Морфологический анализ Drosophila Личинок периферийных сенсорных дендритов нейронов и аксонов с использованием генетических Мозаики
Summary
Дендритные разветвление сенсорных нейронах<em> Drosophila</em> Личиночной периферической нервной системы, полезных моделей, чтобы выяснить как общие, так и нейронных класса конкретные механизмы дифференциации нейронов. Мы представляем практическое руководство для получения и анализа дендритных разветвление нейрона генетической мозаики.
Abstract
Нервная система развития требует правильной спецификации нейронов позиции и идентичность, а затем точным нейрона класса специфическое развитие дендритных и аксонального проводки. Недавно дендритных разветвление (DA) сенсорных нейронов дрозофилы личиночной периферической нервной системы (ПНС) стали мощным генетических моделей, в которых выяснить как общие, так и класс-специфические механизмы дифференциации нейронов. Существуют четыре основных Д. А. нейрона классов (I-IV) 1. Они названы в порядке возрастания сложности дендритные беседка, и классовые различия в генетическом контроле их дифференциация 2-10. Д. А. сенсорные системы практическую модель для исследования молекулярных механизмов контроля за морфологию дендритных 11-13, потому что: 1) он может воспользоваться мощным генетических инструментов, доступных в плодовой мушки, 2) Д. А. нейрона дендритов беседка распространяется только в 2 размерах под оптически CLEар личиночной кутикулы что позволяет с легкостью визуализировать с высоким разрешением в естественных условиях, 3) класса видового разнообразия в дендритные морфологии облегчает сравнительный анализ, чтобы найти ключевые элементы управления образования простых по сравнению с сильно разветвленными дендритных деревьев, и 4) дендритных беседки стереотипных формы различных нейронов Д. облегчить морфометрических статистического анализа.
Д. А. нейронной активности изменяет вывод личиночной передвижения центральный генератор шаблона 14-16. Различных DA нейронов классов имеют различные сенсорные модальности, и их активация вызывает различные поведенческие реакции 14,16-20. Кроме различных классов отправить аксонального прогнозы стереотипно в дрозофилы личиночной центральной нервной системы в брюшной нервной цепочки (VNC) 21. Эти прогнозы прекратить с топографической представления как DA нейронов сенсорной модальности и положение в теле стены дендритных поле 7,22, 23. Следовательно, изучение Д. А. аксонального прогнозы могут быть использованы для выяснения механизмов, лежащих топографических карт 7,22,23, а также подключение простую схему модуляции передвижения личиночной 14-17.
Мы приведем здесь практическое руководство для получения и анализа генетической мозаики 24 Маркировка DA нейронов через MARCM (Мозаика Анализ с репрессируемый Маркер Cell) 1,10,25 и FLP-22,26,27 из методов (представлены на рис. 1).
Protocol
Discussion
Дрозофилы личиночной Д. А. нейрона модель обеспечивает один прекрасный генетическая система для исследования механизмов, которые управляют морфологии нейронов и схемы формирования. MARCM обычно используется для маркировки и для создания мутанта Д. А. нейрона клонов. Для MARCM мы испол…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность RIKEN для финансирования. Мы также благодарим Cagri Yalgin, Кэролайн Delandre, и Джей Пэрриш для обсуждения вопроса о генетических и иммуногистохимических протоколов.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| SZX16 fluorescence dissection microscope (with GFPHQ filter) | Olympus | SZX16 | |
| Live Insect Forceps | FST | 26030-10 | |
| 26mm x 76mm depression slide glass | Toshinriko Co. | T8-R004 | |
| Sylgard 184 (or Silpot 184) | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P-1524 | This product has proven most effective |
| DPX mounting medium | Sigma | 44581 | |
| Rabbit anti-GFP | Invitrogen | A-11122 | Dilution 1:500 |
| Rat anti-CD8 | Caltag | 5H10 | Dilution 1:200 |
| Mouse anti-CD2 | AbD serotec | MCA443R | Dilution 1:700 |
| Mouse anti-Fasciclin2 | DSHB | 1D4 | Dilution 1:10 |
References
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
- Crozatier, M., Vincent, A. Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier. Dev Biol. 315, 232-242 (2008).
- Hattori, Y., Sugimura, K., Uemura, T. Selective expression of Knot/Collier, a transcriptional regulator of the EBF/Olf-1 family, endows the Drosophila sensory system with neuronal class-specific elaborated dendritic patterns. Genes Cells. 12, 1011-1022 (2007).
- Jinushi-Nakao, S. Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56, 963-978 (2007).
- Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt. Neuron. 43, 809-822 (2004).
- Li, W., Wang, F., Menut, L., Gao, F. B. BTB/POZ-zinc finger protein abrupt suppresses dendritic branching in a neuronal subtype-specific and dosage-dependent. 43, 823-834 (2004).
- Zlatic, M., Landgraf, M., Bate, M. Genetic specification of axonal arbors: atonal regulates robo3 to position terminal branches in the Drosophila nervous system. Neuron. 37, 41-51 (2003).
- Grueber, W. B., Ye, B., Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Dendrites of distinct classes of Drosophila sensory neurons show different capacities for homotypic repulsion. Curr Biol. 13, 618-626 (2003).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons. Cell. 112, 805-818 (2003).
- Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology. Science. 297, 1355-1358 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Moore, A. W. Intrinsic mechanisms to define neuron class-specific dendrite arbor morphology. Cell Adh. Migr. 2, 81-82 (2008).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Mol. Cell. Neurosci. 35, 383-396 (2007).
- Nishimura, Y. Selection of Behaviors and Segmental Coordination During Larval Locomotion Is Disrupted by Nuclear Polyglutamine Inclusions in a New Drosophila Huntington’s Disease-Like Model. J Neurogenet. 24, 194-206 (2010).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 5199-5204 (2007).
- Hwang, R. Y. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr Biol. 17, 2105-2116 (2007).
- Xiang, Y. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468, 921-926 (2010).
- Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The role of the TRP channel NompC in Drosophila larval and adult locomotion. Neuron. 67, 373-380 (2010).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19, 799-806 (2009).
- Hafer, N., Schedl, P. Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (1), e85-e85 (2006).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Merritt, D. J., Whitington, P. M. Central projections of sensory neurons in the Drosophila embryo correlate with sensory modality, soma position, and proneural gene function. J Neurosci. 15, 1755-1767 (1995).
- Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130, 5065-5072 (2003).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Wong, A. M., Wang, J. W., Axel, R. Spatial representation of the glomerular map in the Drosophila protocerebrum. Cell. 109, 229-241 (2002).
- Shimono, K. Multidendritic sensory neurons in the adult Drosophila abdomen: origins, dendritic morphology, and segment- and age-dependent programmed cell death. Neural Dev. 4, 37-37 (2009).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18, 377-402 (2004).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. . Drosophila Protocols. , (2000).
- Kaczynski, T. J., Gunawardena, S. Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (46), e2150-e2150 (2010).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. J Vis Exp. , (2009).
- Medina, P. M., Swick, L. L., Andersen, R., Blalock, Z., Brenman, J. E. A novel forward genetic screen for identifying mutations affecting larval neuronal dendrite development in Drosophila melanogaster. Genetics. 172, 2325-2335 (2006).
- Mirouse, V., Swick, L. L., Kazgan, N., St Johnston, D., Brenman, J. E. LKB1 and AMPK maintain epithelial cell polarity under energetic stress. J Cell Biol. 177, 387-392 (2007).
- Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. 25, e1108-e1108 (2009).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Sugimura, K. Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons. J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).
- Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22, 719-729 (1999).
- Landgraf, M., Sanchez-Soriano, N., Technau, G. M., Urban, J., Prokop, A. Charting the Drosophila neuropile: a strategy for the standardised characterisation of genetically amenable neurites. Dev Biol. 260, 207-225 (2003).
