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Medicine

Cardiac Arrest normotérmica e Ressuscitação Cardiopulmonar: um modelo do rato de isquemia-reperfusão

doi: 10.3791/3116 Published: August 30, 2011

Summary

Um modelo poderoso para perioperatório e crítica lesão renal aguda relacionada com o cuidado é apresentado. Usando hipoperfusão corpo inteiro induzida por parada cardíaca é possível a quase replicar as alterações histológicas e funcionais do AKI clínico.

Abstract

Lesão renal aguda (LRA) é uma comum, altamente letal, complicação de doença grave que tem uma alta mortalidade 1-4 e que é mais frequentemente causada por hipoperfusão de corpo inteiro. 5,6 reprodução bem sucedida de hipoperfusão de corpo inteiro em modelos de roedores foi repleto de dificuldades. 7-9,9,10 Modelos que empregam isquemia focal têm repetidamente demonstrado resultados que não se traduzem em ambiente clínico, e modelos maiores animais que permitem a toda a falta de acesso corpo hipoperfusão para o conjunto de ferramentas completo de manipulação genética possível no mouse. 11,12 No entanto, nos últimos anos um modelo do rato de parada cardíaca e reanimação cardiopulmonar surgiu o que pode ser adaptado para o modelo de LRA. 13 Este modelo reproduz de forma confiável fisiológicas, os resultados funcionais, anatômicos e histológicos observados em clínica AKI , é rapidamente repetitivo, e oferece todas as vantagens de um modelo murino cirúrgico, incluindo o acesso a técnicas de manipulação genética, relativo baixo custo para grandes animais, e facilidade de uso. Nosso grupo tem desenvolvido uma vasta experiência com o uso deste modelo para avaliar uma série de órgãos específicos resultados em AKI 14,15.

Protocol

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Todos os procedimentos descritos são conduzidos de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde as orientações para o cuidado e uso de animais em pesquisa e todos os protocolos de animais foram aprovadas pelo Oregon Health & Science University Animal Care Institucional e Comitê de uso.

1. Preparação cirúrgica

  1. Pesar o mouse. O procedimento descrito é realizado em camundongos C57BL / 6 com peso entre 20 e 25 g. A anestesia é induzida em uma caixa de indução usando isoflurano 3-4% e, posteriormente, mantido usando 1,5-2,5% de isoflurano no ar / oxigênio mistura.
  2. Lubrificar os olhos e posição supina o animal em uma almofada de aquecimento. Imobilizar quatro extremidades com fita. As patas traseiras podem ser gravadas, em uma posição neutra, no entanto, o patas dianteiras devem ser protegidos, tão perto da parede torácica quanto possível para permitir excursão parede cheia no peito durante as compressões torácicas.
  3. Lubrificar e colocar um sensor de temperatura retal. A temperatura é controlada usando uma almofada de aquecimento e uma lâmpada ligada a um controlador eletrônico de temperatura (Digi-Sense, Cole Parmer, Vernon Hills IL), que é ajustada para manter a 37,0 ° C. Porque é possível que um gradiente de temperatura dentro do animal pode desenvolver durante o estado de ausência de fluxo, é importante que a temperatura ser medidos e controlados perto do órgão de interesse.
  4. Intubar a traquéia usando um 2,5 cm 22 ga cateter de teflon (INSYTE-W, BD, Franklin NJ) ea extremidade cortada distal de um introdutor angular (Frova Introducer, Cook Medical, Bloomington IN). Outros métodos de intubação traqueal são aceitáveis, porém, o uso do introdutor angular permite um posicionamento adequado do pescoço em uma posição ligeiramente alargado, o que otimiza a exposição cirúrgica para a colocação do cateter intravenosa. O cubo de cateter traqueal é presa com um laço de sutura para o incisivo e mantido com uma leve tensão para imobilizar a cabeça durante as compressões torácicas.
  5. Mecanicamente ventilar o mouse com um ventilador de roedores ajustado para 140 mL, 150 respirações / minuto. Isto não é ajustada para o peso que este protocolo é sempre realizada em 20-25 g animais. Não excesso de aprofundar a anestesia. Não defina o ventilador para aplicar pressão expiratória final como este prejudica a reanimação.
  6. Utilizando uma técnica estéril e um microscópio cirúrgico, coloque uma pré-lavada PE-10 cateter na veia jugular. Ambos os lados podem ser usados, mas o uso do lado mais próximo ao operador reduz a chance de deslocamento do cateter durante as compressões no peito ou outras manipulações. 0,5% bupivicaine, 0,1 mL é infitrated em bordas da ferida para controlar a dor pós-operatória.
  7. Garantir a PE-10 cateter no fechamento da pele com adesivo cirúrgico de cianoacrilato.
  8. Colocação de eletrodos de ECG subcutâneo e se conectar ao dispositivo de monitoramento. Muita atenção ao caminho do sinal e maximização do sinal em si é fundamental para o sucesso da reanimação. Garantir que todos os fios são fixados para a superfície de funcionamento, minimizar cruzamentos de sinal, e minimizar os isoladores (como o ar em agulhas ocas ou fio flexível) dentro do percurso do sinal. Agulhas sólido ligado a cabo nonstranded pode ser comprado ou feito em laboratório. Uma vez conectado, otimizar o sinal de ECG no monitor.

2. Parada cardíaca

  1. Garantir que o mouse é normotérmica, definida como temperatura retal 36,5 º C - 37,5 ° C. Administrar 40 mL de cloreto de potássio à temperatura ambiente 0,5 M por via intravenosa e observar isoelétrico rastreamento no ECG. Ajuste da dose para o peso não é necessária dentro da faixa de 20-25 g. Iniciar o temporizador de prisão.
  2. Desligue o ventilador. Descontinuar o vapor anestésico. Desligar o aquecimento almofada e qualquer outro equipamento que produz ruídos eletrônicos que possam interferir com a monitorização do ECG. Coloque um cobertor isolante sobre o mouse.
  3. Temperatura recorde a cada minuto durante a parada cardíaca. Se necessário, uma lâmpada de aquecimento pode ser usado para trazer temperatura central até a faixa normotérmica. Durante a parada cardíaca, preparar material e equipamento (por exemplo, a seringa de adrenalina) para a ressuscitação. A lista pode ser útil para garantir a reanimação ininterrupto, o que é essencial para a sobrevivência.
  4. Depois de 7 minutos e 30 segundos de parada cardíaca, volte a ligar o ventilador e aumentar a taxa de 180 ciclos / min, mantendo o volume corrente com a configuração pré-parada.
  5. Aos 8 minutos, iniciar as compressões torácicas em 300 BPM. Artefato de movimento no ECG podem ser usados ​​para julgar taxa de CPR. Compressões torácicas devem ser entregues com o dedo indicador, 5 mm acima do apêndice xifóide e ligeiramente à esquerda da linha média. O peito deve ser comprimido 1/3-1/2 da distância ântero-posterior e recolhimento integral deve ser permitido entre as compressões. Posicionamento dos dedos e da pressão de compressão ideal são absolutamente críticos. Incapacidade de alcançar a sobrevivência neste modelo é quase sempre devido a suboptimal CPR.
  6. Infundir 0,5 ml de adrenalina, diluída a 15 mcg / mL, nos primeiros 30 segundos de CPR. Dose de adrenalina total é de 8-12 mg. Observar atentamente o ECG para o retorno da circulação espontânea (RCE). Estreitas complexos QRS são vistos entre os artefatos de compressão. ROSC geralmente ocorre entre 90 segundos e dois minutos após o início do CPR. Ressuscitação é abandonado se ROSC não ocorre por 3 minutos. Freqüentes contrações ventriculares e alterações no eletrocardiograma eixo são observados nos primeiros 2 minutos após ROSC, e quase sempre resolver em taquicardia sinusal estável em 2 minutos.
  7. Registro de tempo total de ressuscitação e dose de adrenalina. Temperatura recorde a cada minuto durante 10 minutos após ROSC.
  8. Leva EKG pode ser removida quando a respiração espontânea começa, geralmente dentro de 12-15 minutos após ROSC.
  9. Extubação da traquéia quando a freqüência respiratória espontânea é> 60/min.
  10. Posicione o mouse em uma gaiola de recuperação em uma superfície de temperatura controlada definido para 37 ° C para o primeiro pós-procedimento horas 2, garantindo acesso fácil a alimentos e água. A gaiola pode então ser movido a norma condições de moradia no pós-operatório quando o mouse está completamente recuperado da anestesia e está ativo.

3. Exsanguination / Perfusão Fixação e Colheita Kidney

  1. 24h após CA / CPR, induzir a anestesia com isoflurano 3-4% e seguro do animal em decúbito dorsal sobre uma superfície cirúrgica dentro de um exaustor que é apropriado para uso com formol ..
  2. Aprofundar a anestesia por aumento gradual da concentração de vapor anestésico para 5% e garantir o mouse está profundamente anestesiados como evidenciado pela cessação da respiração espontânea.
  3. Realizar uma toracotomia clamshell e desangrar o mouse por punção apical do ventrículo esquerdo cardíaco de acordo com técnicas padrão.
  4. Através da mesma agulha, administrar 0,9% por infusão lenta. Para acclerate perfusão / exsanguinação, nick aurícula direita com uma tesoura. Realizar uma laparotomia e observar os rins. Quando são branqueados, soro fisiológico pode ser alterado para 4% de formol para fixação. Rins são então incluídos em parafina e corados com Fluoro Jade-B para a quantificação da necrose do epitélio tubular.

4. Resultados representativos:

CA quando é induzida, pressão arterial média (MAP) e regionais do fluxo sanguíneo renal gota (RRBCF) para perto de zero e permanecerá estável até a reanimação começa (Figura 1). 24h após CA / CPR, índices séricos de função renal (uréia, uréia e creatinina) estão significativamente elevados em relação ao sham-operado animais. AST / ALT também são elevados, oferecendo evidências de isquemia de corpo inteiro profunda (Figura 2). Neutrófilos gelatinase associados lipocalina (NGAL), um indicador sensível de lesão isquêmica renal é maciçamente 24h upregulated após CA / CPR (Figura 3). Finalmente, fotomicrografias demonstram a necrose, patchy medular típico de lesão renal isquêmica com afinamento do epitélio tubular e preenchimento luminal em hematoxilina e eosina (Figura 4, painel A) e morte celular no epitélio tubular extensa medular quando corados com fluoro-jade B ( Figura 4, painel b).

Figura 1
Figura 1. Parada cardíaca induz a perda instantânea de pressão de perfusão, representada aqui como a pressão arterial média (MAP), medido na artéria femoral, resultando em quase completa cessação do fluxo sangüíneo regional renal cortical (RRCBF) durante todo o período de parada cardíaca (sombreado área). Ressuscitação com compressões torácicas e retorna epinefrina MAP ao normal e RRCBF constante sobe no período pós ressuscitação. Reproduzido com permissão da 14.

Figura 2
Figura 2. 24h pós-procedimento, uréia (BUN), creatinina sérica, ea extensão da morte celular tubular são significativamente elevados nos animais submetidos a CA / CPR, em comparação com os animais tratados com um procedimento simulado. CA / CPR induz um insulto pan-organismal isquêmica, aqui evidenciada pela elevação do maciço de função hepática enzimas alanina amino transferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) no CA / CPR ratos em comparação com animais tratados com sham.

Figura 3
Figura 3. Western blot realizado com anticorpos policlonais para gelatinase de neutrófilos associada lipocalina (NGAL), um indicador sensível de lesão isquêmica renal. Amostras de urina foram obtidas imediatamente antes ("pre") e 24 horas depois ("24 horas") CA / CPR em 4 animais (rotulado a, b, c, d e acima). NGAL é maciçamente upregulated em ratourina após CA / CPR. Reproduzido com permissão da 14.

Figura 4
Figura 4. A) Hematoxilina e eosina de uma pequena seção de eixo hilar 24h tecido renal após CA / CPR. Há dano irregular, mas claro para medular e corticomedular túbulos com tubular entupimento. Setas apontam para túbulos danificado com núcleos, inchada picnóticos na junção córtico-medular. B) Flouro-jade B mancha de uma mesma região no mesmo animal, 24h após CA / CPR. Manchas Fluoro-jade B células necróticas verde brilhante, mostrando necrose corticomedular irregular tubular. Setas apontam para brilhantemente coradas túbulos danificada na junção córtico-medular. Essas descobertas são substancialmente similares aos achados de biópsia renal de humanos que desenvolvem AKI, e ao contrário daqueles produzidos por outros modelos animais de lesão renal aguda.

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Discussion

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O modelo normotérmica de parada cardíaca e ressuscitação cardiopulmonar em camundongos oferece caminhos múltiplos de avaliação em um modelo que reproduz a fisiopatologia e morfologia da causa clínica mais comum da AKI, de corpo inteiro hipoperfusão. Teste de hipóteses pode ser coadjuvado por acesso a uma panóplia de técnicas de manipulação genética e anatomia bem compreendido e caracterizado e fisiologia do rato de laboratório.

Como descrito aqui, a sobrevivência em mãos experientes é de 80%. Embora o preparo cirúrgico e pós-prisão cuidados são simples, a reanimação real de um rato preso é uma habilidade desafiadora cirúrgica que requer prática significativa. Em nossa experiência, bem sucedida ressuscitações se tornar a norma, após as primeiras tentativas de 30-50 ressuscitar animais individuais por um cirurgião inexperiente, e ferimentos consistentes e reanimação ter prática adicional. Em particular, durante a fase inicial de aprendizagem da técnica (ie, para os primeiros 20 animais), a sobrevida significativa é improvável, e todos os sobreviventes devem ser sacrificados imediatamente após a reanimação para evitar sofrimento desnecessário. Após o treinamento inicial, quando os sobreviventes demonstram recuperação cardíaca vigorosa nos minutos seguintes ressuscitação, é adequado para continuar sobrevivendo animais através da marca 15 minutos pós-ROSC. Animais que demonstram vigorosos esforços respiratórios espontâneos por esse ponto provavelmente vai sobreviver 24 horas com recuperação adequada. Esta fase prática deve ser especificamente abordados em protocolos IACUC. A habilidade mais difícil de aprender é a compressões torácicas-se como é difícil entregar compressões na taxa necessária, sem aumentar a pressão para níveis prejudiciais. Ressuscitadores mecânicos foram criados e usados ​​em nosso laboratório e outros 16, mas até à data não ressuscitador mecânico para o mouse produziu sobrevivência aceitável.

Existem algumas limitações para este modelo. Primeiro, nenhum modelo de camundongo pode inteiramente modelo de fisiologia humana, e os resultados devem ser interpretados com respeito pela diferenças entre espécies. Em particular, o coração do mouse é robusto, nós atingir 80% de sobrevivência em 8 minutos de parada cardíaca, mas em estudos clínicos a sobrevivência humana é inferior a 50% mesmo com a reanimação início de 2-3 minutos após a prisão de 17 O pequeno tamanho do mouse. torna procedimentos tecnicamente exigentes, e há uma curva de aprendizagem significativa, particularmente para as compressões torácicas. Em segundo lugar, neste protocolo, doses de drogas e ajustes do ventilador não são indexados ao peso do animal. Isto é porque nós usamos apenas os animais na faixa de 20-25 g de peso, a fim de minimizar o efeito do tamanho do equipamento. Por exemplo, usamos um cateter calibre 22 a intubação traqueal; o selo obtido não é o mesmo em um rato g 30 como ele está em um rato g 25 e aumentou o vazamento de gás pode ser fisiologicamente significativas. No entanto, o uso de animais em uma faixa de peso definida não reproduzem fielmente a variedade de classes de corpo que são sujeitas a isquemia e reperfusão clínico. Terceiro, o Estado não-fluxo pode não reproduzir fielmente os resultados de estados de baixo fluxo. Em particular, gradientes de temperatura podem se desenvolver dentro do mouse durante ausência de fluxo. Para minimizar o efeito (se houver) de gradientes nos resultados, a temperatura é medida próximo do órgão de interesse. Finalmente, por causa dos dados iniciais do nosso laboratório, que confirmou a acidose metabólica significativa na postarrest período, hiperventilar durante a reanimação. Como os dados recentes indicam que a hiperventilação durante a RCP é deletéria, 18,19 é possível que esta prática reduz a sobrevivência do modelo. Muitos modelos alternativas para todo o corpo lesão de reperfusão de isquemia existe. Por exemplo, CA / CPR tem sido descrita em cães, 20 coelhos, 21 cordeiros, 22 porcos, 23 ratos, 16 e esquilos do Ártico. 24

Nós mostramos que a função renal pós-operatória pode ser avaliada por um número de produtos químicos, imunológicos, ou técnicas histológicas menos 24 horas. Os animais podem ser sobreviveu por mais de 24h, porém, ea natureza transitória da AKI faz com que este modelo um atrativo a ser usado para investigação dos mecanismos de recuperação e / ou ferimentos permanentes. A lesão em si é titulável, alterando os parâmetros de tempo e temperatura durante o CA. Mais prisões e manutenção de temperaturas mais altas produzem maior lesão (mas negativamente a sobrevivência efeito). Como temos mostrado com os dados incluídos função do fígado, outros órgãos também são afetados e podem ser investigadas utilizando adaptações do modelo, no entanto, um esforço significativo pode ser necessária para otimizar as condições experimentais para o sistema de órgãos de interesse.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potassium Chloride Abbott Laboratories 06653-5
Isoflurane Abbott Laboratories 05260-05 (and others)
Epinephrine HCl Multiple Suppliers Multiple
Digi-Sense temperature controller Cole-Parmer EW-89000-00
Angiocath IV Cath VWR international 381134
Frova angled airway introducer Cook G27282
MicroVent Ventilator for Mice Harvard Apparatus 733591

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References

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Hutchens, M. P., Traystman, R. J., Fujiyoshi, T., Nakayama, S., Herson, P. S. Normothermic Cardiac Arrest and Cardiopulmonary Resuscitation: A Mouse Model of Ischemia-Reperfusion Injury. J. Vis. Exp. (54), e3116, doi:10.3791/3116 (2011).More

Hutchens, M. P., Traystman, R. J., Fujiyoshi, T., Nakayama, S., Herson, P. S. Normothermic Cardiac Arrest and Cardiopulmonary Resuscitation: A Mouse Model of Ischemia-Reperfusion Injury. J. Vis. Exp. (54), e3116, doi:10.3791/3116 (2011).

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