Den dendrittiske arborization sensoriske nevroner av<em> Drosophila</em> Larve perifere nervesystemet er nyttige modeller for å belyse både generelle og neuron klasse-spesifikke mekanismer for neuron differensiering. Vi presenterer en praktisk guide til å generere og analysere dendrittiske arborization neuron genetisk mosaikk.
Nevrologiske utvikling krever korrekt spesifisering av neuron posisjon og identitet, etterfulgt av nøyaktig neuron klasse-spesifikke dendrittiske utvikling og aksonal ledninger. Nylig dendrittiske arborization (DA) sensoriske nevroner av Drosophila larve perifere nervesystemet (PNS) har blitt kraftig genetiske modeller i å belyse både generelle og klasse-spesifikke mekanismer for neuron differensiering. Det er fire hoved DA neuron klasser (I-IV) 1. De er navngitt i rekkefølge av økende dendrite arbor kompleksitet, og har klasse-spesifikke forskjeller i den genetiske kontroll av sine differensiering 2-10. DA sensoriske systemet er en praktisk modell for å undersøke de molekylære mekanismene bak kontroll av dendrittiske morfologi 11-13 fordi: 1) det kan dra nytte av kraftige genetiske verktøy tilgjengelig i bananflue, 2) DA nervecellen dendrite arbor sprer seg i kun to dimensjoner under en optisk CLEar larve cuticle gjør det enkelt å visualisere med høy oppløsning in vivo, 3) klasse-spesifikke mangfold i dendrittiske morfologi muliggjør en komparativ analyse for å finne nøkkelelementer kontrollere dannelsen av enkle vs svært forgrenede dendrittiske trær, og 4) dendrittiske arbor stereotype figurer av forskjellige DA nevroner lette morfometriske statistiske analyser.
DA neuron aktivitet endrer produksjonen av en larve bevegelse sentralt mønster generator 14-16. De ulike DA neuron klasser har forskjellige sensoriske modaliteter, og deres aktivisering utløser forskjellige atferdsmessige responser 14,16-20. Videre forskjellige klasser send aksonal prognoser stereotypically i Drosophila larve sentrale nervesystemet i ventrale nerve ledningen (VNC) 21. Disse prognosene avslutte med topografiske representasjoner av både DA neuron sensorisk modalitet og stillingen i kroppen veggen av dendrittiske feltet 7,22, 23. Derfor undersøkelse av DA aksonal projeksjoner kan brukes til å belyse mekanismene bak topografisk kartlegging 7,22,23, samt kabling av en enkel krets modulerende larve bevegelse 14-17.
Vi presenterer her en praktisk guide til å generere og analysere genetisk mosaikk 24 merking DA nevroner via MARCM (Mosaic Analysis med en Repressible Cell Marker) 1,10,25 og Flp-out 22,26,27 teknikker (oppsummert i fig. 1).
Den Drosophila larve DA neuron modellen gir en utmerket genetisk system for å undersøke mekanismer som styrer neuron morfologi og krets formasjon. MARCM er vanligvis brukt for merking og for generering mutant DA neuron kloner. For MARCM bruker vi enten en pan-nevrale (f.eks Gal4 c155) eller DA nevron-spesifikk driver. Ved hjelp av en pan-neural driver det er mulig å direkte bruke flere aksjer tilgjengelig fra offentlige lager sentre. Men ved hjelp av en DA-nevron bestemt driver ka…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Riken for finansiering. Vi takker også Cagri Yalgin, Caroline Delandre, og Jay Parrish for diskusjoner om genetisk og immunhistokjemi protokoller.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
SZX16 fluorescence dissection microscope (with GFPHQ filter) | Olympus | SZX16 | |
Live Insect Forceps | FST | 26030-10 | |
26mm x 76mm depression slide glass | Toshinriko Co. | T8-R004 | |
Sylgard 184 (or Silpot 184) | Dow Corning | 3097358-1004 | |
Poly-L-lysine | Sigma | P-1524 | This product has proven most effective |
DPX mounting medium | Sigma | 44581 | |
Rabbit anti-GFP | Invitrogen | A-11122 | Dilution 1:500 |
Rat anti-CD8 | Caltag | 5H10 | Dilution 1:200 |
Mouse anti-CD2 | AbD serotec | MCA443R | Dilution 1:700 |
Mouse anti-Fasciclin2 | DSHB | 1D4 | Dilution 1:10 |