Summary
यह आलेख वर्णन सतह लेबलिंग और
Abstract
भ्रूण epithelia जटिल विकृतियों (जैसे झुकने घुमा, तह, और खींच) से गुजरना करने के लिए जल्दी भ्रूण के आदिम अंगों फार्म. इन सेलुलर चादरों की सतहों पर मापकला मार्करों ट्रैकिंग विकास, संकुचन और कतरनी, जैसे morphogenetic मात्रा के आकलन के लिए एक विधि अच्छी तरह से स्थापित है. हालांकि, नहीं सतह लेबलिंग सभी तकनीकों पारंपरिक इमेजिंग रूपात्मकता के लिए आसानी से निभा रहे हैं और अलग अलग फायदे और सीमाएं अधिकारी. यहाँ, हम दो लेबलिंग तरीकों का वर्णन और प्रत्येक तकनीक की उपयोगिता का वर्णन है. पहली विधि में, फ्लोरोसेंट लेबल के सैकड़ों के साथ चुंबकीय लौह कणों का उपयोग भ्रूण के लिए लागू कर रहे हैं. इन लेबलों तो morphogenesis दौरान 2-D ऊतक विरूपण मात्रा के लिए प्रयोग किया जाता है. दूसरी विधि में, polystyrene microspheres गैर इनवेसिव ऑप्टिकल जुटना tomography इमेजिंग (अक्टूबर) में इसके विपरीत एजेंट के रूप में उपयोग किया जाता है 3-D ऊतक विरूपण ट्रैक. इन तकनीकों में सफल रहा हैly हमारे लिए जल्दी सिर गुना, हृदय, और मस्तिष्क के विकास के शारीरिक तंत्र studythe प्रयोगशाला में लागू है, और एक विस्तृत श्रृंखला morphogenetic प्रक्रियाओं के लिए अनुकूलनीय होना चाहिए.
Protocol
1. जनरल प्रायोगिक तैयारी
- लामिना का प्रवाह हुड में टिशू कल्चर मध्यम तैयार करें.
- Dulbecco संशोधित ईगल (DMEM) मध्यम (1 4.5g / एल ग्लूकोज के साथ एल बोतल, सोडियम बिकारबोनिट, और एल glutamine) पतला. 10 एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन / neomycin एंटीबायोटिक दवाओं जोड़ें.
- एक बाँझ हस्तांतरण विंदुक के साथ DMEM के 100 एमएल निकालें और लड़की सीरम के 100 एमएल के साथ प्रतिस्थापित.
- अशेष भाजक DMEM/10% सीरम बाँझ 15 एमएल शंक्वाकार शीशियों और फ्रीज में लड़की / 1% एंटीबायोटिक दवाओं.
- तैयार फॉस्फेट (पीबीएस) खारा कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ पूरक buffered. मिक्स 100 एमएल 10X Pbs, 900 एमएल विआयनीकृत पानी, और एक केंद्रित कैल्शियम और मैग्नीशियम समाधान (100 मिलीग्राम / एमएल CaCl 2 • 2H 2 हे, 100mg/mL 2 MgCl • 6 2 हे) के 1 एमएल.
- इच्छित मंच पर एक अनुदैर्ध्य उन्मुखीकरण हैम्बर्गर और 1 हैमिल्टन (यानी एच एच 5 चरण के लिए 23-25 घंटे, या 42 द्वारा परिभाषित के रूप में अंडों को सेतेएचएच चरणों 11-12) के लिए -48 घंटे.
- फिल्टर पेपर वाहक पद्धति का उपयोग करके अंडे से भ्रूण निकालें.
- A150 मिमी पेट्री डिश की तरफ अंडे के नीचे क्रैक. नीचे से अलग खोल खींचो और डिश में अंडे की सामग्री खाली.
- कुंद संदंश का उपयोग अंडे से मोटा, चिपचिपा अंडे की सफ़ेदी निकालें.
- वाटमान # 2 फिल्टर पेपर 2-3 सेमी की कट हलकों. व्यास में. फिल्टर पेपर के बीच में एक छेद पंच, पंच छेद का उपयोग करना. एक एक तरह से है कि अंगूठी में केंद्रीय छेद के माध्यम से दिखाई भ्रूण रहता में जर्दी पर फिल्टर पेपर के छल्ले के रखें.
- Microscissors के साथ फिल्टर पेपर के बाहरी व्यास के आसपास कट. ठीक संदंश के साथ जर्दी से अखबार निकालें.
- धीरे पीबीएस में भ्रूण के अनुयायी जर्दी कणों को दूर कुल्ला. (HH5 भ्रूण के लिए 15-20 मिनट के रूप में लंबे समय के रूप में सोख जरूरत अवशिष्ट जर्दी निकाल सकते हैं). फिल्टर पेपर विधानसभा स्नान से निकालें और यह ventral पक्ष में एक जगह35 मिमी संस्कृति डिश. पहली के ऊपर एक दूसरे फिल्टर पेपर अंगूठी, छल्ले के बीच भ्रूण sandwiching रखें. भ्रूण सुरक्षित - फिल्टर पेपर (2 सेमी व्यास ≈ 1.5) सैंडविच के बाहर चारों ओर एक धातु की अंगूठी रखो.
- भ्रूण मध्यम संस्कृति में डूब. उचित और एक चमकदार क्षेत्र माइक्रोस्कोप के साथ भ्रूण चरण आकारिकी सत्यापित करें.
- एक विंदुक खींचने का प्रयोग बाद में ऊतक dissections और लेबलिंग के लिए ठीक टिप गिलास सुई (1.5 मिमी भीतरी व्यास) (विश्व परिशुद्धता उपकरण, Sarasota FL) तैयार है.
2. एचएच स्टेज के DiI लेबल 5 चुंबकीय लौह कण का उपयोग भ्रूण
- लौह चूर्ण के एक छोटे से कमरे के तापमान पर (लोहे कम, Mallinckrodt बेकर, इंक, फ़िलिप्सबर्ग, न्यू जर्सी) मात्रा में शराब में एक संतृप्त DiI की कुछ बूँदें जोड़ें और सूखी. (यह आमतौर पर केक करने के लिए कणों को एक साथ का कारण बनता है एक बार शराब सुखाया गया है.) Clumped लोहे के कणों को तोड़ने के लिए एक खींच micropipette के टिप का उपयोग करें,उन्हें एक microcentrifuge ट्यूब हस्तांतरण, और उन्हें कई बार कुल्ला और विआयनीकृत जल के साथ कवर.
- एचएच चरण 5 भ्रूण में बहिर्जनस्तरीय कोशिकाओं लेबल, काटा भ्रूण जगह (यानी, पूरे फिल्टर पेपर विधानसभा) पृष्ठीय पक्ष एक 35 मिमी संस्कृति संस्कृति मीडिया के एक उदार परत के साथ कवर पकवान में पकवान और एक विदारक खुर्दबीन के नीचे डाल दिया. एक गिलास सुई का प्रयोग पीतक झिल्ली को हटा दें और बहिर्जनस्तरीय कोशिकाओं को बेनकाब. (भ्रूण बेध नहीं ख्याल रखना.)
- लेबल पाश्चर पिपेट में लोहे के कणों (विआयनीकृत जल में) का एक स्तंभ ड्रा. विदारक माइक्रोस्कोप डूब, द्रव और भ्रूण बस के ऊपर सतह की स्थिति के नीचे विंदुक टिप का उपयोग करना. विंदुक उंगलियों के बीच धीरे - धीरे वापस और आगे रोलिंग कणों धक्रका pipiette के बाहर और उन्हें भ्रूण भर छिड़के.
- एक बार भ्रूण कणों के साथ कवर किया जाता है, ध्यान से लगभग 10 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में यह जगह. भ्रूण इनक्यूबेटर के बाहर ले लोएक मजबूत चुंबक का उपयोग करने के लिए कणों को दूर.
- संलग्न वीडियो कैमरा और उचित फ़िल्टर सेटिंग्स के साथ एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए दोनों उज्ज्वल क्षेत्र और भ्रूण के फ्लोरोसेंट छवियों के अधिग्रहण के रूप में चित्र 2A, बी में दिखाया गया है
- नोट लेबल घनत्व. यदि एक denser वितरण वांछित है, अतिरिक्त कणों का उपयोग करें (जैसा ऊपर वर्णित) भ्रूण फिर से लेबल और ऊष्मायन समय के हिसाब से विस्तार. यदि लेबल भी घने हैं, microcentrifuge पहले से ही लेबल कणों के साथ भरा ट्यूब unlabeled लोहे के कणों की एक छोटी मात्रा जोड़ने और ट्यूब सामग्री मिश्रण. एक नया भ्रूण के साथ लेबलिंग प्रक्रिया को दोहराएँ और फिर लेबल घनत्व ध्यान दें.
3. Polystyrene Microsphere लेबल HH11-12 भ्रूणों के लिए ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी इमेजिंग (अक्टूबर)
- एक 35 मिमी पेट्री डिश में काले पीबीएस में 10 सुक्ष्ममापी व्यास microspheres (Polysciences इंक, Warrington, फिलीस्तीनी अथॉरिटी) के एक समाधान तैयार करें. (मोती काफी बड़े के लिए अक्टूबर के लिए इसके विपरीत उत्पन्न किया जाना चाहिएइमेजिंग, लेकिन ऐसी है कि मनका आकार व्यक्ति की कोशिकाओं के आदेश पर काफी छोटा है. विशिष्ट मान अपने अक्टूबर प्रणाली के संकल्प के आधार पर अलग अलग और ऊतकों का अध्ययन किया जा रहा है). स्टॉक समाधान पीबीएस के एमएल प्रति (2.6% ठोस - लेटेक्स) की एक बूंद आम तौर पर पर्याप्त है. एक 10cc सिरिंज में एक 22 गेज सुई का उपयोग करते हुए इस समाधान खींचो. भंवर 30 सेकंड के एक समान मनका वितरण सुनिश्चित करने के लिए समाधान.
- बेवेल अपने खींचा गिलास एक कंप्यूटर हार्ड ड्राइव 2 का उपयोग कर सुई की युक्तियाँ. टिप व्यास काफी बड़ी है कि मोती खोलने के माध्यम से फिट कर सकते हैं होना चाहिए, लेकिन एक ही समय में, के रूप में संभव के रूप में छोटे इंजेक्शन के दौरान ऊतक घायल को कम करने के लिए.
- मनका सिरिंज का उपयोग कर समाधान के साथ एक beveled गिलास सुई भरें. हल्के करने के लिए सुनिश्चित करें कि समाधान टिप तक पहुँच गया है micropipette झटका.
- एक micromanipulator का प्रयोग, भ्रूण के रूप में देखने के में एक ही क्षेत्र में कांच सुई जगह है. मोती विंदुक टिप के बाहर बह चाहिए.
- यदि कोई BEA केडी एस micropipette बाहर निकलते हैं, वहाँ एक रोकना हो सकता है. इस मामले में, दोहराने चरण एक नई गिलास सुई के साथ 3.2-3.4.
- अगर बहुत सारे मोती देखने के अपने क्षेत्र बादल, अपने विंदुक टिप बहुत व्यापक हो सकता है. दोहराएँ चरण एक नया विंदुक और एक नया भ्रूण के साथ 3.2-3.4.
- मस्तिष्क ट्यूब के लुमेन में पिपेट टिप डालें. नहीं पियर्स ऊतक के वेंट्रल मंजिल यकीन है. आप ऊतक के एक क्षणिक सूजन देखने के रूप में मोती और तरल पदार्थ लुमेन में प्रवेश करेंगे. यह एक सफल इंटुबैषेण इंगित करता है, अब, जल्दी से गिलास सुई निकाल.
- मस्तिष्क एक चमकदार क्षेत्र सूक्ष्मदर्शी का उपयोग ट्यूब के भीतर लुमेन में पर्याप्त मनका घनत्व सत्यापित करें. संप्रदाय के लिए आगे बढ़ने से पहले 30 मिनट - चलो मोती 20 के लिए व्यवस्थित. 4.
4. आँकड़ा अर्जन
* निम्न विधियों अच्छी तरह से ऊपर वर्णित प्रतिदीप्ति लेबलिंग तकनीक के लिए अनुकूल हैं. हालांकि, microsphere लेबलिंग तकनीक के साथ, मोती जब नमूने स्थानांतरित बेदखल कर सकते हैंइन्क्यूबेटरों और इमेजिंग सिस्टम के बीच. इस मामले में यह सबसे अच्छा है के लिए 4.2 (जो नमूना / आंदोलन आंदोलन पूरी तरह से बचा जाता है) एक कदम आगे बढ़ना. दोनों तरीकों में, भ्रूण जबकि तरल मध्यम संस्कृति में डूबे हुए सुसंस्कृत हैं. यदि भ्रूण पूरी तरह से (के रूप में कुछ पारंपरिक टिशू कल्चर तकनीक के साथ मामला है) जलमग्न नहीं है, ऊतक ज्यामिति बहुत असामान्य रूप से उच्च सतह तनाव लोड और तनाव वितरण द्वारा बदल दिया है करने के लिए सही सामान्य 3 - डी 3 morphogenesis, 4 पर कब्जा विफल हो जाएगा. इसके अलावा, ऊतक submerging उज्ज्वल अक्टूबर इमेजिंग के दौरान तरल गैस इंटरफ़ेस में भ्रूण आकारिकी और मार्कर निर्देशांक obscuring से मनाया विपरीत रोकता है.
- भ्रूण संस्कृति (सामान्य)
- अपनी पहली छवियों (उज्ज्वल क्षेत्र, प्रतिदीप्ति, या अक्टूबर) को प्राप्त करने के बाद, सात 35 मिमी संस्कृति व्यंजन (भ्रूण के साथ) और एक 150 मिमी पेट्री डिश में डाल एक छोटे से प्लास्टिक की थैली में पूरे विधानसभा जगह. Humidification के लिए बैग करने के लिए विआयनीकृत जल की बूंदों के एक जोड़े को जोड़ेंबैग और एक 95% 2 हे / 5% सीओ 2 मिश्रण के साथ भरें . इनक्यूबेटर में 37 भ्रूण प्लेस डिग्री सेल्सियस (पंक्ति Stabiletherm, Asheville, नेकां) अगले इमेजिंग timepoint जब तक वांछित समय के लिए. इस पद्धति का उपयोग करके, प्रयोगों एक ही दिन में कई भ्रूण पर प्रदर्शन किया जा सकता है.
- समय चूक संस्कृति (स्वचालित)
- अपने लेबल भ्रूण संस्कृति के माध्यम से 1.2 एमएल युक्त, एक टी डेल्टा (Bioptechs, बटलर, फिलीस्तीनी अथॉरिटी 35 मिमी बाहरी व्यास, पतला ओर दीवार के साथ 23 मिमी केंद्रीय एपर्चर, 0.17mm मोटे शीशे) डिश में रखें.
- 37 पर एक गिलास रखा ढक्कन के साथ पकवान कवर डिग्री सेल्सियस Bioptechs डेल्टा टी -4 संस्कृति डिश नियंत्रक (संक्षेपण को रोकने के के लिए) का उपयोग कर. एक 95% 2 हे / 5% सीओ 2 गैस मिश्रण एक परिवर्तनीय मिनी पम्प फ्लो डिवाइस (फिशर साइंटिफिक) से आपूर्ति के साथ भ्रूण Superfuse . पहले भ्रूण, गर्मी तक पहुँचने और विआयनीकृत जल के माध्यम से यह एक गर्म (<100 ° सी) गर्म थाली पर बुदबुदाती द्वारा गैस गीला. इस प्रयोगात्मक एस का एक योजनाबद्धएट अप चित्र 1 में दिखाया गया है.
- सॉफ्टवेयर सेट को स्वचालित रूप से उपयोगकर्ता द्वारा निर्दिष्ट समय अंतराल पर छवियों अधिग्रहण. हमारे प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के लिए, हम Openlab सॉफ्टवेयर (PerkinElmer, Waltham, MA) का उपयोग करें, और हमारे अक्टूबर प्रणाली के लिए, हम बह स्रोत Thorlabs सॉफ्टवेयर (न्यूटन, NJ) का उपयोग करें, क्योंकि इस पद्धति वर्तमान ही में एक प्रयोग समय चूक से निपटने में सक्षम है. एक समय, यह अक्सर करने के लिए सबसे अच्छा है संस्कृतियों के इन प्रकार रातोंरात चलाने के लिए अनुमति देते हैं. एक एक स्वचालित अनुवाद इमेजिंग प्रणाली के 5 हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर दोनों के साथ संगत चरण को स्थापित करने से इस सीमा को दरकिनार कर सकता.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
लेबल स्वचालित रूप से ट्रैक किए गए हैं (Volocity का उपयोग कर, PerkinElmer) या मैन्युअल रूप से प्रत्येक प्रयोग में (ImageJ में मैनुअल ट्रैकिंग प्लगइन का उपयोग करके, एनआईएच). फ्लोरोसेंट लेबलिंग तकनीक में, हम Matlab दिनचर्या gridfit का उपयोग करने के लिए मार्कर निर्देशांक, जो सक्षम बनाता है के माध्यम से 2 डी सतहों फिट morphogenetic सतह उपभेदों 6, 7 होने की गणना की. मानक समीकरणों के लिए एक प्रासंगिक भ्रूण समन्वय प्रणाली में इन मूल्यों को बदलने के लिए उपयोग किया जाता है. वैकल्पिक रूप से, अक्टूबर तकनीक में, सतहों खंडों छवि (Matlab या कैरट 8 के रूप में मानक सॉफ्टवेयर के माध्यम से प्राप्त) मात्रा और दबाव से उत्पन्न कर रहे हैं 9 नमूने की अधिकतम या न्यूनतम वक्रता की दिशा में गणना की जा सकती है.
हम अपने लोहे के कण तकनीक का इस्तेमाल करने के लिए लेबल और सिर जल्दी लड़की भ्रूण में गुना गठन के दौरान बहिर्जनस्तरीय कोशिकाओं की गति को ट्रैक. जैसा कि चित्र 2A में दर्शाया है, fluorescently लेबल कोशिकाओं पूरे भ्रूण भर में वितरित किए गए. उज्ज्वल क्षेत्र और भ्रूण की छवियों फ्लोरोसेंट पूर्व ओवो संस्कृति के दौरान विभिन्न अंतराल पर कब्जा कर लिया गया. ट्रैक किए गए लेबल (छवि 2B, सी) की गति तो सिर गुना गठन के दौरान विकसित morphogenetic तनाव वितरण (छवि 2 डी एफ) की गणना के लिए इस्तेमाल किया गया.
टी "> इसी प्रकार, हमारे polystyrene microsphere तकनीक जल्दी लड़की मस्तिष्क के मध्य hindbrain में सीमा ऊतक गतिविधियों पर नज़र रखने में इस्तेमाल किया गया था के रूप में चित्रा 3 बी.डी. में दिखाया गया है, मनका गतियों 6 घंटे और उपभेदों के लिए ट्रैक किए गए थे अनुदैर्ध्य और ऊतक विरूपण निस्र्पक परिधीय दिशाओं मार्कर निर्देशांक नोट से गणना की गई है कि इस विधि साफ़ 3-D विरूपणों से निपटने में सक्षम है के रूप में मोती के मस्तिष्क के भीतर लुमेन (छवि 3A) के सभी पक्षों के लिए छड़ी करने के लिए करते हैं.
चित्रा 1 सेट अप के समय चूक टिशू कल्चर के लिए योजनाबद्ध.
चित्रा 2 जल्दी लड़की पर नज़र रखी फ्लोरोसेंट लेबल का उपयोग भ्रूण में 2-D ऊतक विरूपण बढ़ाता है . (ए) लोहे के कणों को हटाने के बाद विलय क्षेत्र उज्ज्वल / फ्लोरोसेंट एचएच चरण 5 भ्रूण की छवि. DiI - लेबलएड बहिर्जनस्तरीय कोशिकाओं (लाल) पूरे भ्रूण भर में वितरित कर रहे हैं. (बी, सी) लेबल कोशिकाओं की गति ImageJ का उपयोग कर लगाया गया था. लेबल displacements भ्रूण निर्देशांक (एक्स, वाई) में गणना की गई. ध्यान दें कि ए और बी एक ही छवि कर रहे हैं. (लोमो) सिर गुना गठन के दौरान अनुदैर्ध्य तनाव वितरण विकसित भूखंडों कंटूर. अनुदैर्ध्य लाग्रंगियन उपभेदों रिश्तेदार गणना की गई करने के लिए 5 चरण एचएच (यानी, ए और बी) (डी) 75 मिनट के बाद, (ई) 120 मिनट, और (एफ) ऊष्मायन 165 मिनट. इन उपभेदों वाई अक्ष के साथ लाइन मूल उन्मुख तत्वों की लंबाई में परिवर्तन (चरण 5 भ्रूण में) की विशेषताएँ हैं. ट्रैक किए गए लेबल का उपयोग morphogenetic उपभेदों की गणना निर्देशांक पर आगे की जानकारी Filas एट अल (2007) 6 और Varner एट अल (2010) 7. पाया जा सकता है है. नोट है कि सी और एफ एक ही छवि कर रहे हैं. स्केल बार = 500 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 3 3-D ऊतक घ बढ़ाता.जल्दी लड़की के दिमाग में eformations. (ए) मस्तिष्क ट्यूब के Polystyrene microspheres कि पृष्ठीय (काला तीर) का पालन करना और ventral (सफेद तीर) पक्षों अक्टूबर पुनर्निर्माण के अनुप्रस्थ पार section.Ventral दृश्य में ऊतकों आसपास से आसानी से प्रत्यक्ष कर रहे हैं मध्य hindbrain सीमा के निकट microsphere स्थानों शो (सी) (बी) HH12 में और बाद में ऊष्मायन 6 घंटा (एम: मध्यमस्तिष्क, एच: hindbrain). मोतियों के कई समूहों के लिए ऊतक के समग्र विरूपण को उजागर करने के लिए रेखांकित कर रहे हैं. (डी) (ई zz) अनुदैर्ध्य और परिधीय (ई θθ) लाग्रंगियन उपभेदों इन विकृतियों से गणना की गई. मध्य hindbrain सीमा पर सकारात्मक अनुदैर्ध्य और नकारात्मक परिधीय उपभेदों एक लंबी अक्षीय और संस्कृति के दौरान इस क्षेत्र के परिधीय छोटा दर्शाते हैं. जटिल सतहों के लिए morphogenesis दौरान morphogenetic उपभेदों की गणना पर आगे की जानकारी Filas एट अल (2008) 9 में पाया जा सकता है है. स्केल बार = 200 सुक्ष्ममापी.
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Discussion
दो ऊतक लेबलिंग तकनीक जल्दी लड़की भ्रूण की पूर्व ओवो संस्कृति के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं . पहली फ्लोरोसेंट lipophilic चुंबकीय लौह कणों के माध्यम से वितरित करने के लिए एक साथ कोशिकाओं के सैकड़ों लेबल रंगों का उपयोग करता है. हालांकि, इस पद्धति वर्तमान में, फ्लोरोसेंट रंजक के रूप में आम तौर पर 10 अक्तूबर का उपयोग आसपास के ऊतकों से थोड़ा विपरीत शो ऑप्टिकल जुटना tomography के साथ संगत नहीं है. इसलिए, हम एक वैकल्पिक तकनीक polystyrene microspheres का उपयोग करने के लिए समय चूक अक्टूबर विश्लेषण के लिए ऊतकों लेबल दिखाते हैं. इस तकनीक के 3-D डेटासेट पैदावार लेकिन देखभाल के ऊतकों से मोती बेदखल नहीं लिया जाना चाहिए. उचित प्रयोगात्मक सेटिंग में या तो इन तरीकों की एक का उपयोग विश्वसनीय ऊतक और जल्दी भ्रूण में पूर्व ओवो विकास लेबलिंग प्रदान करना चाहिए. दोनों तरीकों को आसानी से उपलब्ध है, अपेक्षाकृत कम लागत वाली सामग्री (जैसे, लौह चूर्ण, polystyrene microspheres) का उपयोग करें और सक्षम ऊतक विरूपण morphogenesis दौरान मात्रा हो.दोनों ही मामलों में ऊतक मार्करों आसानी से और reproducibly भ्रूण के ऊतकों को लागू हो और विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है, इन प्रयोगों के क्षेत्र में नए चेहरे के लिए सुलभ बना कर सकते हैं. Visualizing और परिणामी डेटा (जैसे, कंप्यूटिंग morphogenetic तनाव नक्शे के द्वारा) का विश्लेषण morphogenesis के यांत्रिकी रोशन अपने मॉडल प्रणाली 6, 7, 9, 11, 12 में मदद करनी चाहिए.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम NIH अनुदान GM075200 R01 और R01 HL083393 (LAT) द्वारा समर्थित किया गया. हम T90 DA022871 NIH और रेडियोलॉजी Mallinckrodt संस्थान से BAF के लिए फैलोशिप समर्थन स्वीकार करते हैं, और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन से 09PRE2060795 अनुदान से VDV के लिए.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM — high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Sigma-Aldrich | P4083 | |
| Chicken Serum | Invitrogen | 16110-082 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X |
| Whatman #2 Filter Paper | Whatman, GE Healthcare | 1002 090 | 90mm diameter |
| Glass Micropipettes | World Precision Instruments, Inc. | TW150-6 | 1.5mm inner diameter |
| DiI | Invitrogen | D-282 | |
| Iron Reduced | Mallinckrodt Baker Inc. | 5320 | |
| 10 μm Diameter Microspheres (black) | Polysciences, Inc. | 24294 | |
| Delta T Dish (for time lapse culture) | Bioptechs | 04200415B | 0.17mm thick, black |
| Delta T4 Culture Dish Controller | Bioptechs | 0420-4-03 | |
| Mini-Pump Variable Flow Device | Fisher Scientific |
References
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Canfield, J. G. Dry beveling micropipettes using a computer hard drive. J. Neurosci. Methods. 158, 19-21 (2006).
- Voronov, D. A., Taber, L. A. Cardiac looping in experimental conditions: the effects of extraembryonic forces. Developmental Dynamics. 224, 413-421 (2002).
- Filas, B. A., Bayly, P. V., Taber, L. A. Mechanical stress as a regulator of cytoskeletal contractility and nuclear shape in embryonic epithelia. Ann. Biomed. Eng. 39, 443-454 (2011).
- Kozel, B. A. Elastic fiber formation: a dynamic view of extracellular matrix assembly using timer reporters. J. Cell. Physiol. 207, 87-96 (2006).
- Filas, B. A., Efimov, I. R., Taber, L. A. Optical coherence tomography as a tool for measuring morphogenetic deformation of the looping heart. Anat. Rec. 290, 1057-1068 (2007).
- Varner, V. D., Voronov, D. A., Taber, L. A. Mechanics of head fold formation: investigating tissue-level forces during early development. Development. 137, 3801-3811 (2010).
- Van Essen, D. C. An integrated software suite for surface-based analyses of cerebral cortex. J. Am. Med. Inform. Assoc. 8, 443-459 (2001).
- Filas, B. A., Knutsen, A. K., Bayly, P. V., Taber, L. A. A new method for measuring deformation of folding surfaces during morphogenesis. J. Biomech. Eng. 130, 061010-061010 (2008).
- Yuan, S. Co-registered optical coherence tomography and fluorescence molecular imaging for simultaneous morphological and molecular imaging. Phys. Med. Biol. 55, 191-206 (2010).
- Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Ann. Biomed. Eng. 33, 854-865 (2005).
- Blanchard, G. B. Tissue tectonics: morphogenetic strain rates, cell shape change and intercalation. Nat. Methods. 6, 458-464 (2009).
