En pålitlig och användbar metod för att upptäcka histon ändringar på specifik anläggning gener beskrivs. Den metod som kombinerar kromatin immunoprecipitation (chip) och i realtid av kvantitativ PCR. Den tillåter detektion av histon modifieringar på specifika gener med en roll i olika fysiologiska processer.
Kromatinstrukturen är viktigt för reglering av genuttryck i eukaryoter. I denna process kromatin remodeling, DNA-metylering och kovalent ändringar på amino-terminal svansar av histoner H3 och H4 spela viktiga roller 1-2. H3 och H4 histon ändringar inkluderar metylering av lysin och arginin, acetylering av lysin och fosforyleringen av serin rester 1-2. Dessa ändringar är förknippade med antingen genaktivering, förtryck eller en primas tillstånd av genen som stöder snabbare och mer robust aktivering av uttryck efter uppfattning om lämpliga signaler (mikrob-associerade molekylära mönster, ljus, hormoner mm) 3-7.
Här presenterar vi en metod för tillförlitlig och känslig detektion av specifika kromatin ändringar på utvalda växter gener. Tekniken bygger på crosslinking av (modifierad) histoner och DNA med formaldehyd 8,9, utvinning och ultraljudsbehandling av kromatin, kromatin immunoprecipitation (chip) med modifikation antikroppar 9,10, de-crosslinking av histon-DNA-komplex, och genspecifika i realtid av kvantitativ PCR. Den metoden har visat sig användbara för att upptäcka specifika histon modifieringar i samband med C 4 fotosyntes i majs 5,11 och systemisk immunitet i Arabidopsis 3.
Mest kritiska stegen i protokollet är crosslinking av DNA och histoner, typ och mängd blad material, slipning av materialet, och sonication av kromatin. För en mer detaljerad diskussion om dessa frågor, se refs. 9 och 10.
Sonication och crosslinking:
Det är viktigt att störa kromatin under sonication till fragment av ca 400bp. Uttömmande sonication kommer att förstöra kromatin genom att störa DNA och histoner, medan otillräcklig ultraljudsbehandling lämnar långa kromatin fragment. Dessa påverkar särdragen i den metod, eftersom histon ändringar distala från den provade locus inte kan diskrimineras från lokala ändringar. Sonication verkningsgrad är bäst testas genom att samla 20μL kromatin från prover före och efter ultraljudsbehandling, de-crosslinking DNA och histoner, isolera DNA och bestämma längden på klippt DNA med agarosgelelektrofores. RNAse bör läggas till de prover innan elektrofores, eftersom kromatinet preparatet innehåller fortfarande stora mängder RNA i detta skede av rening som kan störa visualiseringen av fragmenterad DNA. Proverna är användbara för kromatin immunoprecipitation om DNA från icke klippt-kromatin är längre än 10kbp, medan DNA från klippt kromatin bildar ett utstryk med maximal signalstyrka runt 400bp av DNA.
Vi använder rutinmässigt 3% (v / v) formaldehyd för kromatin crosslinking i intakta blad, men 1% (v / v) formaldehyd vara tillräckligt i de flesta fall. I våra händer, låga formaldehyd halter möjliggöra kortare sonication tider och signaler bakgrund därav PCR-reaktioner. Men inte tillräckligt mängder av formaldehyd ofta resulterar i låg reproducerbarhet av PCR-signalen mellan oberoende försök. Det kan bero på otillräcklig penetration av blad med formaldehyd vid låga koncentrationer. Se till att byta din formaldehyd lager ofta som föreningen tenderar att polymerisera med tiden. Formaldehyd lösningar är stabila bara för cirka en månad, och denna period är knappast förlängas med metanol stabilisering. Det rekommenderas att testa olika formaldehyd koncentrationer när du ställer in experimentella förhållanden.
Mängden växtmaterial och slipning:
Det är viktigt att infiltrera små mängder av blad material i en stor buffert för att undvika att löv att hålla sig till varandra. Leaf fastnar ofta leder till otillräckliga infiltration av formaldehyd. Dessutom kommer för mycket växtmaterial blockera porerna i miracloth vävnad. Malningen effektivitet beror mycket på att använda en mortel med perfekt passform. Vi slipar rutinmässigt med ett flytande kväve-kyld mortel i avsaknad av ytterligare flytande kväve tre gånger under 50 sekunder tills materialet mals till ett fint pulver.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av det tyska Science Foundation (DFG) och Excellence initiativ av den tyska federala och statliga regeringar.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
Protein-A-Agarose | Roche | 11 134 515 001 | depends on the antibody class |
Protein-G-Agarose | Roche | 11 243 233 001 | depends on the antibody class |
Anti-hyperacetyl-H4 | Millipore | 06-946 | we used 5μL |
Anti-acetyl-H4K5 | Millipore | 07-327 | we used 5μL |
Anti-acetyl-H4K8 | Millipore | 07-328 | we used 5μL |
Anti-acetyl-H4K12 | Millipore | 07-595 | we used 5μL |
Anti-acetyl-H4K16 | Millipore | 07-329 | we used 5μL |
Anti-acetyl-H4K18 | Millipore | 07-354 | we used 1μL |
Anti-acetyl-H3K9 | Millipore | 07-352 | we used 5μL |
Anti-acetyl-H3K14 | Millipore | 07-353 | we used 1μL |
Anti-trimethyl-H3K4 | Diagenode | pAB-003-50 | we used 5μL |
Anti-dimethyl-H3K4 | Millipore | 07-030 | we used 5μL |
Anti-monomethyl-H3K4 | Abcam | ab8895 | 2,5 -10μL |
Anti-H3 | Abcam | ab1791 | we used 1μL to check histone density |
Bioruptor | Diagenode | UCD-200 TO | |
Sonotrode MS72 | Bandelin | ||
Miracloth | Calbiochem | 475855 | |
Complete Protease Inhibitor | Roche | 11836145001 |