Summary
이 동영상은 FlexStation 3을 사용 인간 TRPA1 채널의 약리 프로필을 공부에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 프로토콜은 세포 준비, 염료 로딩과 microplate 리더 FlexStation 3 작업의 세부 사항을 다룹니다.
Abstract
분자 장치 'FlexStation 3 멀티 잘 접시에 자동 형광 측정 가능한 benchtop 다중 모드 microplate 리더입니다. 그것은 학술 설정에서 중간에 높은 처리량 화면에 이상적입니다. 그것은 멀티 채널 pipetter과 기계가 형광 시약의 다양한 형광 변화를 모니터링하기 위해 한 번에 한 컬럼을 읽고 갖춘 통합 유체 전송 모듈이 있습니다. 예를 들어, FlexStation 3 + - 투과 이온 채널과 G 단백질 결합 수용체 세포 무료 칼슘 2 + 수준의 변화를 측정하여 칼슘 2의 기능을 연구하는 데 사용되었습니다. 과도 수용체 잠재적인 (TRP) 채널은 많은 생리와 pathophysiological 기능에 중요한 역할을 nonselective 양이온 채널의 큰 가족입니다. TRP 채널의 대부분은 칼슘 투과하고 활성화시 칼슘 유입을 유도. 이 비디오에서는, 우리는 TRPA1 채널, 다양한 유해 자극에 대해 분자 센서의 약리 프로필을 공부 FlexStation 3 응용 프로그램을 보여줍니다. transiently 또는 안정 96 - 웰 플레이트에서 자란 인간 TRPA1 채널을, 표현 HEK293 세포가 + 민감한 형광 염료 칼슘 2, Fluo - 4, 이러한 세포의 실시간 형광 변경 로드된은의 적용 전과하는 동안 측정 FlexStation 3 플렉스 모드를 사용하여 TRPA1 아고 니스트. putative TRPA1 길항제의 영향도 조사했다. 데이터는 TRPA1 activators와 억제제의 농도 - 반응 관계를 구축하기 위해 SoftMax Pro 소프트웨어에서 전송됩니다.
Protocol
1. 96 - 웰 플레이트에 셀 준비
transiently cDNA 인간 TRPA1와 trasfected HEK293 세포에 대한
- HEK293 세포는 10 %의 열 inactivated 태아 소 혈청 (Invitrogen, 16000-044)와 보충 4.5 MG / ML 포도당 (써모 과학, SH3002201)이있는 Dulbecco의 최소 필수 매체 1~2일 (DMEM), 50 단위 재배 / ML 페니실린 50 μg / ML 스트렙토 마이신 (Invitrogen, 15140-163). transfection의 날, 세포 밀도는 70-90%에 도달해야합니다.
- 각 물론 50 μl 폴리 - L - ornithine (시그마 P3655, 멸균 증류수에 20 μg / ML)를 pipetting 37에서 잠복기 ° C를 최소한 15 분에 의해 외투 96 - 웰 플레이트. Dulbecco의 인산 각각 잘 한 번 씻어도 MG이없이 살린 (DPBS)를 버퍼 + 및 CA 2 + (써모 과학, SH3002803). 번호판은 몇 시간 동안 세포 배양 후드에 남아있을 수 있습니다.
- 96 - 웰 플레이트 모든 잘 들어, 1.5 ML Eppendorf 튜브 25 μl OPTI - 멤 (Invitrogen, 31985-070)의 cDNA 0.2 μg에 희석. 동일한 cDNA로 transfected 수 웰스의 숫자에 따라 비례 최대 규모. 또한 transfected하는 각 물론 25 μl OPTI - 멤 별도의 1.5 ML Eppendorf 튜브 0.4 μl Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019)에 희석. transfected 수 웰스의 총 개수에 따라 최대이 크기.
- 간단히 와동 희석 cDNA와 Lipofectamine 2000을주고 약 5 분 실온에서 앉아 보자.
- 희석 cDNA, 소용돌이가 들어있는 튜브에 희석 Lipofectamine 2000의 동일한 볼륨을 전송하고 혼합물이 15 분 ~ 2 시간을 위해 실내 온도에 앉아 보자. 이 기간 동안, 49 μl에 / 잘 폴리 - L - ornithine 코팅 판에 Lipofectamine / cDNA 2,000 혼합물을 전송합니다.
- HEK293 세포를 (단계 1.1) Trypsinize, hemocytometer 또는 카운테스 자동 세포 계수기 (Invitrogen, C10227)를 사용하여 셀 밀도를 계산하고, 15 ML 멸균에 (일반적으로 약 ~ 125,000-150,000 전지 / 음) 세포를 원하는 금액을 송금 원뿔 바닥 원심 분리기 튜브. 5 분 1,000 X의 RPM에서 원심 분리기. 10% 열 inactivated 태아 소 혈청과 보충 DMEM 문화 매체 ~ 1,250,00-1,500,000 세포 / ML,에서하지만, 항생제없이 Resuspend 세포.
- 멀티채널 pipetter 또는 MicroFill의 Microplate 디스펜서 (생물 테크)를 사용하여 cDNA - Lipofectamine 2,000 혼합을 포함하고있는 각 물론 98 μl 세포 현탁액을 분배. 접시가 humidified 세포 배양기 문화에 배치하기 전에 최소한 30 분 후드에 앉아 보자. ° C, 5 % CO 2 20-44 시간을위한 37 알을 품다.
안정 TRPA1을 표현하는 HEK293 세포에 대한
- 코트 96 - 웰 플레이트 단계 1.2를 따르십시오.
- inducible HEK293 - hTRPA1 셀 라인은 넉넉한 (Invitrogen, 박사 A. Patapoutian (스크립스 연구소)에 의해 제공하고 야생 타입 HEK293 세포 (단계 1.1)과 같은 매체를 유지하지만, 5 μg / ML blasticidin로 보충했습니다 A1113902) 50 μg / ML hygromycin B (Invitrogen, 10687010). 세포 밀도가 약 90 %에 도달하면, 세포를 trypsinize, 세포 밀도를 계산하고, 5 분 1000 X RPM에서 세포의 원하는 금액을 원심 분리기. doxycycline (피셔, BP26535, 0.25 μg / ML)로 보충 같은 문화 매체 ~ 1,000,000 세포 / ML의 밀도에 Resuspend 세포.
- μl / 잘 멀티채널 pipetter 또는 MicroFill (바이오 테크)를 사용하여 100 폴리 - L - ornithine 코팅 접시에 세포 현탁액을 분배. 접시가 humidified 세포 배양기 문화에 배치하기 전에 최소한 30 분 후드에 앉아 보자. 37 품어 ° C 5 % CO 16 2-24 시간.
2. 솔루션
- 행크의 버퍼 소금 용액 (HBSS)은 세포 솔루션으로 사용됩니다. 그것은 (MM)를 포함 137 NaCl, 5.4 KCl, 0.25 나 2 HPO 4, 0.44을
KH 2 PO 4, 1.3 CaCl 2, 1.0 MgSO 4, 1.0 1N NaOH를 사용하여 7.4으로 조정 산도와 MgCl 2, 10 포도당, 10 HEPES). - Fluo - 4 검정 버퍼 HBSS에 probenecid이 MM이 포함되어 있습니다. 0.5 N NaOH 250 MM 주식 probenecid (시그마, P8761)을 확인합니다. 1:125의 비율로 희석 HBSS. 1 N HCL을 사용하여 산도에 7.4을 재조 정해.
3. Fluo - 4이라서 셀 로딩
- 1 ㎜의 주식 솔루션을 만들기 위해 912 μl 무수 DMSO 1 MG Fluo - 4시 (Invitrogen, F14202)를 디졸브. Fluo - 4 재고 솔루션을 적어도 한 달 동안 -20 ° C에 저장할 수 있습니다 AM.
- 10 μl 1 ㎜를 섞어 Fluo - 4 다음 10 μl Pluronic F - 127 (Invitrogen, P3000MP, DMSO의 20 % (W / V) 솔루션) 5 ML Fluo - 4 분석 완충액 (단계 2.2)로 전체 내용을 전달 AM (시그마, A9418) 0.1 % 소 혈청 알부민과 보완.
- microplate 와셔 (예 : 바이오 테크에서 ELx405TM 등)를 사용하여 80 μl / 음 2 번에서 HBSS와 (단계 1.7 또는 1.10) 96 - 웰 플레이트에 성장 세포를 씻으십시오.
- Fluo 추가-4는 μl / 잘 다채널 pipetter 또는 MicroFill을 (바이오 테크)를 사용하여 37에서 번호판을 품어 50 (3.2 단계) 솔루션을 로딩 AM ° C 1 시간을 위해.
- ELx405TM의 microplate 와셔를 사용하여 Fluo - 4 분석 완충액 (단계 2.2.)으로 세포에게 3 번 씻으십시오. 마지막 세척 후, 각 우물에 Fluo - 4 검정 버퍼의 80 μl를 떠나.
4. 복합 접시의 준비
- 1 시간 셀 로딩 기간 동안, Fluo - 4 검정 버퍼에 원하는 최종 농도의 3 배의 agonists의 3 배 dilutions (또는 antagonists)의 시리즈를 준비합니다.
- 96 - 웰 복합 판으로 희석 복합 솔루션의 피펫 250-300 μl. FlexStation 3 한 번에 하나의 컬럼을 읽고 있기 때문에 그것이 가능한 때마다 복합 판의 동일한 열에있는 화합물과 해당 긍정적이고 부정적인 컨트롤의 시리얼 dilutions을 가지고 배열.
5. FlexStation 3 플레이트 읽기
- (FlexStation 3, 컴퓨터, 그리고 SoftMax 프로 5.2 소프트웨어) 시스템을 켜십시오
- 새 파일 이름으로 실험을 저장합니다. 설정에서 플렉스 모드를 선택하고 다음 값을 입력합니다 :
프로토콜 # 1 작용제 효과 
프로토콜 # 2 길항제 효과 
- FlexStation 3 해당 트레이에 새로운 팁 상자, 복합 판과 독서 접시를 놓고 버튼을 "읽기"를 클릭하십시오. FlexStation 3 한 번에 하나의 컬럼을 읽고 독서를 방해하지 않고 프로그램된 시간 지점에서 화합물을 추가합니다. 그것은 하나의 열로 표시하고 기계가 모든 열을 읽기까지로 단계 5.2 사용자에 의해 프로그램 수행 화합물 추가로 다음 칼럼을 읽고 계속을 읽는 끝내고 약 3 분 (프로토콜 # 2 5 분) 정도 소요됩니다.
6. 데이터 분석
- 실험 데이터는 직접 SoftMax 프로 5.2 소프트웨어를 사용하거나 복사 및 Microsoft Excel과 같은 스프레드 시트 프로그램, 붙여넣을 처리할 수 있습니다. TRPA1 작용제의 flufenamic 수 소산 (FFA)의 농도 - 반응 곡선은 다음과 같은 최소 제곱 피팅 루틴을 사용하여 구성되어 있습니다.
, Y가 관찰된 반응 어디에, Y 맥스가 표준 최대한의 응답이며, C는 해당 약물 농도이며, EC 50 반 최대한의 반응을 evoked 농도이며, N H는 명백한 힐 계수이다. putative TRPA1 길항제 화합물에 대한 농도 - 저해 곡선은이 FFA (100 μm의)의 고정 농도를 사용하고, 점차적으로이 다음에 맞는 최소 제곱으로 계산됩니다 화합물의 복합 A. IC 50 가치의 농도를 증가하여 얻을 수있다 방정식. 
어디 Y는 관찰된 반응이고 Y 최대가 최대 응답을 표준인데, [개미]에 해당 화합물의 농도이며, IC 50 FFA - evoked 응답의 절반 최대한 억제를 생산 길항제 농도이며, N H는 분명 힐입니다 계수.
, Y가 관찰된 반응 어디에, Y 맥스가 표준 최대한의 응답이며, C는 해당 약물 농도이며, EC 50 반 최대한의 반응을 evoked 농도이며, N H는 명백한 힐 계수이다. putative TRPA1 길항제 화합물에 대한 농도 - 저해 곡선은이 FFA (100 μm의)의 고정 농도를 사용하고, 점차적으로이 다음에 맞는 최소 제곱으로 계산됩니다 화합물의 복합 A. IC 50 가치의 농도를 증가하여 얻을 수있다 방정식. 
어디 Y는 관찰된 반응이고 Y 최대가 최대 응답을 표준인데, [개미]에 해당 화합물의 농도이며, IC 50 FFA - evoked 응답의 절반 최대한 억제를 생산 길항제 농도이며, N H는 분명 힐입니다 계수. 7. 대표 결과 :
TRPA1는 +에 민감한 염료 칼슘 2, Fluo - 4 (1-2)에 의해 감지 수있는 칼슘 유입에 이르게 활성화하는 칼슘 2 + - 투과 양이온 채널이다. HEK293 - hTRPA1 안정적인 세포 라인 TRPA1 agonists과 antagonists의 농도 - 반응 관계를 연구하는 데 사용되었다. 전지, Fluo - 4이라서 로드된 분석 버퍼의 80 μl에 배치하고, FlexStation 3을 사용 읽어되었습니다. 30 s에 대한 기준 형광을 기록 후, TRPA1 작용제, FFA의 시리얼 희석 40 μl, 원하는 최종 농도의 3 배 각은 fluidics 모듈의 일부로 포함 멀티 채널 pipetter을 통해 세포에 추가되었습니다 FlexStation 3. 형광 변경 사항은 추가로 180 S.에 대한 감시했다 각각 F와 F 0 관심과 독서의 시작 시점에 형광 값이다 - (F 0 F), 각 잘 대해 상대적 Fluo - 4 형광 변경 ΔF =으로 표현했다. FFA 농도의 일련의에 대한 응답으로 형광 변화 시간 코스의 대표 성분은 그림에 표시됩니다. 1. 최대한 응답 수준은 유사하지만, 활성화 반응 속도론은 낮은 FFA의 농도보다 더 높은에서 명확하게 빠른이며, 마지막 네 FFA의 농도에 대한 참고. 따라서 이러한 차이, 농도를 구별 - 반응 관계는 FFA의 다양한 농도 (그림 2)뿐만 아니라시 형광 증가의 초기 속도를 (경사) 측정에 의해 건설되었습니다. 하프 최대한의 효과FFA의 이브 농도 (EC 50) 55.4 μm의 (N = 3)으로 결정되었다. putative TRPA1 길항제를 테스트하려면 A를 화합물, 우리는 프로토콜 # 2 (2 단계)을 사용하여 비슷한 실험을 수행했습니다. 이 경우에는 길항제의 dilutions 일련의 30 S (배 원하는 최종 농도 40 μl)에 추가된 및 FFA는 (100 μm의의 최종 농도 300 μm의 60 μl) 나중에 180의 추가되었습니다. 컴파 운드 선량 - dependently 4.3 μm의의 반 최대한 억제 농도 (IC 50) (N = 3) (그림 2)와 FFA에 TRPA1 세포의 응답을 감소.
FFA에 의해 인간 TRPA1의 그림 1. 농도 - 의존 활성화. 성분은 시간이 지남에 따라 형광의 FFA - evoked 증가 (처음 60 S에서만 응답이 더 FFA - evoked 응답의 빠른 반응 속도론을 설명하는 표시됩니다)입니다. 높은 농도의 FFA 함께 형광 증가 evoked 점에 유의하십시오 훨씬 빠른 운동 낮은 농도에서보다 정상 형광 수준과 유사했다하더라도.
그림 2 농도 -. FFA - 유도 형광 변화와 화합물 안정 HEK293 세포에 표현 인간 TRPA1에 FFA 반응의 유도 억제를위한 대응 관계. Δ, 집중력 - FFA의 반응 관계가 FFA 농도의 변화를 추가시 표준 형광 증가의 초기 속도를 (경사) 측정에 의해 결정되었다. O, putative TRPA1 길항제에 의해 FFA - evoked 칼슘 반응의 억제의 농도 - 반응 관계, 화합물 A.
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Discussion
세포내 칼슘 2 +과 같은 신경 전달 물질 릴리즈 (3), 심장 활동 전위 (4), 근육 세포 수축 (5), 세포 신호 전달 (6-7) 및 excitotoxic 세포 죽음 (많은 생리와 병리 학적 조건에서 중요한 역할을 담당 8). 세포내 칼슘 2 + 수준의 측정 기능 + - 투과 채널 플라즈마 막이나 세포 organelles에서 칼슘 2의 변화와 공헌을 명료하게하다하는 데 도움이
위의 프로세스 (9-13)에 CA 2 +. 분석은 또한, 그 중 많은 G - 단백질 결합 수용체의 기능을 조사 활성화에 따라, + 상점 세포내 칼슘 2 칼슘 2 +를 방출 또는 다른 칼슘 2 활성화하여 세포내 자유 칼슘 2 + 농도를 증가로 이어질하는 데 사용할 수 있습니다 + 투과 이온 채널 (14-16). FlexStation 3 세포내 칼슘 2 + 농도의 증가와 함께, CA 2 + 사용 증가 형광 강도, 또는 ratiometric 변경을 일으키다 민감한 염료를합니다. 이 동영상이 문서에서는 heterologously HEK293 세포에 표현 + - 투과 TRPA1 채널 칼슘 2의 연구 FlexStation 3 응용 프로그램을 보여줍니다. 분배 pipetters를 (- 또는 16 채널 8) 전환 또는 384 웰 플레이트 형식 - 우리가 실험을 위해 96 - 웰 플레이트만을 사용했지만, 사용자는 쉽게 96에서 선택할 수 있습니다. 이 분석은 agonists 및 / 또는 antagonists의 높은 처리량 검사 기능에 대한 빠른 매체를 제공하며 많은 칼슘 2 + - 투과 이온 채널에 적용됩니다. 그러나, 그것은 세포 내 칼슘 분석은 이온 채널의 활동 간접 측정이라고 지적한다. 상세 후속 직접 세포막에 걸쳐 흐르는 이온 전류를 측정하는 패치 클램프 레코딩을 사용하는 연구는 아직 적절한 결론을 그릴 필요합니다.
신뢰할 수있는 데이터의 품질을 얻으려면, 다음과 같은주의 사항을 주의해야한다 :
- 이러한 HEK293 세포, 코팅으로 느슨하게 자기편 세포에 대한 번호판은 필수입니다. 그러나, 중국어 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 HELA 세포로 강하게 점착 성의 세포에 대한, 코팅은 필요하지 않습니다.
- 세포의 동일한 금액은 분석 당시 confluency 90~100% 사이 여야합니다 다중 잘 판 각 우물에 세포 밀도의 각 우물에 씨앗을 품고있다 중요합니다.
- 부드럽게 세포에 액체 분배와 세포를 로딩하고 세척 때 세포를 방해하지 마십시오.
- Probenecid는 염료 누출을 방지하기 위해 추가됩니다. probenecid는 또한 이온 채널에 영향을 미치지 이후 분석 버퍼에 포함 probenecid 실험에서 얻은 데이터를 해석하면 다만,주의 주의해야한다.
- 복합 판의 화합물 농도를 확인하려면, 각 잘하기 전에 샘플 판의 해당 잘와 화합물 외에 후 버퍼 볼륨에 따라위한 희석 요인을 고려하십시오.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 DRS 감사합니다. 존 핸콕, 레이 그릴, 앤드류 모리스과 지원 올가 Chumakova. FlexStation 3 시스템은 UTHSC Cytodynamic 이미징 시설의 일부입니다. 우리는 또한 DRS 감사합니다. 스크립스 연구소와 HEK293 - hTRPA1 안정 세포주를 제공 노바티스 연구 재단 (GNF)의 게놈 연구소에서 Ardem Patapoutian 마이클 Bandell. 연구는 NIH (MXZ에 GM081658)와 텍사스 메디컬 센터 소화기 질환 센터 (HH)을하고 미션 연결 / TIRR 재단 (HH로)에서 부여로 일부에서 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FlexStation 3 | Molecular Devices | FLEX3 | |
| 96-Well, FlexStation Pipet Tips | Molecular Devices | 9000-0912 | |
| 96-Well Plates | Greiner Bio-One | 655090 | |
| 96-Well Clear Flat Bottom plates | Costar | 3595 | |
| DMEM | Invitrogen | 12430-104 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14202 | |
| PluronicF-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P36551 | |
| probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 |
References
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