Summary
पृथक mesenteric धमनियों में बल के मापन के लिए एक स्वचालित myography विधि वर्णित है. यह एक ऑटो Mulvany हेल्पर्न दोहरी वायर phenylephrine और कोशिकी कैल्शियम प्रतिक्रियाओं निर्धारित 510A Myograph कार्यरत हैं. 300 सुक्ष्ममापी, स्वतंत्र विधि isometric प्रतिक्रियाओं का लगातार 60 के diameters के छोटे जहाजों में agonists के लिए दृढ़ संकल्प की अनुमति देता है.
Protocol
1. चूहे mesenteric छोटे धमनी के अलगाव
- एक कक्ष में बंद कर दिया isoflurane के साथ पशु anesthetize और शराब के साथ पेट पोंछ.
- मध्य लाइन mesenteric बिस्तर बेनकाब laparotomy प्रदर्शन.
- कैंची का प्रयोग, बेहतर mesenteric धमनी के साथ vasculature को खिलाने के साथ आंत के बारे में 85 सेमी हटायें. आंतों जठरनिर्गम के लिए करीब अनुभाग और ileo - coecal जंक्शन के पास बाहर का अंत के प्रॉक्सिमल अंत कट. आंत के अनुभाग isoflurane और खुले सीने कार्डियक पंचर द्वारा euthanized के साथ गहरा anesthetized चूहों कि से अलग कर रहे हैं.
- एक लेपित पेट्री डिश PSS युक्त excised अनुभाग में रखा और कमरे के तापमान पर mesenteric धमनी के विच्छेदन प्रदर्शन.
- नीचे दाहिने हाथ की ओर आंत के प्रॉक्सिमल अंत पिन और बाहर intestineina दिशा काउंटर दक्षिणावर्त (आंत के दूर पक्ष पर बाईं खिला vasculature पर ieproximal अंत) के शेष पिन.
- प्रॉक्सिमल खंड के एक टुकड़े के साथ एक साथ बाहर शाखा II और III के क्षेत्रों काटना.
- बाहर नस काटना और अलग धमनी (वी के आकार का शाखा बिंदु के साथ) और यह वसा और संयोजी ऊतक को हटाने से साफ है. संदंश के साथ धीरे खींच और संयोजी ऊतक की झिल्ली के माध्यम से काटने के द्वारा धमनी के साथ सीधे संपर्क से बचें.
2. पोत के बढ़ते
- 40 सुक्ष्ममापी टंगस्टन मुक्त स्टेनलेस स्टील के तार के दो छोटे क्षेत्रों (≈ 4 सेमी) काटें और ठीक एक संदंश के साथ, प्रत्येक ख्याल रख रही endothelium को नुकसान नहीं धमनी के लुमेन में सम्मिलित करें. लुमेन खोलने के यदि आवश्यक तार टिप का उपयोग करें. पोत के बाहर स्ट्रीमिंग रक्त लुमेन खोला है एक अच्छा संकेत है.
- NaCl 115, KCl 4.7, 1.4 MgSO 4 0.7 एच 2 हे, 5 3 NaHCO, 1.2 कश्मीर HPO 2 4, 1.1 ना दो HPO 4, 1.0 CaCl 2, 20 HEPES और मिमी, शारीरिक नमक (समाधान PSS के साथ myograph चैम्बर भरें 5 ग्लूकोज, 7.4 पीएच 37) ascorbic एसिड (100 सुक्ष्ममापी) के साथ डिग्री सेल्सियस और संदंश का उपयोग सावधानी पेट्री डिश से कमरे के तापमान पर चेंबर में लड़ी पिरोया पोत खंड और हस्तांतरण myograph चैम्बर excised प्रॉक्सिमल पोत खंड हस्तांतरण और पुल तार के साथ अंत तक यह पोत में फ़ीड. पोत खींच से बचें.
- तार दाएँ हाथ सुक्ष्ममापी करने के लिए जुड़ा जबड़े पर निकट फिक्सिंग पेंच के तहत वामावर्त के अंत के पास सुरक्षित. संदंश के साथ तार के मुक्त अंत पकड़ो और सुरक्षित यह सही हाथ जबड़े पर दूर फिक्सिंग पेंच के तहत दक्षिणावर्त. सुनिश्चित करें कि जबड़े के साथ ही किसी भी संपर्क बनाने के बिना तार के साथ पोत खंड के जबड़े के बीच की खाई में स्थित है.
- जबड़े अलावा भाड़ में जाओ, और पोत के साथ दूसरे तार समानांतर संरेखित करें और यह लुमेन के दूर के अंत में सम्मिलित. धीरे पोत खंड के लुमेन के माध्यम से एक गाइड के रूप में पहले से ही घुड़सवार तार का उपयोग गति में तार फ़ीड. यह पैंतरेबाज़ी के दौरान खींच से बचने के पोत से 1 सेमी के बारे में तार पकड़ो, और endothelium छूने से बचें.
- जबड़े के साथ भाड़ और सुनिश्चित करें कि पहले एक के नीचे दूसरा बढ़ते तार चालें दाएँ हाथ के जबड़े पर सुरक्षित.
- Transducer के लिए बाएं हाथ जुड़ा जबड़े के पास फिक्सिंग पेंच के तहत एक दक्षिणावर्त दिशा में दूसरा तार के अंत के पास सुरक्षित.
- बाएँ हाथ के जबड़े पर पेंच फिक्सिंग के अंतर्गत तार के अंत तक सुरक्षित और तार खिंचाव कस.
- एक बार जब बढ़ते पूरा हो गया है, "बढ़ते मेनू" में मोटर रीसेट और पोत के सामान्य शुरू करते हैं.
3. सामान्यकरण
ऑटो दोहरी वायर सिस्टम - 510A Myograph एक स्वचालित सामान्य समारोह है, जो "सामान्य" मेनू से मूल्यांकन किया है और पोत एक मानकीकृत प्रक्रिया में 30 मिनट के लिए संतुलन के बाद निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक सामान्यीकृत आंतरिक परिधि बढ़ाया की अनुमति देता है 37 डिग्री सेल्सियस एक चरघातांकीय वक्र तो आंतरिक परिधि दबाव डेटा के लिए फिट है. प्रक्रिया लुमेन (100 घ) व्यास है कि vivo में धमनी पड़ा है जब आराम और 100 1 mmHg के transmural दबाव के तहत परिभाषित करता है चूहे mesenteric धमनी के लिए सामान्य मापदंडों निम्नानुसार हैं.
- टारगेट transmural दबाव = 13.3 kPa (100 मिमी Hg).
- समय = 60 सेकंड, सामान्य चरणों में से प्रत्येक की अवधि.
- 1 आईसी आईसी / 100 = (0,9 1 आईसी = सामान्यीकृत आंतरिक परिधि, 100 आईसी = आंतरिक लक्ष्य दबाव इसी परिधि.
- ऐपिस 2 अंशांकन * Δ (मिमी / नेत्र विभाजन), 2 डेल्टा प्रोग्रामिंग कारणों के लिए है.
घुड़सवार mesenteric खुर्दबीन आँख टुकड़ा रीडिंग का उपयोग कर जब hairlines घुड़सवार पोत SEGM के दूर और निकट समाप्त होता है खत्म हो गई हैं धमनी की लंबाई उपायent. संक्षेप में, घुड़सवार पोत खंड की लंबाई आँख टुकड़ा विच्छेदन माइक्रोस्कोप में एक calibrated नेत्र के साथ अधिकतम बढ़ाई पर मापा जाता है. खंड के अंत तक (1) पर आँख टुकड़ा बाल लाइन के साथ पढ़ने और खंड के पास नेत्र डिवीजनों में (2) अंत मापा रहे हैं और दर्ज की है. इन मूल्यों, सुक्ष्ममापी रीडिंग के साथ, पहले और पोत खींच के बाद दर्ज की गई और कार्यक्रम के लिए मेनू में प्रवेश करने के लिए फिट वक्र और आंतरिक व्यास 100 मिमी Hg के एक लक्ष्य transmural दबाव इसी की गणना कर रहे हैं
हमारे अध्ययन में, धमनियों 1 घ के लुमेन व्यास करने के लिए सेट किया गया = 0.9 100 XD, जहां सक्रिय बल विकास के अधिक से अधिक है . चूहे mesenteric धमनियों में ≥ 10 करोड़ की सक्रिय शक्ति विकास के प्रयोगों के लिए आगे बढ़ने के लिए इष्टतम माना जाता है. कम सक्रिय बल के साथ ऊतकों को निकाल दिया गया.
4. प्रतिक्रियाओं के मापन
सामान्यीकरण के बाद, जहाजों के यांत्रिक और कार्यात्मक गुण एक "मानक शुरू" है, जो 5 सुक्ष्ममापी phenylephrine (पीई) के दोहराया अनुप्रयोगों (सामान्य दो या तीन) के साथ चुनौतीपूर्ण वाहिकाओं शामिल प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संकुचन प्राप्त प्रदर्शन के द्वारा फिर सक्रिय. हमारी प्रयोगशाला में एक ठेठ "मानक" शुरू निम्नानुसार stimulations और वार्शआउट अवधि की एक श्रृंखला के शामिल हैं:
- बदलें myograph चैम्बर कवर और 95% हवा और 5% सीओ 2 के साथ शुरू वातन .
- ताजा PSS (100 सुक्ष्ममापी ascorbic एसिड युक्त) के साथ चैम्बर भरें
- 5 सुक्ष्ममापी पीई के साथ 5 मिनट के लिए अनुबंध पोत और PSS बफर के साथ 4 बार धो लो.
- के बाद पिछले धोने, PSS के साथ फिर से भरना चैम्बर और कदम (ii) दोहरा से पहले 3 मिनट रुको और (iii).
मानक शुरू करने के बाद, धमनी प्रयोग के लिए तैयार है. अनुबंधित वाहिकाओं की छूट की बढ़ती सांद्रता 2 CaCl (- 4 मिमी 0.5) का संचयी अलावा द्वारा मूल्यांकन कर रहे हैं. जब inhibitors के इस्तेमाल कर रहे हैं वाहिकाओं पूर्व 20 और assays के दौरान न्यूनतम वर्तमान के लिए myograph कक्ष में यौगिकों के साथ incubated.
5. डेटा विश्लेषण
वाहिकाओं और बल tracings, सीधे पाठ डेटा को कनवर्ट के लिए "सामान्य" डेटा, SigmaPlot 11.0 रेखांकन कार्यक्रम (Systat सॉफ्टवेयर, प्वाइंट रिकमंड, CA) के साथ विश्लेषण किया गया और प्लॉट किए जाते हैं जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है. एकाग्रता प्रतिक्रिया डेटा tracings से गणना, चुनाव आयोग प्रयोगात्मक डेटा चार पैरामीटर कार्यक्रम के भेषजगुण मेनू में रसद समारोह के लिए फिट से 50 मूल्यों का निर्धारण विश्लेषण किया गया. समूहों के बीच और समूहों के भीतर तुलना वेरिएंस के मार्ग विश्लेषण (एनोवा) और पी <माना जाता महत्वपूर्ण 0.05 के साथ मतभेद से बाहर किए गए .
6. प्रतिनिधि परिणाम:
| पैरामीटर्स | Wistar | नमक - संवेदनशील Dahl | नमक - प्रतिरोधी Dahl |
|---|---|---|---|
| 100 एल (सुक्ष्ममापी) | 83.26 ± 2.33 | 91.52 ± 4.67 | 117.45 8.43 ± * |
| 1 एक्स | 604.21 ± 41.97 | 752.24 ± 85.25 | 745.84 ± 110.09 |
| r 2 | 0.99 ± 0.003 | 0.97 ± 0.008 | 0.97 ± 0.007 |
* Wistar और डॉ. के लिए 100 एल के मूल्यों के बीच अंतर सांख्यिकीय महत्वपूर्ण हैं. शापिरो - Wilk सामान्य टेस्ट (0.588 = पी) पारित, समान वेरिएंस टेस्ट पारित (पी = .237).
100 एल = घुड़सवार लक्ष्य transmural दबाव के लिए इसी खंड के आंतरिक व्यास.
1 एक्स = सूक्ष्म positioner अपने सामान्यीकृत आंतरिक परिधि (यानी जिस पर प्रयोगों प्रदर्शन किया गया सुक्ष्ममापी पढ़ने के मूल्य) के लिए मुहिम शुरू पोत खिंचाव आवश्यक सेटिंग.
r 2 फिट करने के लिए प्रतिगमन = गुणांक एक घातीय वक्र (मैं एक्स, वाई i).
एनबी: 510A Myograph 6 सिस्टम के लिए विस्तृत प्रक्रिया के मैनुअल में वर्णित है .
टेबल 1 नमूना आउट पढ़ें मूल "सामान्य" मेनू में दिखाया कार्यक्रम से Wistar डी एस, और डॉ से mesenteric धमनी क्षेत्रों के लिए सामान्य मापदंडों का . मान 5 पशुओं का मतलब (SEM ±). Wistar और डी एस के लिए 100 एल के मूल्यों के बीच अंतर सांख्यिकीय महत्वपूर्ण (पी <0.05) कर रहे हैं.
| Wistar | डी एस | डॉ |
|---|---|---|
| 14.2 ± 0.6 | | 20.9 1.3 ± * | |
टेबल 2 mesenteric Wistar, डी एस, और डॉ चूहों से अलग प्रत्येक पोत 5 पीई सुक्ष्ममापी के आवेदन के बाद धमनियों में विकसित तनाव (MN ). रिपोर्ट मान 6-8 जानवरों के अर्थ (SEM ±). * गौरतलब Wistar नियंत्रण से अलग (पी <0.05).
चित्रा 1 2 Ca + Wistar चूहे से एक पीई अनुबंधित mesenteric धमनी की छूट ई - प्रेरित शारीरिक नमक समाधान में एक तार myograph में घुड़सवार मिमी 1 2 Ca + युक्त. धमनी 37 पर 30 मिनट के लिए equilibrated डिग्री सेल्सियस + निरंतर वातन और 2 Ca के लिए प्रतिक्रियाओं के साथ निर्धारित ई . प्रतिनिधि 5 सुक्ष्ममापी पीई Ca 2 का संचयी परिवर्धन द्वारा पीछा के अलावा पर अनुरेखण बल + दिखाया गया है.
चित्रा 2 2 Ca + एक डी एस चूहे से एक पीई अनुबंधित mesenteric धमनी की छूट ई - प्रेरित शारीरिक नमक समाधान में एक तार myograph में घुड़सवार मिमी 1 2 Ca + युक्त. धमनी 37 पर 30 मिनट के लिए equilibrated डिग्री सेल्सियस + निरंतर वातन और 2 Ca के लिए प्रतिक्रियाओं के साथ निर्धारित ई . प्रतिनिधि 5 सुक्ष्ममापी पीई Ca 2 का संचयी परिवर्धन द्वारा पीछा के अलावा पर अनुरेखण बल + दिखाया गया है. Ca 2 + विश्राम गंभीर Wistar और डॉ चूहों से उन लोगों की तुलना में इस ऊतक में समझौता किया गया था.
चित्रा 3. 2 Ca + पीई डॉ चूहे से अनुबंधित mesenteric धमनी की छूट ई - प्रेरित शारीरिक नमक समाधान में एक तार myograph में घुड़सवार मिमी 1 2 Ca + युक्त. धमनी 37 पर 30 मिनट के लिए equilibrated था डिग्री सेल्सियस निरंतर वातन और 2 Ca के लिए प्रतिक्रियाओं के साथ ई determined.A प्रतिनिधि 5 सुक्ष्ममापी पीई Ca 2 का संचयी परिवर्धन द्वारा पीछा के अलावा पर अनुरेखण बल + दिखाया गया है .
चित्रा 4. ए [ca 2 +] ई - प्रतिक्रिया घटता बी बार चुनाव आयोग के विश्राम के लिए 50 मान mesenteric DR और डी एस चूहों से अलग arcades में चार पैरामीटर रसद curve.C.CaR अभिव्यक्ति डेटा फिटिंग द्वारा निर्धारित चार्ट दिखा.
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Discussion
उच्च रक्तचाप हृदय, मस्तिष्क और गुर्दे की रुग्णता / मृत्यु का एक प्रमुख कारण है. उच्च रक्तचाप की घटना जनसंख्या में अधिक है और नमक के प्रति संवेदनशील उच्च रक्तचाप उम्र बढ़ने की आबादी में विशेष रूप से उच्च है, और अश्वेतों में गोरों की तुलना में अधिक प्रचलित है. यह अश्वेतों की प्रवृत्ति उनके 9 गुर्दे में सोडियम बनाए रखने के कारण माना जा रहा है. नमक संवेदनशीलता एक प्रमुख गुर्दे की बीमारी के लिए योगदान कारक है और endothelial रोग के साथ जुड़ा हुआ है, लेकिन तंत्र पूरी तरह समझ नहीं है. हमारी प्रयोगशाला में हाल के अध्ययनों से पता चला है कि उच्च नमक आहार मध्य द्रव कम 2 Ca एकाग्रता + ([ca 2 +] IF), और 10,11 नमक के प्रति संवेदनशील चूहों में systolic दबाव में वृद्धि . इन प्रभावों mesenteric धमनियों और नमक के प्रति संवेदनशील उच्च रक्तचाप से ग्रस्त रोगियों में कार के स्तर में इसी तरह की कटौती kidneys.Finding में कारों की कम अभिव्यक्ति के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है और नए उपचारों के विकास के लिए एक लक्ष्य दे सकती है. हम पृथक mesenteric धमनियों के साथ किया गया है उच्च रक्तचाप के पशु मॉडल की एक संख्या से स्वचालित तार myography Ca 2 संवहनी जेट + ई अध्ययन करने के लिए vasculature में कार संकेत के तंत्र को समझने का उपयोग.
[Ca 2 +] ई एक संकीर्ण सीमा (1.1 - 1,4 मिमी) के भीतर बनाए रखा है 12 इंसानों में, इसलिए कार [2 Ca +] रिसेप्टर सक्रियण के लिए ई करने के लिए संभव हो छोटे परिवर्तन का पता लगाने में सक्षम होना चाहिए. वास्तव में, कार CA में 2 छोटे परिवर्तन + 13 ई, और छोटे बढ़ जाती है का पता लगाने दिखाया गया है [2 Ca +] यदि है कि शारीरिक सीमा के भीतर 14 हैं. सीटू microdialysis मापने के अध्ययन में [2 Ca +] यदि ग्रहणी submucosa और गुर्दे प्रांतस्था, दो ऊतकों कि परिधीय प्रतिरोध और रक्तचाप (बीपी) के नियमन के लिए आवश्यक हैं, आंत लुमेन [2 Ca +] के एक समारोह के रूप में गतिशील परिवर्तन दिखाया. बढ़ाने पेट [2 Ca +] 0 से 6 मिमी के लिए वृद्धि हुई [2 Ca +] यदि 1.1 से 1.9 मिमी, 4,5,15, जो perivascular तंत्रिका 16 कार को सक्रिय करने के लिए मनाया रेंज में है और पृथक mesenteric आराम 17 धमनियों. हम यह भी पता चला है कि कार में कम हो जाती है का पता लगाता है है [2 Ca + ई] और गैर चयनात्मक कटियन चैनल है, जो बारी में neocortical 18 टर्मिनलों पर रिलीज संभावना पर प्रभाव attenuates के सक्रियण के माध्यम से कार्रवाई की संभावित अवधि बढ़ा सकते हैं. यह पता चलता है कि कार पूर्व synaptic प्रतिक्रिया प्रदान करने के लिए 2 Ca ई + के जवाब में मस्तिष्क excitability बदल. इसके अलावा, PvN कार की desensitization दोहराया, लंबे समय तक 16 उत्तेजना के साथ होता है, सुझाव है कि इस रिसेप्टर के विनियमन के एक समझ दोनों सामान्य और उच्च रक्तचाप से ग्रस्त शर्तों के तहत अपनी भूमिका को स्पष्ट करेंगे. Bukoski और उनके सहयोगियों ने पता चला है कि में छोटे परिवर्तन [2 Ca +] यदि पर्याप्त हैं कार को सक्रिय करने और सामान्य 3,4.19 शर्तों, के अंतर्गत vasodilator के संश्लेषण के लिए योगदान. इन टिप्पणियों के आधार पर, हम मांगना कि इस प्रतिक्रिया भी बढ़ संवहनी टोन की शर्तों के तहत हो के रूप में उच्च रक्तचाप में देखा और इसलिए रक्तचाप को नियंत्रित करने के लिए शोषण किया जा सकता है. कार सक्रियण के अध्ययन और कैसे संकेत मध्यवर्ती की phosphorylation के लिए इस सुराग, इसलिए सामान्य और उच्च रक्तचाप से ग्रस्त शरीर क्रिया विज्ञान में अपनी भूमिका की जांच करने के लिए आवश्यक है. कार जी रिसेप्टर प्रोटीन युग्मित (GPCR) है और अन्य GPCRs के रूप में इसी तरह के तंत्र है, जो आम चिकित्सकीय लक्ष्य कर रहे हैं के माध्यम से विनियमित है. इसलिए, रक्त वाहिकाओं में अपनी विनियमन के तंत्र को समझने के लिए उपयोगी डेटा प्रदान करने के लिए विरोधी उच्च रक्तचाप से ग्रस्त चिकित्सा के लिए एक लक्ष्य के रूप में अपनी क्षमता का निर्धारण करेगा.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
वर्णित परियोजना पुरस्कार R01 HL064761 नंबर, HL059868 R25, 1SC1 HL099139 और P20 MD000175 स्वास्थ्य के रूप राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान के आधिकारिक विचार जरूरी नहीं प्रतिनिधित्व करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Auto Dual Wire Myograph System-510ADMT-USA, Inc. | Atlanta, GA. | 100151 | |
| PowerLab/4SP Data Acquisition System |  ADInstruments |
ML750 | New models with 4-16 input channels are available. |
| Dell Dimension XPS Gen 4 Computer | Dell | ||
| Stemi SV II (Apo) Dissection Microscope with Ocular | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Wistar, Dahl salt-sensitive, Dahl salt-resistant rats | Harlan Laboratories | ||
| Rodent chow | Harlan Laboratories | ||
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | ||
| Other chemicals | All chemicals used were of the purest grades available commercially. |
References
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