyan, iletkenlik ve izcilik ishal sütun basmalı Şekil 4 'de verilmiştir. Gibi yüksek tuz tamponu hatları çizilen tampon yüzdesi ile ölçülen tuz konsantrasyonu (mavi çizgi), değişim HIC metodolojisi tipik bir örneğidir. Tuz konsantrasyonu azaldıkça, protein kolon elüt edilmesi için bağlanır. Gözlenen tuz konsantrasyonu karşılık İletkenlik (kırmızı çizgi), QuadTec ve UV dedektörleri takiben in-line hemen ölçülür. Tuz degrade ve iletkenlik iz arasında off-set sistemi aracılığıyla, tampon giriş yolculuk ve iletkenlik monitöre tampon için gerekli zamanı gösterir. Örnek çalışma, t boyuncao sistem basıncı (gri çizgi) ve pH değeri nispeten sabit kalır.
Şekil 5 sıralı HIC sütun izcilik parkurlarının kromatogramları gösterir. Toplam protein (A 280, mavi çizgi) ve GFP (A 397, yeşil hat) ve in-line algılama sırasıyla 280 nm ve 397 nm'de ışık absorbansı ölçülerek gerçekleştirilir. Bu, yaklaşık nispi bolluk ve GFP iki çizgi karşılaştırarak, her izcilik çalıştırmak için ayrılma mümkündür. GFP yakınlık ve elüsyon profiline farklı derecelerde değişiklik ile test HIC sütunlara bağlı. Gelecekte saflaştırılması için tercih edilen bir HIC kolon seçimi keskin GFP elüsyon tepe ve diğer proteinleri ile büyük ayrılma üretir sütunu tanımlayan dayanmaktadır.
Şekil 6, çalışma izcilik Kesirler 10, 12, 14, 16 ve Fenil FF (yüksek alt) 18 için kültür tüpleri ortam oda altında görüntülendi (floresan) hafif ve ultraviyole (UV) ışık. Tüpler karakteristik GFP emisyon spektrumunu gözlemek için iki yüz ileri (sol panel) ve yukarıdan aşağı (sağ panel) görüntülendi. GFP (yeşil) açıkça UV görüntüleri hem Kesir 14 saptanır. Bu post-run veriler de Yıkanan GFP büyük pik içeren olarak Kesir 14 tanımlayan 397 nm (A 397, yeşil hat), az eluat absorbans ölçümü ile YFP in-line algılama ile güzel gelir. Sol UV panelinde diffüz mavi ışık UV lamba yayılır.
Şekil 1.. Bu protokol şematik. Ilgi proteini içeren bakteri lizat (GFP, hedef protein), hazırlanan kromatografisi başlangıç tampon, bir yüksek tuz tamponu içinde seyreltilir eşdeğeri ve filtre edilir. Sıvı kromatografisi sistemi hazırlandıktan sonra, örnek olarak yüklenir ve hedef protein diğer proteinleri ayrılır i ihtivaBir kullanıma hazır HIC sütunu içinde bulunan bir hidrofobik kromatografi ortamı kullanılarak lizat n. Ayırma yöntemi ortam iyi GFP ayırma sağlar olduğunu belirlemek için, farklı medya kromatografisi (sütun izcilik olarak anılacaktır) kullanarak birkaç kez tekrarlanır. Yıkanan proteinleri (eluat) in-line kromatografi sistemi dahil dedektörleri kullanarak ve onu takip eden (post-run) analizi için küçük kesirler halinde toplanan analiz edilir. In-line ve post-run GFP faaliyeti analizi ve ayırma, optimum HIC sütun ve kromatografik orta dayanarak belirlenmiştir.
Tablo 1. Bu protokolde kullanılan anahtar kromatografi sistemi bileşenleri.
Şekil 2,. Kullanılan Bio-Rad Çift Geçişli orta basınçlı sıvı kromatografisi sisteminin diyagramı. Sy Anahtar özelliklerfraksiyone eluat sıralı sütun çalışmaları için örnek yükleme otomatik tampon karıştırma, farklı kromatografi sütun otomatik seçimi, eluat in-line analiz, ve tandem toplama dahil kaynaklanıyor. Detaylar için metin ve Tablo 1'e bakın.
HIC medya Tablo 2. Biyofiziksel özellikleri test edilmiştir. HiTrap HIC sütunun adı ligand, ligand yoğunluğu ve boncuk boyutu göstergesidir.
* FF = hızlı akış, HP = yüksek performans. Büyük boncuk boyutu ligand bağlama kapasitesi ve akış hızını arttırır. Daha küçük tanecik boyutları kromatografik çözünürlük artar. Üreticisi tarafından sağlanan bilgilerin literatürde türetilen.
Şekil 3. Bio-Rad Çift Geçişli system.To yukarı 1/4-28 Delrin fındık GE Healthcare HiTrap HIC sütun bağlantısınd Ferrül (A1), bir erkek Luer-kadın 1/4-28 uydurma (B1) ve erkek, 1/16 "-dişi Luer uydurma (C) bağlanır. parçaları olduktan sonra HiTrap sütun eklemek edilir tamponu ile yıkanır ve tüm kabarcıklar kaldırıldı sahip. kolon çıkışında, bir kadın 1/16 "-erkek M6 montaj (D) bağlı erkek Luer-için dişi M6 montaj (E) ve dişi Luer-kadın 1 / 4-28 uydurma (B 2). Tüm bu montaj aşağı 1/4-28 Kemik somunu ve halka (A 2) bağlanmıştır. Üst panel parçaları ayrılmış gösterir ve alt panel parçaları monte gösterir.
| # Adım | Hacim (mL) | Tanım | Parametreler | |
| 1 | 0.00 | Tüm çalışma sırasında 1.0 mL fraksiyonları toplayın | ||
| 2 | 0.00 | Switch Sütunlar | HIC Sütun 1 (Pozisyon 2) | |
| 3 | 0.00 | Izokratik Akış | pH: 6.80 % 100 B | Hacim: 2.00 ml Akış: 1.00 ml / dak |
| 4 | 2.00 | Sıfır Temel | QuadTec | |
| 5 | 2.00 | Sıfır Temel | UV Dedektörü | |
| 6 | 2.00 | Örnek enjekte | Örnek Yük Dinamik Döngü | Otomatik Vana enjekte Hacim: 0.50 ml Akış: 1.00 ml / dak |
| 7 | 3.00 | Izokratik Akış | pH: 6.80 % 100 B | Hacim: 5.00 ml Akış: 1.00 ml / dak |
| 8 | 8.00 | Gradient | pH: 6.80 % 100 B -> 0% B | Cilt: 10.00 ml Akış: 1.00 ml/ Dak |
| 9 | 18.00 | Izokratik Akış | pH: 6.80 0% B | Hacim: 3.00 ml Akış: 1.00 ml / dak |
| 10 | 21.00 | Izokratik Akış | pH: 6.80 % 100 B | Hacim: 5.00 ml Akış: 1.00 ml / dak |
| 11 | 26.00 | Anahtarı Sütunlar | Sendika (Pozisyon 1) | |
| Son | 26.00 | Protokol Sonu | 5 ek HIC sütunlar ile otomatik Tekrarlar (Pozisyonlar 3-7) | |
| Tipi Scout | Çalışır sayısı: 6 | Adımlar sayısı scouted: 1 | ||
Istihdam HIC izcilik yöntemi için Tablo 3. Biyolojik yazılım protokolü.
<img alt = "Şekil 4" src = "/ files/ftp_upload/3060/3060fig4.jpg" />
Şekil 4. Temsilcisi HIC tuz degrade, iletkenlik ve kolon basınç. Tuz konsantrasyonu (mavi çizgi) azaldıkça, iletkenlik (kırmızı çizgi) de yapar. Tuz degrade ve iletkenlik iz arasında off-set tampon girişinden iletkenlik monitörü seyahat için tampon için gerekli zamanı gösterir. Sistem basıncı (gri çizgi) izcilik çalışma süresi boyunca nispeten sabit kalır.
Sıralı HiTrap HIC sütunun Şekil 5. Derleyen kromatogramları çalışır izcilik. Toplam protein (A 280, mavi çizgi) ve GFP (A 397, yeşil hat) ve in-line algılama sırasıyla 280 nm ve 397 nm'de ışık absorbansı ölçülerek gerçekleştirilir. Deneylerin bu seride, keskin GFP elüsyon tepe Fenil FF (yüksek alt) c gözlendiolumn. Fenil FF (yüksek alt) sütunu da GFP ve diğer proteinler arasındaki en büyük ayrım sağlamak için ortaya çıktı. Ek 1 ml HiTrap HIC sütunlar (Fenil FF (düşük alt)), butil hızlı akış (butil FF), butil-S hızlı akış (butil-S FF) ve oktil hızlı akış (oktil FF) dahil Fenil hızlı akış düşük ikamesi test .
Şekil 6. Örnek eluat yılında GFP Temsilcisi post-run görselleştirme. Eluat fraksiyonlar 1/minute oranında toplandı ve her bir GFP içeriği açısından analiz edildi. Bu temsili resimde, çalışma izcilik Kesirler 10, 12, 14, 16 ve Fenil FF (yüksek alt) 18 için kültür tüpleri ortam oda (floresan) ışık ve ultraviyole (UV) ışık altında görüntülendi. Tüpler her iki yüzü-forward (sol panel) ve yukarıdan aşağı (sağ panel) görüntülendi. Sol UV panelinde diffüz mavi ışık UV lamba yayılır. GFP (yeşil) açıkça Frac algılandığındaUV görüntüleri hem TION 14. Üst panel toplam protein (A280, mavi çizgi) ve GFP (A 397, yeşil hat) görselleştirildiği olmanın 5 fraksiyonların kromatogram iz gösterir.
Discussion
Sıvı kromatografi teknikleri 7 biyokimyasal, immünolojik 6 yürütülmesi için gerekli olan yüksek derecede saflaştırılmış protein hazırlanması, ve yapısal 8 çalışmalar için çok değerli olduğu kanıtlanmıştır. HIC saflaştırma yöntemleri çoğunlukla tercih edilen ortamın ampirik belirlenmesi gerekir, ve ligand yapısı, ligand yoğunluğu, ve matris boncuk özellikleri her kromatografik sonuçlar 2, 3 etkisi gösterilmiştir. Izcilik Otomatik sütun sonraki optimizasyonu ve protein saflaştırma 4 için bir HIC orta seçilmesi için etkili bir yaklaşımdır. Sunulan otomatik sütun izcilik yöntemi kolaylıkla çeşitli HIC protein saflaştırma stratejileri adapte edilebilir. Tuz konsantrasyonu, tuz seçimi, tuz degrade ve pH değişiklikler ilave arıtma hastalıkları iyileştirebilir ve bu temel parametreleri değişen etkileri daha önce 13,14 gözden geçirilmiştir. Kısmen saflaştırılmış hedef prote içeren HIC eluatdaha da bu tür iyon değişimi kromatografisi (IEX) veya jel filtrasyonu / boyut harici kromatografi 9,10 olarak tamamlayıcı bir kromatografik tekniği kullanılarak saflaştırılabilir.
Çünkü eşsiz ışık absorbans ve emisyon karakteristikleri, GFP ile elüsyon profiline-line ve post-çalıştırma yaklaşımlar kullanılarak belirlenebilir. Bu amaçla, bu protokol daha da alakasız bir hedef protein GFP "tagged" olduğu, rekombinant GFP-füzyon proteinlerinin saflaştırılması için adapte edilebilir. GFP-etiketli hedef proteinin UV ışığı 11 ve yukarıda açıklanan HIC saflaştırma stratejisini içeren çeşitli kromatografik yaklaşımlar kullanılarak saflaştırıldı ile tespit edilebilir. GFP arıtma aynı zamanda modern protein bilimi teknikleri 12 öğretimi için biyokimya laboratuvarlarında pedagojik bir elyaf haline gelmiştir.
Temel HIC protein saflaştırılması bir ölçüde daha az sağlam kromatografisi sy kullanarak yürütülebilirkenKök, burada sunulan enstrümantasyon olumlu sonuçlar elde yardımcı olmak için farklı bir takım avantajları vardır. Son derece otomatik bir sistem kullanmanın önemli yararları çalıştırmak çalıştırılmaya koşulu tekrarlanabilirlik, zaman tasarrufu da geliştirilmiş ve sistem 10 içine verilmek üzere hava için fırsatlar azalma sayılabilir. Sistem arttıran kolaylaştırılır Sistemi kontrollü tampon karıştırma, tampon hazırlanması ve deneysel tekrarlanabilirlik artan tutarlılık sağlar. Tüm izcilik için dinamik örnek döngü içine yeterince örnek yük Çizim çalışan başka her sütun eklenmeden örnek uyum sağlar ve kesinti veya yeniden manuel olarak sıralı çalışmaları için izin verir. Sütun üzerine örnek loop kontrollü numune enjeksiyonu el ile örnek yükleme ile oluşabilir değişkenliği azalır. Sütun seçimi valf bir çift sistemi replumb gerek kalmadan, ardışık Örnek ishal, farklı bir HIC kolonu kullanılarak her biri için olanak sağlar. Mul Sahne eşsiz bir spektrofotometrik profil ile bir protein test edilmesinden sonra ti-dalgaboyu analizi özellikle faydalı olmaktadır. GFP ek olarak, sitokromlar, flavoproteins, ve diğer heme ihtiva eden proteinler Bu tekniğin yararlanabilir. İletkenlik ve pH izleme cihazları gerçek zamanlı deneysel koşullar doğrulanması için izin verir. Bölünmüş fraksiyonu eluat toplama geliştirilmiş fraksiyonu bir şekilde kullanılmasını sağlar ve minimal bir örnek hacmi (örneğin ELISA, SDS-PAGE, western blot ve Experion mikroakışkan elektroforezi) gerektiren post-run analiz yöntemleri için kolay aktarım sağlar. Ikinci fraksiyon toplayıcı çevrimdışı kullanma kılavuzu senkronizasyon gerektirir iken, fraksiyon toplayıcı seçimi maksimum esneklik sağlar. HIC izcilik sütun ve protein saflaştırma için böyle sağlam bir kromatografi sistemi kullanan için en önemli sakıncaları başlangıç zamanı ve aracı satın alma ve operatör eğitimi ile ilgili bütçe harcamaları içerir.
t "> Burada sunulan protokolü Bio-Rad Çift Geçişli kromatografi sistemi kullanır;. Ancak, bu tür GE Healthcare gelen Akta Avant diğer üreticilerin, eşit derecede sağlam enstrümantasyon da olabilir kullanıldığı ve eşdeğer sonuçlar üretmektedir bile karşılaştırılabilir kromatografi sistemi bir arınma prosedürü veya cihaz satın başlamadan önce düşünülmelidir benzersiz özellikleri (örneğin yöntemi programlama, bileşen adlandırma, operatör tercihi ve ölçeklenebilirlik sınırlamalar) var.Disclosures
Kromatografisi reaktifler seçin ve tamamlayıcı enstrümantasyon Bio-Rad tarafından sağlanmıştır.
Acknowledgments
Bu çalışma Sağlık hibe GM086822 ve Ulusal Bilim Vakfı başlıca araştırma enstrümantasyon hibe DBI-0.960.313 Ulusal Enstitüsü tarafından finanse edildi. Yazarlar Dr teşekkür etmek istiyorum. Jon Miyake ve Donna Hardy (Bio-Rad) ve teknik uzmanlık için Jennifer Loertscher (Seattle). Kromatografisi reaktifler seçin ve tamamlayıcı enstrümantasyon cömertçe Bio-Rad tarafından sağlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioLogic DuoFlow Pathfinder 20 System | Bio-Rad | 7602257 | Includes system maximizer, mixer, F10 workstation, AVR7-3 valve, QuadTec UV/Vis detector with flow cell, BioFrac fraction collector, BioLogic software, and starter kit |
| AVR9-8 stream-select valve | Bio-Rad | 7600408 | |
| Diverter valve SV3-2 | Bio-Rad | 7500410 | |
| Stream splitter valve | Bio-Rad | 7410017 | |
| DynaLoop 25 Kit | Bio-Rad | 7500451 | |
| BioFrac Fraction Collector | Bio-Rad | 7410002 | Two fraction collectors used |
| BioFrac microplate drop head adapter | Bio-Rad | 74010088 | |
| BioFrac microtiter plate adapter | Bio-Rad | 7410017 | |
| UV Optics Module | Bio-Rad | 7500202 | |
| Halogen lamp | Bio-Rad | 7601331 | |
| Econo Gradient Pump | Bio-Rad | 7319001 | |
| Experion System | Bio-Rad | 7007001 | |
| Experion Pro260 Analysis Kit | Bio-Rad | 7007102 | |
| HiTrap HIC column selection kit | GE Healthcare | 28-4110-07 | Includes 7 x 1 ml pre-packed columns of HIC media for scouting |
| GE Healthcare-to-Bio-Rad column fittings | GE Healthcare | 18111251 and 18111257 |
References
- Cummins, P. M., O'Connor, B. F. Hydrophobic interaction chromatography. Methods Mol. Biol. 681, 431-437 (2011).
- Nagrath, D., Xia, F., Cramer, S. M. Characterization and modeling of nonlinear hydrophobic interaction chromatographic systems. J. Chromatogr. A. 1218, 1219-1226 (2011).
- To, B. C., Lenhoff, A. M. Hydrophobic interaction chromatography of proteins. IV. Protein adsorption capacity and transport in preparative mode. J. Chromatogr. A. 1218, 427-440 (2011).
- Huddleston, J. G., Wang, R., Lyddiatt, A. On the use of mild hydrophobic interaction chromatography for "method scouting" protein purification strategies in aqueous two-phase systems: a study using model proteins. Biotechnol Bioeng. 44, 626-635 (1994).
- Arun, K. H., Kaul, C. L., Ramarao, P. Green fluorescent proteins in receptor research: an emerging tool for drug discovery. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 1-23 (2005).
- Terrizzi, S. C., Banh, C., Brossay, L.A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer. J. Vis. Exp. (35), e1701-e1701 (2010).
- Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone. J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).
- Zeytuni, N., Zarivach, R. Purification of the M. magneticum strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAΔ41. J. Vis. Exp. (37), 10-3791 (2010).
- Kong, Y., Li, X., Bai, G., Ma, G., Su, Z. An automatic system for multidimensional integrated protein chromatography. J. Chromatogr. A. 1217, 6898-6904 (2010).
- Camper, D. V., Viola, R. E. Fully automated protein purification. Anal. Biochem. 393, 176-181 (2009).
- Hammon, J., Palanivelu, D. V., Chen, J., Patel, C., Minor, D. L. A green fluorescent protein screen for identification of well-expressed membrane proteins from a cohort of extremophilic organisms. Protein Sci. 18, 121-133 (2009).
- Wu, Y. Using green and red fluorescent proteins to teach protein expression, purification, and crystallization. Biochem. Mol. Biol. Educ. 36, 43-54 (2008).
- Queiroz, J. A., Tomaz, C. T., Cabral, J. M. Hydrophobic interaction chromatography of proteins. J. Biotechnol. 87, 143-159 (2001).
- McCue, J. T. Theory and use of hydrophobic interaction chromatography in protein purification applications. Methods Enzymol. 463, 405-414 (2009).
