Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Нормотермической остановку сердца и сердечно-легочной реанимации: мышиной модели ишемии-реперфузии

doi: 10.3791/3116 Published: August 30, 2011

Summary

Мощная модель для периоперационной и интенсивной терапии острого повреждения связанные почки представлена. Использование целых гипоперфузии тела индуцированных остановки сердца можно практически повторить гистологические и функциональные изменения клинической AKI.

Abstract

Острое повреждение почек (АКИ) является общей, крайне опасная, усложнение критической болезни, которая имеет высокую смертность 1-4 и который чаще всего вызваны всего тела гипоперфузии. 5,6 Успешное воспроизводство всего тела гипоперфузии у грызунов моделей был сопряжен с трудностями. 7-9,9,10 Модели, которые работают фокальной ишемии неоднократно демонстрировали результаты, которые не переводят в клинических условиях, и больших животных, которые позволяют всему телу гипоперфузии не имеют доступа к полным набором инструментов генетических манипуляций возможно в мышь. 11,12 Однако, в последние годы мышиной модели остановку сердца и сердечно-легочной реанимации появился, которая может быть адаптирована к модели AKI. 13 Эта модель надежно воспроизводит физиологические, функциональные, анатомические и гистологические результаты наблюдаются в клинике AKI , быстро повторяемых и предлагает все значительные преимущества мышиной хирургической модели, включая доступ к генетическим манипулятивных техник, низкая относительная стоимость крупных животных, а также простоту в использовании. Наша группа разработала обширный опыт использования этой модели для оценки числа органов конкретных результатов в AKI. 14,15

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Все процедуры, описанные проводятся в соответствии с Национальными Институтами Здоровья рекомендации по уходу и использованию животных в научных исследованиях и всех животных протоколы были одобрены Oregon Health & Science University Институциональные уходу и использованию животных комитета.

1. Хирургическая подготовка

  1. Взвесьте мыши. Процедура, описанная осуществляется на C57BL / 6 мышей весом от 20 до 25 г. Анестезия индуцируется в индукции окна с помощью 3-4% изофлуран, а в дальнейшем поддерживать использование 1,5-2,5% изофлуран в воздухе / кислородной смеси.
  2. Смажьте глаза и положение животного на спине на грелку. Остановите 4 конечностей с помощью липкой ленты. Задние лапы может быть записано на пленку в нейтральное положение, однако, передние лапы должны быть закреплены как можно ближе к грудной стенке, как можно разрешить полный экскурсии грудной клетки при компрессии грудной клетки.
  3. Смажьте и место ректального датчика температуры. Температура контролируется с помощью грелки и лампы подключены к электронным контроллером температуры (Digi-Sense, Коул Пармер, Вернон Хиллс IL), который установлен для поддержания 37,0 ° C. Потому не исключено, что градиент температуры в пределах животного может развиться во время отсутствие потока государства, важно, чтобы температура измеряется и контролируется рядом органов, представляющих интерес.
  4. Интубация трахеи использованием 2,5 см 22 га тефлоновой катетер (Insyte-З, BD, Франклин штат Нью-Джерси) и сократить дистального конца угловой интродьюсер (Frova Introducer, Кук медицинский, Блумингтон IN). Другие методы интубации трахеи являются приемлемыми, однако, использование угловых интродьюсер позволяет правильно позиционирование шею в слегка растянутом положении, что позволяет оптимизировать хирургическое воздействие на размещение внутривенного катетера. Эндотрахеальной центром катетер закрепляется с петлей шва на резец и поддерживать с небольшим напряжением, чтобы обездвижить голову во время компрессии грудной клетки.
  5. Механически проветрить мышь с грызунами вентилятор установлен в 140 мкл, 150 вдохов / мин. Это не с поправкой на вес, как этот протокол всегда выполняется в 20-25 г животных. Не слишком углубляться анестезии. Не устанавливать вентилятор применять в конце выдоха давление, поскольку это ухудшает реанимации.
  6. Использование стерильных и операционный микроскоп, место предварительно промыть ПЭ-10 катетер в яремную вену. Любая сторона может быть использована, но использование стороны, более близкой к оператору снижает вероятность катетер смещение при компрессии грудной клетки или других манипуляций. 0,5% bupivicaine, 0,1 мл, infitrated на края раны для контроля послеоперационной боли.
  7. Безопасные ПЭ-10 катетера в кожу замыкание цианоакрилат хирургического клея.
  8. Место подкожных ЭКГ электроды и подключить к мониторингу устройства. Пристальное внимание к пути сигнала и максимизацию самого сигнала имеет решающее значение для успеха реанимации. Убедитесь, что все провода крепятся к рабочей поверхности, свести к минимуму сигнала переходов, и свести к минимуму изоляторов (как воздух в полых игл или многожильный провод) в пути сигнала. Твердые иглы подключены к nonstranded проводник могут быть куплены или сделаны в лаборатории. После подключения к сети, оптимизировать сигнал ЭКГ на экране монитора.

2. Остановка сердца

  1. Убедитесь, что мышь нормотермической, определяемой как ректальная температура 36,5 ° C - 37,5 ° C. Администрирование 40 мкл комнатной температуре 0,5 М хлористого калия внутривенно и наблюдать изоэлектрической трассировки на ЭКГ. Коррекция дозы для снижения веса не стоит в пределах 20-25 г. Начало арест таймер.
  2. Отключите вентилятора. Прекратите анестезии пара. Выключите грелку и любое другое оборудование, которое производит электронные шумы, которые могут помешать мониторинга ЭКГ. Место изоляционных одеяло на мышь.
  3. Запись температуры каждую минуту во время остановки сердца. При необходимости нагрева лампы могут быть использованы для достижения внутренней температуры до нормотермической диапазона. Во время остановки сердца, подготовить материалы и оборудование (например, адреналин шприц) для реанимации. Контрольный список может быть полезным для обеспечения бесперебойного реанимации, которая необходима для выживания.
  4. Через 7 минут, 30 секунд от сердечного приступа, подключите вентилятор и увеличить скорость до 180 вдохов / мин, сохраняя дыхательный объем на предварительном аресте обстановке.
  5. На 8 минут, начать непрямой массаж сердца при 300 BPM. Движение артефакт на ЭКГ могут быть использованы для скорости судить КПП. Непрямой массаж сердца должен быть доставлен с указательный палец, 5 мм выше мечевидного отростка и немного слева от средней линии. Грудь должна быть сжата 1/3-1/2 переднезаднем расстояния и полной отдачи должны быть разрешены между сжатий. Позиционирования пальцев и оптимальное давление сжатия абсолютно критическим. Неспособность добиться выживания в этой модели почти всегда из-за неоптимальных КПП.
  6. Настаивать 0,5 мл адреналина, разбавляют до 15 мкг / мл, в первые 30 секунд СЛР. Общая доза адреналина составляет 8-12 мкг. Тщательно соблюдайте ЭКГ для возвращения спонтанного кровообращения (РОСК). Узкий комплекс QRS комплексов видны между артефактов сжатия. РОСК обычно происходит между 90 секунд и 2 минуты после начала СЛР. Реанимация прекращается, если РОСК не происходит на 3 минуты. Частые преждевременное сокращение желудочков и изменения в ЭКГ оси наблюдаются в первые 2 минуты после РОСК, и почти всегда сводятся к устойчивым синусовая тахикардия на 2 минуты.
  7. Запись общего времени реанимации и адреналин дозы. Запись температуры каждую минуту в течение 10 минут после РОСК.
  8. ЭКГ приводит могут быть сняты при спонтанном дыхании начинается, обычно в течение 12-15 минут после РОСК.
  9. Экстубации трахеи, когда спонтанное частота дыхания составляет> 60/min.
  10. Место мыши в клетке на восстановление контролируемой температурой поверхности набора до 37 ° С в течение первых 2 часов postprocedure, обеспечивая легкий доступ к пище и воде. Клетки могут затем переехал в стандартной послеоперационной жилищных условий, когда мышь полностью оправилась от наркоза и является активным.

3. Кровотечения / перфузии-Фиксация и почек урожая

  1. 24 часов после CA / КПП, вызывают анестезию с изофлуран 3-4% и безопасной животное в положении лежа на спине на хирургическом поверхности в вытяжной шкаф, который подходит для использования с формалином ..
  2. Углубление анестезии, постепенно увеличивая концентрацию анестетика пара до 5% и обеспечить мыши глубоко под наркозом, о чем свидетельствует прекращение спонтанного дыхания.
  3. Выполните раскладушка торакотомия и обескровить мышь через апикальный пункция сердечной левого желудочка в соответствии со стандартными методами.
  4. Через ту же иглу, администрирования 0,9% физиологического раствора медленной инфузии. Для acclerate перфузии / кровопускания, ник в правом предсердии придаток ножницами. Выполните лапаротомии и наблюдать почки. Когда они побледнел, солевые может быть изменен на 4% формалина для фиксации. Почки затем заливали в парафин и окрашивали Фтор-нефрита B для количественного определения трубчатых эпителиальных некроза.

4. Представитель Результаты:

Когда CA индуцируется, среднего артериального давления (САД) и регионального почечного кровотока (RRBCF) падение почти до нуля и остается стабильным в течение реанимации начинается (рис. 1). 24 часов после CA / КПП, сыворотка показателей функции почек (азот мочевины крови, азота мочевины и креатинина) значительно повышенный по сравнению с ложнооперированных животных. AST / ALT также повышен, предлагая свидетельство глубокого всего тела ишемии (рис. 2). Нейтрофилов-желатиназа связанные lipocalin (нгап), чувствительным индикатором почечной ишемического повреждения в широких масштабах upregulated 24 часов после CA / CPR (рис. 3). Наконец, микрофотографии демонстрируют пятнистый, медуллярный некроз типичные ишемического повреждения почек с истончением эпителия и трубчатых просвета начинку на гематоксилином и эозином пятно (рис. 4, панели), а также обширную гибель клеток в мозговой трубчатого эпителия при окраске фтор-нефрита B ( На рисунке 4, панель б).

Рисунок 1
Рисунок 1. Остановка сердца вызывает мгновенной потере перфузионного давления, представлены здесь в виде среднего артериального давления (САД), измеряемый в бедренную артерию, в результате почти полного прекращения регионального почечного коркового кровотока (RRCBF) в течение периода от остановки сердца (заштрихованная области). Реанимация с непрямой массаж сердца и адреналин возвращается к нормальной MAP и RRCBF неуклонно повышается в период реанимации поста. Переизданный с разрешением от 14.

Рисунок 2
Рисунок 2. 24h postprocedure, азота мочевины крови (АМК), сывороточного креатинина, а также степень трубчатых клеточной смерти все значительно повышен у животных, подвергшихся CA / КПП по сравнению с животных, получавших процедуры обман. CA / CPR вызывает пан-организменном ишемического инсульта, здесь свидетельствует массивное повышение активности печеночных ферментов-функции аминокислот аланин трансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) в ЦА / CPR мышей по сравнению с шам-обработанных животных.

Рисунок 3
Рисунок 3. Иммуноблоттинга выполняется с помощью поликлональных антител к нейтрофилов желатиназа связанных lipocalin (нгап), чувствительным индикатором почечной ишемического повреждения. Образцы мочи были получены непосредственно перед («до») и 24 часа после ("24 часа") CA / КПП в 4-х животных (помечены, б, в, г выше). Нгап является массово upregulated в мышьмочи после CA / КПП. Переизданный с разрешением от 14.

Рисунок 4
Рисунок 4.) Гематоксилин-эозином пятна короткий участок внутригрудной оси почечной ткани после 24h CA / КПП. Существует пятнистый, но ясно повреждение мозгового и corticomedullary трубочки с трубчатыми подключения. Стрелки указывают на поврежденные канальцы с опухшими, пикнотические ядер при corticomedullary перехода. Б) Flouro-нефрита B пятно того же региона в том же животное, 24 часа после CA / КПП. Фтор-нефрита пятна B отмершие клетки ярко-зеленый, показывая, пятнистый corticomedullary тубулярный некроз. Стрелки указывают на ярко окрашенных поврежденных канальцев в corticomedullary перехода. Эти выводы в основном аналогичны почечной биопсии от людей, которые разрабатывают АКИ, и в отличие от производства других моделей животных АКИ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Нормотермической модель остановку сердца и сердечно-легочной реанимации в мышь имеет несколько направлений оценки в модель, которая имитирует патофизиологии и морфологии наиболее распространенных клинических причиной AKI всего тела гипоперфузии. Проверка гипотезы может быть оказана помощь за счет доступа к арсенал методов генной манипуляции и хорошо понимал и характеризуется анатомии и физиологии лабораторных мышей.

Как описано здесь, выживание в опытных руках составляет 80%. Хотя хирургическое подготовки и после ареста по уходу за прямой, фактический реанимации арестован мышь сложные хирургические навыки, которых требует значительных практике. По нашему опыту, успешные реанимации стало нормой приблизительно после первых 30-50 попытки реанимации отдельных животных от неопытного хирурга, и в соответствии травмы и реанимации принять дополнительные практике. В частности, на ранней стадии обучения технике (т. е. за первые 20 животных), значимые выживание маловероятно, и любой выжившие должны быть умерщвлены сразу после реанимации, чтобы предотвратить ненужные страдания. После раннего обучения, когда выжившие продемонстрировать энергичное восстановление сердечной минут после реанимации, целесообразно продолжить выживших животных через 15 минут после РОСК марки. Животные, которые демонстрируют энергичный спонтанные дыхательные усилия к тому моменту, скорее всего, выжить 24h с соответствующими восстановления. Эта практика фаза должна содержаться конкретная информация в IACUC протоколов. Самый сложный навык, чтобы узнать это непрямой массаж сердца себя, так как трудно поставить на сжатие необходимо скорости без увеличения давления на вредных уровней. Механические реаниматологи были разработаны и используются в нашей лаборатории и другие 16, но на сегодняшний день никаких механических реаниматолога для мыши выпустила приемлемым выживания.

Существуют некоторые ограничения для этой модели. Во-первых, не мышиной модели могут в полной мере модель физиологии человека, и результаты следует интерпретировать с уважением межвидовые различия. В частности, мыши сердце прочные, мы достигаем 80% выживаемости в 8 минутах от остановки сердца, но в клинических исследованиях выживания человека составляет менее 50%, даже с началом реанимации 2-3 минут после ареста 17 небольшого размера мыши. оказывает процедуры технически требовательный, и существует значительная кривой обучения, особенно для компрессии грудной клетки. Во-вторых, в этом протоколе, дозы препаратов и вентилятор настройки не индексируются в массы животного. Это потому, что мы используем только животных в 20-25 Диапазон веса г, чтобы минимизировать влияние оборудования размера. Например, мы используем 22 калибра катетер для интубации трахеи; уплотнение получить не то же самое в 30 г мыши, как в 25 г и мыши увеличилась утечка газа может быть физиологически значимым. Тем не менее, использование животных в определенный диапазон веса не точно воспроизвести самые разнообразные тела классы, на которые распространяются клинической ишемии-реперфузии. В-третьих, отсутствие потока государство не может точно повторяют результаты низкого потока государств. В частности, температурные градиенты могут развиваться в течение мыши во время отсутствие потока. Чтобы свести к минимуму эффект (если таковые имеются) градиентов на результат, температура измеряется рядом органов, представляющих интерес. Наконец, из-за раннего данным нашей лаборатории, которые подтвердили значительные метаболический ацидоз в postarrest период мы гипервентиляцию во время реанимации. Как показывают последние данные показывают, что гипервентиляция во время СЛР является вредным, 18,19 не исключено, что такая практика снижает выживаемость в модели. Многие модели альтернатив для всего тела, травмы реперфузия ишемии существует. Например, CA / КПП был описан у собак, 20 кроликов, 21 ягнят, 22 свиней, 23 крыс, 16 и белки арктические земли 24.

Мы показали, что послеоперационные функции почек может быть оценена по ряду химических, иммунологических, или гистологических методов на 24 часов. Животные могут выжить более чем на 24 часа, однако, и преходящий характер AKI делает эту модель привлекательной из них использовать для исследования механизмов восстановления и / или постоянные травмы. Травма сама титруемой путем изменения параметров времени и температуры во время СА. Более аресты и поддержание высоких температурах производить больше травм (но отрицательно сказаться на выживание). Как было показано с помощью входящего в данные функции печени, других органов и систем, также повлияли и могут быть исследованы с помощью приспособления этой модели, однако, значительные усилия могут потребоваться для оптимизации условий эксперимента для системы органов, представляющих интерес.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potassium Chloride Abbott Laboratories 06653-5
Isoflurane Abbott Laboratories 05260-05 (and others)
Epinephrine HCl Multiple Suppliers Multiple
Digi-Sense temperature controller Cole-Parmer EW-89000-00
Angiocath IV Cath VWR international 381134
Frova angled airway introducer Cook G27282
MicroVent Ventilator for Mice Harvard Apparatus 733591

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chertow, G. M., Lazarus, J. M. Predictors of mortality and the provision of dialysis in patients with acute tubular necrosis. the auriculin anaritide acute renal failure study group. J Am Soc Nephrol. 9, 692-698 (1998).
  2. Lassnigg, A., Schmidlin, D. Minimal changes of serum creatinine predict prognosis in patients after cardiothoracic surgery: A prospective cohort study. J Am Soc Nephrol. 15, 1597-1605 (2004).
  3. Lassnigg, A., Donner, E. Lack of renoprotective effects of dopamine and furosemide during cardiac surgery. J Am Soc Nephrol. 11, 97-104 (2000).
  4. Metnitz, P. G., Krenn, C. G. Effect of acute renal failure requiring renal replacement therapy on outcome in critically ill patients. Crit Care Med. 30, 2051-2058 (2002).
  5. Uchino, S., Kellum, J. A. Acute renal failure in critically ill patients: A multinational, multicenter study. JAMA. 294, 813-818 (2005).
  6. Mehta, R. L., Pascual, M. T. Spectrum of acute renal failure in the intensive care unit: The PICARD experience. Kidney Int. 66, 1613-1621 (2004).
  7. Zager, R. A. Partial, aortic ligation: A hypoperfusion model of ischemic acute renal failure and a comparison with renal artery occlusion. J Lab Clin Med. 110, 396-405 (1987).
  8. Zager, R. A. Adenine, nucleotide changes in kidney, liver, and small intestine during different forms of ischemic injury. Circ Res. 68, 185-196 (1991).
  9. Oliver, J., MacDowell, M. The pathogenesis of acute renal failure associated with traumatic and toxic injury; renal ischemia, nephrotoxic damage and the ischemic episode. J Clin Invest. 30, 1307-1439 (1951).
  10. Phillips, R. A., Dole, V. P. Effects of acute hemorrhage and traumatic shock on renal function in dogs. Am J Physiol. 145, 314-336 (1945).
  11. Klocke, R., Tian, W. Surgical animal models of heart failure related to coronary heart disease. Cardiovasc Res. 74, 29-38 (2007).
  12. Traystman, R. J. Animal models of focal and global cerebral ischemia. ILAR J. 44, 85-95 (2003).
  13. Burne-Taney, M. J., Kofler, J. Acute renal failure after whole body ischemia is characterized by inflammation and T cell-mediated injury. Am J Physiol Renal Physiol. 285, 87-94 (2003).
  14. Hutchens, M. P., Nakano, T. Estrogen is renoprotective via a non-receptor dependent mechanism after cardiac arrest in vivo. Anesthesiology. 112, 395-405 (2010).
  15. Hutchens, M. P., Nakano, T. Soluble epoxide hydrolase gene deletion reduces survival after cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation. Resuscitation. 76, 89-94 (2007).
  16. Planta, I. von, Weil, M. H. Cardiopulmonary resuscitation in the rat. J Appl Physiol. 65, 2641-2647 (1988).
  17. Cobb, L. A., Fahrenbruch, C. E. Influence of cardiopulmonary resuscitation prior to defibrillation in patients with out-of-hospital ventricular fibrillation. JAMA. 281, 1182-1188 (1999).
  18. Aufderheide, T. P., Lurie, K. G. Death by hyperventilation: A common and life-threatening problem during cardiopulmonary resuscitation. Crit Care Med. 32, 345-351 (2004).
  19. Aufderheide, T. P., Sigurdsson, G. Hyperventilation-induced hypotension during cardiopulmonary resuscitation. Circulation. 109, 1960-1965 (2004).
Нормотермической остановку сердца и сердечно-легочной реанимации: мышиной модели ишемии-реперфузии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hutchens, M. P., Traystman, R. J., Fujiyoshi, T., Nakayama, S., Herson, P. S. Normothermic Cardiac Arrest and Cardiopulmonary Resuscitation: A Mouse Model of Ischemia-Reperfusion Injury. J. Vis. Exp. (54), e3116, doi:10.3791/3116 (2011).More

Hutchens, M. P., Traystman, R. J., Fujiyoshi, T., Nakayama, S., Herson, P. S. Normothermic Cardiac Arrest and Cardiopulmonary Resuscitation: A Mouse Model of Ischemia-Reperfusion Injury. J. Vis. Exp. (54), e3116, doi:10.3791/3116 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter