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Medicine

Normotermico arresto cardiaco e rianimazione cardiopolmonare: un modello murino di ischemia-riperfusione

doi: 10.3791/3116 Published: August 30, 2011

Summary

Un modello potente per perioperatoria e critica lesioni legate ai reni per acuti è presentato. Utilizzando tutto il corpo ipoperfusione indotta da arresto cardiaco è possibile replicare quasi alterazioni istologiche e funzionali del clinico AKI.

Abstract

Danno renale acuto (AKI) è un comune, altamente letale, complicazione di malattia critica che ha un alto tasso di mortalità 1-4 e che è più frequentemente causata da tutto il corpo ipoperfusione. 5,6 riproduzione di successo di tutto il corpo ipoperfusione in modelli di roditori è stato irto di difficoltà. 7-9,9,10 modelle che impiegano ischemia focale hanno ripetutamente dimostrato che i risultati non si traducono in ambito clinico, e in modelli animali più grandi che permettono di accedere a tutta la mancanza ipoperfusione corpo al set di strumenti completo di manipolazione genetica possibile nel topo. 11,12 Tuttavia, negli ultimi anni un modello murino di arresto cardiaco e rianimazione cardiopolmonare è emerso che possono essere adattati a modello AKI. 13 Questo modello riproduce affidabile fisiologico, risultati funzionali, anatomiche e istologiche visto in clinica AKI , si sta rapidamente ripetibile, e offre tutti i vantaggi di un modello murino chirurgico, compreso l'accesso alle tecniche di manipolazione genetica, relativamente a basso costo per grandi animali, e facilità d'uso. Il nostro gruppo ha sviluppato una vasta esperienza con l'utilizzo di questo modello per valutare una serie di organo-specifici risultati di AKI. 14,15

Protocol

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Tutte le procedure descritte sono condotte in conformità con gli Istituti Nazionali di Sanità le linee guida per la cura e l'uso di animali nella ricerca e tutti i protocolli di animali sono stati approvati dalla Oregon Health & Science Animal Care dell'Università e del Comitato Istituzionale Usa.

1. Preparazione chirurgica

  1. Pesare il mouse. La procedura descritta viene eseguita su topi C57BL / 6 di peso compreso tra 20 e 25 g. L'anestesia viene indotta in una scatola di induzione con isofluorano 3-4%, e poi mantenuto con 1,5-2,5% isoflurano in aria / ossigeno miscela.
  2. Lubrificare gli occhi e la posizione supina animale su una piastra elettrica. Immobilizzare 4 estremità con del nastro. Le zampe posteriori può essere registrato in una posizione neutrale, invece, le zampe anteriori dovrebbero essere protetti il ​​più vicino alla parete toracica possibile per permettere una completa escursione della parete toracica durante le compressioni toraciche.
  3. Lubrificare e posizionare una sonda rettale della temperatura. Temperatura è controllata tramite una piastra elettrica e lampada collegata ad un regolatore di temperatura elettronico (Digi-Sense, Cole Parmer, Vernon Hills IL), che è destinata a mantenere 37.0 ° C. Poiché è possibile che un gradiente di temperatura all'interno l'animale potrebbe sviluppare nel corso della no-flusso di Stato, è importante che la temperatura essere misurati e controllati presso l'organo di interesse.
  4. Intubare la trachea con un 22 cm 2.5 ga catetere in teflon (Insyte-W, BD, Franklin NJ) e la fine taglio distale di un introduttore angolata (Frova introduttore, Cook Medical, Bloomington IN). Altri metodi di intubazione tracheale sono accettabili, tuttavia, l'uso del introduttore angolato permette il corretto posizionamento del collo in una posizione leggermente esteso, che ottimizza l'esposizione chirurgica per il posizionamento del catetere endovenoso. Il mozzo catetere endotracheale è fissato con un anello di sutura al incisivo e mantenuto con leggera tensione per immobilizzare la testa durante le compressioni toraciche.
  5. Ventilare meccanicamente il mouse con un ventilatore roditore insieme a 140 microlitri, 150 r / minuto. Questo non è corretto per il peso che questo protocollo è sempre eseguita in 20-25 g di animali. Non troppo approfondire l'anestesia. Non impostare il ventilatore per applicare pressione espiratoria finale come questo danneggia la rianimazione.
  6. Usando la tecnica sterile ed un microscopio operatorio, posto un pre-lavati PE-10 catetere nella vena giugulare. Entrambi i lati possono essere utilizzati, ma l'utilizzo del lato più vicino all'operatore riduce il rischio di dislocazione del catetere durante compressioni toraciche o altre manipolazioni. 0,5% bupivicaine, 0,1 ml è infitrated in lembi della ferita per il controllo del dolore postoperatorio.
  7. Fissare il PE-10 catetere nella chiusura della cute con cianoacrilato adesivo chirurgico.
  8. Luogo elettrodi ECG sottocutaneo e collegarsi al dispositivo di monitoraggio. Una grande attenzione al percorso del segnale e la massimizzazione del segnale stesso è fondamentale per il successo della rianimazione. Garantire che tutti i cavi siano fissati alla superficie operativa, ridurre al minimo segnale di incroci, e minimizzare isolanti (come l'aria in aghi cavi o fili intrecciati) all'interno del percorso del segnale. Aghi solido collegato al cavo nonstranded possono essere acquistati o fatti in laboratorio. Una volta collegato, di ottimizzare il segnale ECG sul monitor.

2. Arresto cardiaco

  1. Assicurarsi che il mouse è normotermico, definita come temperatura rettale 36,5 ° C - 37,5 ° C. Somministrare 40 ml di temperatura ambiente 0,5 M di cloruro di potassio per via endovenosa e osservare isoelettrico analisi su ECG. Aggiustamento della dose di peso non è necessario, entro la gamma di 20-25 g. Avvio timer arresto.
  2. Staccare il respiratore. Interrompere il vapore anestetico. Spegnere la piastra elettrica e di qualsiasi altra attrezzatura che produce rumore elettronico che possono interferire con il monitoraggio ECG. Mettere una coperta isolante al posto del mouse.
  3. Record di temperatura ogni minuto durante l'arresto cardiaco. Se necessario, una lampada di riscaldamento può essere utilizzato per portare la temperatura interna fino alla gamma normotermico. Durante l'arresto cardiaco, preparare forniture e attrezzature (ad esempio, la siringa di epinefrina) per la rianimazione. Una lista di controllo può essere utile per garantire la rianimazione ininterrotta, che è essenziale per la sopravvivenza.
  4. Dopo 7 minuti, 30 secondi di arresto cardiaco, ricollegare il ventilatore e aumentare la velocità a 180 atti / min, mantenendo il volume corrente al pre-arresto impostazione.
  5. A 8 minuti, iniziare le compressioni toraciche a 300 BPM. Artefatti da movimento sulla ECG può essere utilizzato per votare giudicare RCP. Compressioni toraciche devono essere consegnati con il dito indice, 5 mm sopra il processo xifoideo e leggermente a sinistra della linea mediana. Il torace deve essere compresso 1/3-1/2 della distanza antero-posteriore e rinculo completo deve essere consentito tra compressioni. Il posizionamento delle dita e la pressione di compressione ottimale sono assolutamente critiche. Mancato raggiungimento di sopravvivenza in questo modello è quasi sempre a causa della non ottimale RCP.
  6. Infondere 0,5 ml di adrenalina, diluita a 15 mg / ml, nei primi 30 secondi di RCP. Dose di adrenalina totale è di 8-12 mg. Osservare attentamente le ECG per il ritorno della circolazione spontanea (ROSC). Complesso QRS stretto complessi sono visti tra gli artefatti di compressione. ROSC si verifica di solito tra 90 secondi e 2 minuti dopo l'inizio RCP. Rianimazione è abbandonato ROSC se non si verifica da 3 minuti. Frequenti contrazioni ventricolari premature e cambiamenti ECG assi sono stati osservati nei primi 2 minuti dopo ROSC, e quasi sempre risolvere in tachicardia sinusale stabile a 2 minuti.
  7. Registrare il tempo totale di rianimazione e la dose di adrenalina. Rileva temperatura ogni minuto per 10 minuti dopo ROSC.
  8. Porta ECG può essere rimosso quando inizia la respirazione spontanea, di solito entro 12-15 minuti dopo il ROSC.
  9. Estubare la trachea quando frequenza respiratoria spontanea è> 60/min.
  10. Posizionare il mouse in una gabbia di recupero su una superficie a temperatura controllata impostata a 37 ° C per le prime 2 postprocedure ore, assicurando un facile accesso al cibo e all'acqua. La gabbia può poi essere spostato in serie condizioni abitative post-operatorio quando il mouse è completamente recuperato da anestesia ed è attivo.

3. Dissanguamento / perfusione-fissaggio e Harvest rene

  1. 24 ore dopo CA / CPR, indurre l'anestesia con isoflurano 3-4% e sicuro l'animale in posizione supina su una superficie chirurgico in una cappa aspirante che è appropriato per l'uso con formalina ..
  2. Approfondire l'anestetico aumentando gradualmente la concentrazione di vapore anestetico al 5% e di garantire il mouse è profondamente anestetizzati come evidenziato dalla cessazione della respirazione spontanea.
  3. Eseguire una toracotomia a conchiglia e exsanguinate il mouse tramite puntura apicale del ventricolo cardiaco sinistro secondo le tecniche standard.
  4. Attraverso lo stesso ago, amministrare 0,9% soluzione salina per infusione lenta. Per acclerate perfusione / dissanguamento, nick l'appendice atriale destra con le forbici. Eseguire una laparotomia e osservare i reni. Quando sono scottate, soluzione salina può essere cambiato in formalina 4% per il fissaggio. Reni sono poi inclusi in paraffina e colorati con Fluoro-Jade B per la quantificazione di necrosi tubolare epiteliali.

4. Rappresentante dei risultati:

Quando CA è indotta, pressione arteriosa media (MAP) e regionali renale il flusso di sangue (RRBCF) caduta quasi a zero e rimanere stabile fino rianimazione ha inizio (Figura 1). 24 ore dopo CA / CPR, indici sierici di funzionalità renale (azotemia, azotemia e creatinina) sono significativamente elevati rispetto a sham-operati animali. AST / ALT sono elevati, offrendo la prova di profonda su tutto il corpo ischemia (Figura 2). Neutrofili-gelatinasi associati lipocalina (NGAL), un indicatore sensibile del danno ischemico renale è massicciamente dopo 24 ore upregulated CA / CPR (Figura 3). Infine, microfotografie dimostrare l'irregolare, la necrosi ischemica midollare tipica di lesioni renali con assottigliamento dell'epitelio tubolare e riempimento luminale su ematossilina ed eosina (Figura 4, pannello a) e la morte cellulare nel vasto midollare tubulare quando colorati con fluoro-giada B ( Figura 4, pannello b).

Figura 1
Figura 1. Arresto cardiaco induce la perdita istantanea della pressione di perfusione, qui rappresentata come pressione arteriosa media (MAP) misurata a livello dell'arteria femorale, provocando quasi completa cessazione del flusso ematico renale regionale corticale (RRCBF) per tutto il periodo di arresto cardiaco (ombreggiato area). Rianimazione con le compressioni toraciche e torna adrenalina MAPPA alla normalità e RRCBF aumenta costantemente nel periodo di rianimazione post. Ristampato con il permesso di 14.

Figura 2
Figura 2. 24h postprocedure, azotemia (BUN), creatinina sierica, e l'estensione della morte delle cellule tubulari sono significativamente elevati negli animali che sono stati sottoposti CA / CPR in confronto con gli animali trattati con una procedura simulata. CA / CPR induce una pan-organismal insulto ischemico, qui evidenziato dalla massiccia elevazione del fegato-funzione degli enzimi dell'alanina aminotransferasi (ALT) e aspartato aminotransferasi (AST) in CA / CPR topi rispetto ai simulato animali trattati.

Figura 3
Figura 3. Western blot eseguiti utilizzando anticorpi policlonali di neutrofili gelatinasi associati lipocalina (NGAL), un indicatore sensibile del danno ischemico renale. I campioni di urine sono stati ottenuti immediatamente prima ("pre") e 24 ore dopo ("24 ore") CA / CPR in 4 animali (con l'etichetta a, b, c, d sopra). NGAL è massicciamente upregulated nel topourine dopo CA / RCP. Ristampato con il permesso di 14.

Figura 4
Figura 4. A) ematossilina e eosina di un breve tratto ilare asse di 24 ore tessuto renale dopo CA / RCP. Vi è un danno a macchia di leopardo ma chiara tubuli midollare e corticomidollare con tubolari tamponamento. Le frecce indicano tubuli danneggiati con gonfiore, nuclei picnotici all'incrocio corticomidollare. B) Flouro-giada B macchia della stessa regione nello stesso animale, 24 ore dopo CA / RCP. Fluoro-giada macchie B cellule necrotiche verde brillante, mostrando irregolare corticomidollare necrosi tubulare. Le frecce indicano vivacemente colorati tubuli danneggiati a livello della giunzione corticomidollare. Questi risultati sono sostanzialmente simili a biopsia renale da esseri umani che sviluppano AKI, ea differenza di quelle prodotte da altri modelli animali di danno renale acuto.

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Discussion

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Il modello normotermico di arresto cardiaco e rianimazione cardiopolmonare nel topo offre molteplici vie di valutazione in un modello che riproduce la fisiopatologia e la morfologia della causa clinica più comune di AKI, tutto il corpo ipoperfusione. La verifica di ipotesi può essere aiutata da accesso a tutta una serie di tecniche di manipolazione genetica e l'anatomia ben capito e caratterizzata e fisiologia del topo di laboratorio.

Come descritto qui, la sopravvivenza in mani esperte è 80%. Anche se la preparazione chirurgica e post-arresto cura sono semplici, la rianimazione reale di un mouse arrestato è un di abilità chirurgica che richiede pratica significativa. Nella nostra esperienza, rianimazioni di successo diventano la norma dopo i primi 30-50 tentativi di rianimazione di un singolo animale, da un chirurgo inesperto, e lesioni coerenti e rianimazione prendere pratica aggiuntiva. In particolare, durante la prima fase di apprendimento della tecnica (vale a dire, per i primi 20 animali), la sopravvivenza significativo è improbabile, e qualsiasi sopravvissuti dovrebbero essere eutanasia subito dopo la rianimazione per evitare inutili sofferenze. Dopo la formazione iniziale, quando i sopravvissuti dimostrare vigoroso recupero cardiaco nei minuti seguenti rianimazione, è opportuno continuare a sopravvivere animali attraverso le 15 minuti dopo il ROSC marchio. Gli animali che dimostrano vigorosa sforzi respiratori spontanei a quel punto probabilmente sopravvivere 24 ore con recupero adeguato. Questa fase pratica dovrebbe essere specificatamente nei protocolli IACUC. L'abilità più difficile da imparare è il compressioni toraciche stessi come è difficile fornire compressioni al tasso necessaria senza aumentare la pressione a livelli pregiudizievoli. Rianimatori meccanici sono stati concepiti e utilizzati nel nostro laboratorio e altri 16, ma fino ad oggi non rianimatore meccanico per il mouse ha prodotto la sopravvivenza accettabile.

Ci sono alcune limitazioni a questo modello. In primo luogo, nessun modello di topo può pienamente modello di fisiologia umana, ed i risultati devono essere interpretati nel rispetto delle differenze interspecie. In particolare, il cuore del mouse è robusto, noi raggiungere l'80% di sopravvivenza a 8 minuti di arresto cardiaco, ma negli studi clinici la sopravvivenza umana è inferiore al 50% anche la rianimazione con inizio 2-3 minuti dopo l'arresto di 17 Le ridotte dimensioni del mouse. rende procedure tecnicamente esigente, e vi è una curva di apprendimento significativo, in particolare per le compressioni toraciche. In secondo luogo, in questo protocollo, le dosi di droga e impostazioni del ventilatore non sono indicizzati al peso dell'animale. Questo è dovuto al fatto che usiamo solo gli animali nel range 20-25 g di peso al fine di minimizzare l'effetto delle dimensioni dell'apparecchiatura. Ad esempio, possiamo utilizzare un catetere 22 gauge per intubare la trachea, il sigillo ottenuto non è la stessa in un topo 30 g come in un topo 25 g e la fuga di gas maggiore può essere fisiologicamente significativa. Tuttavia, l'uso di animali in una gamma di peso definito non riproduce fedelmente la varietà di classi di corpo che sono oggetto di clinica ischemia-riperfusione. In terzo luogo, l'assenza di flusso Stato non può riprodurre fedelmente i risultati di basso flusso stati. In particolare, i gradienti di temperatura possono svilupparsi all'interno del mouse durante no-flow. Per ridurre al minimo l'effetto (se c'è) di pendenze su risultati, la temperatura è misurata vicino l'organo di interesse. Infine, a causa dei primi dati dal nostro laboratorio che ha confermato la significativa acidosi metabolica nel postarrest periodo, iperventilazione durante la rianimazione. Poiché i dati recenti indicano che l'iperventilazione durante la RCP è deleteria, 18,19 è possibile che questa pratica riduce la sopravvivenza nel modello. Molti modelli di alternative per tutto il corpo lesioni ischemia riperfusione esiste. Per esempio, CA / CPR è stata descritta nei cani, 20 conigli, 21 agnelli, 22 maiali, 23 topi, 16 e scoiattoli di terra artica. 24

Abbiamo dimostrato che la funzione renale post-operatorio può essere valutata da un certo numero di prodotti chimici, immunologici o tecniche istologiche a 24 ore. Gli animali possono essere sopravvissuto per più di 24 ore, tuttavia, e la natura transitoria di AKI rende questo modello un uno interessante per l'uso per l'indagine dei meccanismi di recupero e / o lesioni permanenti. La stessa lesione è titolabile modificando i parametri di tempo e temperatura durante CA. Più arresti e la manutenzione delle temperature più elevate produrre maggiori danni (ma negativamente la sopravvivenza effetto). Come abbiamo dimostrato con i dati liver incluso funzione, altri organi sono colpiti e possono essere indagati con adattamenti di questo modello, tuttavia, uno sforzo significativo può essere richiesto per ottimizzare le condizioni sperimentali per il sistema di organo di interesse.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potassium Chloride Abbott Laboratories 06653-5
Isoflurane Abbott Laboratories 05260-05 (and others)
Epinephrine HCl Multiple Suppliers Multiple
Digi-Sense temperature controller Cole-Parmer EW-89000-00
Angiocath IV Cath VWR international 381134
Frova angled airway introducer Cook G27282
MicroVent Ventilator for Mice Harvard Apparatus 733591

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References

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Cite this Article

Hutchens, M. P., Traystman, R. J., Fujiyoshi, T., Nakayama, S., Herson, P. S. Normothermic Cardiac Arrest and Cardiopulmonary Resuscitation: A Mouse Model of Ischemia-Reperfusion Injury. J. Vis. Exp. (54), e3116, doi:10.3791/3116 (2011).More

Hutchens, M. P., Traystman, R. J., Fujiyoshi, T., Nakayama, S., Herson, P. S. Normothermic Cardiac Arrest and Cardiopulmonary Resuscitation: A Mouse Model of Ischemia-Reperfusion Injury. J. Vis. Exp. (54), e3116, doi:10.3791/3116 (2011).

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