Summary
Den här videon ger en detaljerad protokoll för att studera den farmakologiska profilen för mänskliga TRPA1 kanaler med FlexStation 3. Protokollet omfattar detaljer cellberedningen, preparat lastning och drift av mikroplattan läsare, FlexStation 3.
Abstract
Molecular Devices "FlexStation 3 är en bänk multi-mode mikrotiterplatta läsare kan automatiserade fluorescens mätning i flera bra plattor. Den är idealisk för medel-till hög kapacitet skärmar i akademisk miljö. Den har en integrerad modul vätska överföra utrustad med ett flerkanals pipetter och maskinen läser en kolumn i taget för att övervaka fluorescens förändringar av olika fluorescerande reagenser. Till exempel har FlexStation 3 använts för att studera funktionen av Ca2 +-genomsläpplig jonkanaler och G-proteinkopplade receptorer genom att mäta förändringar av intracellulära fria Ca 2 + nivåer. Transient receptor potential (TRP) kanaler är en stor familj av icke-selektiva ning kanaler som spelar en viktig roll i många fysiologiska och patofysiologiska funktioner. De flesta av TRP-kanaler är kalcium genomsläpplig och framkalla kalciuminflödet vid aktivering. I denna video visar vi tillämpningen av FlexStation 3 för att studera den farmakologiska profil TRPA1 kanal, en molekylär sensor för många skadliga stimuli. HEK293 celler tillfälligt eller stabilt uttrycka mänskliga TRPA1 kanaler, som odlas i 96-brunnars plattor, är laddade med en Ca2 +-känsliga fluorescerande färg, Fluo-4 och realtid fluorescens förändringar i dessa celler mäts före och under tillämpningen av en TRPA1 agonist med FLEX läget i FlexStation 3. Effekten av en förmodad TRPA1 antagonist undersöktes också. Data överförs från SoftMax Pro att bygga koncentration-respons-relationer TRPA1 aktivatorer och hämmare.
Protocol
1. Cell beredningar i 96-brunnars plattor
För HEK293-celler övergående trasfected med mänskliga TRPA1 cDNA
- HEK293 celler odlas i en till två dagar i Dulbecco är minimal Essential Medium (DMEM) som innehåller 4,5 mg / ml glukos (Thermo Scientific, SH3002201), kompletterat med 10% värmeinaktiveras fetalt bovinserum (Invitrogen, 16.000-044), 50 enheter / ml penicillin och 50 mikrogram / ml streptomycin (Invitrogen, 15.140-163). På dagen för transfektion bör celltätheten nå 70-90%.
- Coat 96-brunnar genom att pipettera 50 l poly-L-Ornithine (Sigma P3655, 20 mikrogram / ml i sterilt destillerat vatten) till varje brunn och inkubera vid 37 ° C under minst 15 min. Skölj varje brunn gång med Dulbecco är Fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) utan Mg 2 + och Ca 2 + (Thermo Scientific, SH3002803). Plattan kan vara kvar i cellodling huven för ett par timmar.
- För varje brunn på en 96-brunnar, späd i ett 1,5 ml Eppendorf-rör 0,2 mikrogram cDNA i 25 l OPTI-MEM (Invitrogen, 31.985-070). Skala upp proportionellt efter det antal brunnar som ska transfekterade av samma cDNA. Även späda i en separat 1,5 ml Eppendorf-rör 0,4 l Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11.668-019) i 25 l OPTI-MEM för varje brunn ska transfekterade. Skala upp detta enligt det totala antalet brunnar som ska transfekterade.
- Kortfattat virvel den utspädda cDNA och Lipofectamine 2000 och låta dem sitta vid rumstemperatur i ca 5 min.
- Överför en lika stor volym av den utspädda Lipofectamine 2000 till röret som innehåller den utspädda cDNA, virvel och låt blandningen vila i rumstemperatur i 15 min till 2 timmar. Under denna tid, överföra cDNA / Lipofectamine 2000 blandning vid 49 l / brunn till poly-L-Ornithine plåt.
- Trypsinize den HEK293-celler (steg 1,1), räkna celltäthet med en hemocytometer eller Grevinnan automatiserad celltalsräknare (Invitrogen, C10227), och överför en önskad mängd celler (i allmänhet om ~ 125,000-150,000 celler / brunn) till en 15-ml steril konisk botten centrifugrör. Centrifugera vid 1000 x rpm under 5 minuter. Resuspendera celler vid ~ 1,250,00-1,500,000 celler / ml i DMEM odlingsmedium, kompletterad med 10% värmeinaktiveras fetalt bovinserum, men utan antibiotika.
- Dispensera 98 l cellsuspension till varje brunn som innehåller cDNA-Lipofectamine 2000 blandningen med en multikanal pipetter eller MicroFill mikroplattor Dispenser (Bio-Tek). Låt plattan sitter i huven i minst 30 minuter innan du placerar den på fuktad cellodling inkubator. Inkubera vid 37 ° C, 5% CO 2 för 20-44 timmar.
För HEK293-celler stabilt uttrycker TRPA1
- Följ steg 1,2 för att belägga 96-hålsplattor.
- Den inducerbara HEK293-hTRPA1 cellinje var generöst tillhandahålls av Dr A. Patapoutian (The Scripps Research Institute) och hållas i samma medium som den vildtyp HEK293-celler (steg 1,1), men kompletterad med 5 mikrogram / ml blasticidin (Invitrogen, A1113902) och 50 mikrogram / ml hygromycin B (Invitrogen, 10.687.010). När celltäthet når omkring 90%, trypsinize celler, räkna celltäthet, och centrifugera önskad mängd celler vid 1000 x rpm under 5 minuter. Resuspendera celler vid en densitet på ~ 1.000.000 celler / ml i samma odlingsmedium kompletteras med doxycyklin (Fisher, BP26535, 0,25 mikrogram / ml).
- Fördela cellsuspensionen till poly-L-Ornithine plåt vid 100 l / brunn med hjälp av en multikanals pipetter eller MicroFill (Bio-Tek). Låt plattan sitter i huven i minst 30 minuter innan du placerar den på fuktad cellodling inkubator. Inkubera vid 37 ° C, 5% CO 2 för 16 - 24 tim.
2. Lösningar
- Hanks buffrad saltlösning (HBSS) används som det extracellulära lösningen. Den innehåller (i mm): 137 NaCl, 5,4 KCl, 0,25 Na 2 HPO 4, 0,44
KH 2 PO 4, 1,3 CaCl 2, 1,0 MgSO 4, 1,0 MgCl 2, 10 glukos, 10 HEPES, med pH justeras till 7,4 med 1N NaOH). - Fluo-4-analysen buffert innehåller 2 mM probenecid hos HBSS. Gör 250 probenecid mM lager (Sigma, P8761) i 0,5 N NaOH. Späd till HBSS med förhållandet 1:125. Justera pH till 7,4 med 1 N HCl.
3. Cell lastning med Fluo-4:00
- Lös upp 1 mg Fluo-4 AM (Invitrogen, F14202) i 912 l vattenfri DMSO att göra en stamlösning av 1 mm. Den Fluo-4:00 stamlösningen kan förvaras vid -20 ° C i minst en månad.
- Blanda 10 l 1 mM Fluo-4 AM med 10 l Pluronic F-127 (Invitrogen, P3000MP, 20% (w / v) lösning i DMSO) och sedan överföra hela innehållet till 5 ml Fluo-4-analysen buffert (Steg 2,2) kompletteras med 0,1% bovint serumalbumin (Sigma, A9418).
- Tvätta cellerna odlas i 96-brunnar (Steg 1,7 eller 1,10) med HBSS vid 80 l / brunn 2 gånger med en mikroplatta bricka (som ELx405TM från Bio-Tek).
- Lägg till Fluo-4 AM buffertlösning (steg 3.2) vid 50 l / brunn med hjälp av en multikanals pipetter eller MicroFill (Bio-Tek) och inkubera plattan vid 37 ° C under 1 timme.
- Tvätta cellerna tre gånger med Fluo-4-analysen buffert (Steg 2,2.) Använder ELx405TM mikroplattan bricka. Efter den sista tvättningen, lämna 80 ìl av Fluo-4-analysen buffert i varje brunn.
4. Beredning av sammansatt plåt
- Under en timme cellen lastning tid, förbereda en serie 3x utspädningar av agonister (eller antagonister) för 3x av den önskade slutgiltiga koncentrationer i Fluo-4-analysen buffert.
- Pipettera 250-300 l av den utspädda sammansatta lösningar till ett 96-bra förening plattan. Ombesörja att den seriella spädningar av en förening och motsvarande positiva och negativa kontroller i samma kolumn i det sammansatta tallriken när det är möjligt eftersom FlexStation 3 lyder en enskild kolumn i taget.
5. Plate behandlingen i FlexStation 3
- Slå på systemet (FlexStation 3, datorn och SoftMax Pro 5,2 mjukvara)
- Spara experimentera med ett nytt filnamn. Vid installation, välj FLEX-läge och ange följande värden:
Protokoll # 1, agonist effekt 
Protokoll # 2, antagonist effekt 
- Placera en ny spets rutan förening tallrik och läsningen plattan lämpliga magasin i FlexStation 3 och klicka på "läs"-knappen. Den FlexStation 3 kommer att läsa en kolumn i taget och lägg föreningar vid förprogrammerade tidpunkter utan att avbryta läsningen. Det tar ca 3 min (5 min för protokoll # 2) för att läsa klart en kolumn och maskinen kommer att fortsätta att läsa nästa kolumn med föreningen görs tillägg som programmeras av användaren i steg 5,2 tills alla kolumner läses.
6. Dataanalys
- Experimentella data kan behandlas direkt med SoftMax Pro 5,2 mjukvara eller kopieras och klistras in i ett kalkylprogram, t.ex. Microsoft Excel. Koncentration-respons-kurva en TRPA1 agonist flufenamic syra (FFA) är konstruerad med hjälp av följande minsta-kvadrat passande rutin.
, Där Y är den observerade svar, är Y max den normaliserade maximal respons, är C motsvarande läkemedelskoncentrationen är EG 50 den koncentration som framkallat en halv maximal respons, och n H är den skenbara Hill koefficient. Koncentration-hämning kurvan för en förmodad TRPA1 antagonist förening A erhållits med hjälp av en fast koncentrationen av FFA (100 M), och successivt öka koncentrationen av substansen A. IC 50 i foderblandningar A beräknas med minsta kvadrat montering på följande ekvationen. 
, Där Y är observerad respons och Y max normaliseras maximal känslighet, [Ant] är motsvarande förening A: s koncentration är IC 50 antagonisten koncentration som producerar halvt maximal hämning av FFA frammanade-respons, och n H är den uppenbara Hill koefficient.
, Där Y är den observerade svar, är Y max den normaliserade maximal respons, är C motsvarande läkemedelskoncentrationen är EG 50 den koncentration som framkallat en halv maximal respons, och n H är den skenbara Hill koefficient. Koncentration-hämning kurvan för en förmodad TRPA1 antagonist förening A erhållits med hjälp av en fast koncentrationen av FFA (100 M), och successivt öka koncentrationen av substansen A. IC 50 i foderblandningar A beräknas med minsta kvadrat montering på följande ekvationen. 
, Där Y är observerad respons och Y max normaliseras maximal känslighet, [Ant] är motsvarande förening A: s koncentration är IC 50 antagonisten koncentration som producerar halvt maximal hämning av FFA frammanade-respons, och n H är den uppenbara Hill koefficient. 7. Representativa resultat:
TRPA1 är en Ca2 +-permeabla ning kanal, aktivering av vilket leder till kalciuminflödet som kan upptäckas av Ca2 +-känsliga färg, Fluo-4 (1-2). En HEK293-hTRPA1 stabila cellinje har använts för att studera koncentration-respons-relationer TRPA1 agonister och antagonister. Celler var lastade med Fluo-4 AM, placeras i 80 ìl av analysen buffert, och läsa med hjälp av FlexStation 3. När den baslinje fluorescens i 30 s var 40 ìl av en seriell utspädning av TRPA1 agonist, FFA, vardera 3x av den önskade slutliga koncentrationen, läggas till cellerna via en flerkanalig pipetter ingår som en del av Fluidics modulen av FlexStation 3. Fluorescensen förändringar övervakas för ytterligare 180 s. Den relativa Fluo-4 fluorescens förändringar för varje brunn uttrycktes som ΔF = (F - F 0), där F och F 0 är fluorescens värden vid tiden för intresse och i början av läsningen, respektive. Representant spår av tiden kurser till fluorescens förändringar som svar på en serie av FFA koncentrationer visas i bild. 1. Notera de senaste fyra FFA koncentrationer, även om maximal respons nivåerna är likartade, är aktiveringen kinetik klart snabbare vid högre än vid lägre FFA koncentrationer. Därför att skilja dessa skillnader, koncentration - respons byggdes genom att mäta den inledande satser (lutningen) av fluorescens öka vid tillsats av varierande halter av FFA (Fig. 2). Den halv maximal effektIve koncentration (EG 50) av FFA bestämdes till 55,4 mikroM (n = 3). För att testa den förmodade TRPA1 antagonist, Compound A, genomförde vi ett liknande experiment med hjälp av protokoll # 2 (steg 2). I detta fall var en serie spädningar av antagonisten added at 30 ar (40 ìl 3x önskade slutliga koncentrationer) och FFA inkom 180 ar senare (60 l vid 300 mikroM för en slutlig koncentration av 100 M). Compound A dosberoende minskat svar av TRPA1 cellerna att FFA med en halv maximal inhibition (IC 50) av 4,3 mikroM (n = 3) (Fig. 2).
Figur 1. Koncentrationsberoende aktivering av mänskliga TRPA1 av FFA. Spår är FFA-framkallade ökningen av fluorescens över tid (endast svar i de första 60 s visas för att bättre illustrera snabb kinetik för FFA-evoked potential). Observera att i högre koncentrationer FFA framkallat fluorescens öka med en mycket snabbare rörelseenergi än vid lägre koncentrationer, även om toppen fluorescens nivåerna var likartade.
Figur 2 Koncentration -. Responssamband för FFA-inducerad fluorescens förändring och förening A-inducerad hämning av FFA svar i mänskliga TRPA1 stabilt uttryckt i HEK293 celler. Δ, koncentration - respons av FFA bestämdes genom att mäta den inledande satser (lutningen) av normaliserade fluorescens öka vid tillsats av varierande halter av FFA. O, koncentration-respons-förhållandet mellan hämning av FFA frammanade-kalcium svar från en förmodad TRPA1 antagonist, förening A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intracellulär Ca 2 + spelar en viktig roll i många fysiologiska och patologiska tillstånd, såsom frisättningen av neurotransmittorer (3), hjärt aktionspotential (4), muskelcell kontraktion (5), cell signaltransduktion (6-7), och excitotoxic celldöd ( 8). Mätning av intracellulära Ca 2 + nivåer bidrar till att belysa funktionella förändringar av Ca2 +-genomsläppliga kanaler i plasmamembranet eller intracellulära organeller och bidrag
Ca 2 + till ovanstående processer (9-13). Analysen kan också användas för att undersöka funktionen hos G-proteinkopplade receptorer, av vilka många, på aktivering, leda till ökade intracellulära fria Ca 2 + koncentrationen genom att släppa Ca 2 + från intracellulära Ca 2 + butiker eller aktivera andra Ca 2 + genomsläpplig jonkanaler (14-16). FlexStation 3 använder sig av Ca 2 + känsliga färgämnen som ger upphov till ökad fluorescensintensitet eller ratiometrisk förändringar, med en ökning av intracellulära Ca 2 + koncentrationen. Denna video artikeln visar tillämpningen av FlexStation 3 i studien av Ca2 +-permeabla TRPA1 kanaler heterologously uttryckt i HEK293 celler. Även om vi har bara använt 96-brunnar för demonstrationen, kan användaren enkelt välja från 96 - eller 384-brunnar format genom att byta utlämning pipetters (8 - eller 16-kanal). Denna analys ger en snabb medelhög till hög throughput screening förmåga agonist och / eller antagonister och tillämpas på många andra Ca2 +-genomsläppliga jonkanaler. Det bör dock noteras att intracellulär kalcium-analysen är ett indirekt mått på jonkanaler aktiviteter. Detaljerad uppföljning studier med inspelningar patch clamp att direkt mäta joner ström över cellmembranet fortfarande behövs för att dra korrekta slutsatser.
För att få tillförlitliga data kvalitet, bör följande försiktighetsåtgärder vidtas:
- För löst vidhäftande celler, såsom HEK293-celler, beläggning plattorna är viktigt. Men för stark anhängare celler, till exempel kinesiska (CHO) hamster celler eller HELA celler, är beläggningen inte nödvändigt.
- Det är viktigt att samma mängd celler seedas i varje brunn på flera brunnar och cellen densiteten i varje brunn bör ligga mellan 90-100% confluency vid tidpunkten för analysen.
- Försiktigt dosera vätska till cellerna och undvika att störa cellerna vid lastning och tvätt celler.
- Probenecid tillsätts för att förhindra att färga läckage. Eftersom probenecid har också effekt på vissa jonkanaler, bör försiktighet iakttas vid tolkning av data från experiment som innehåller probenecid i analysen buffert.
- För att bestämma förening koncentrationer i föreningen plattan, överväga spädningsfaktorn för varje brunn enligt bufferten volymen i motsvarande väl av provet plattan före och efter förening tillägg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. John Hancock, Ray Grill, Andrew Morris och Olga Chumakova för deras stöd. Det FlexStation 3-systemet är en del av UTHSC Cytodynamic Imaging Facility. Vi vill också tacka Dr. Ardem Patapoutian och Michael Bandell från Scripps Research Institute och genomik Institutet för Novartis Research Foundation (GNF) för att tillhandahålla HEK293-hTRPA1 stabil cellinje. Forskningen stöds delvis av anslag från NIH (GM081658 till MXZ) och Texas Medical Center matsmältningssjukdomar Center (till HH) och Mission Anslut / TIRR Foundation (till HH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FlexStation 3 | Molecular Devices | FLEX3 | |
| 96-Well, FlexStation Pipet Tips | Molecular Devices | 9000-0912 | |
| 96-Well Plates | Greiner Bio-One | 655090 | |
| 96-Well Clear Flat Bottom plates | Costar | 3595 | |
| DMEM | Invitrogen | 12430-104 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14202 | |
| PluronicF-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P36551 | |
| probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 |
References
- Hu, H. Activation of TRPA1 channels by fenamate nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Pflugers Arch. 459, 579-592 (2010).
- Hu, H., Bandell, M., Petrus, M. J., Zhu, M. X., Patapoutian, A. Zinc activates damage-sensing TRPA1 ion channels. Nat Chem Biol. 5, 183-190 (2009).
- Perney, T. M., Hirning, L. D., Leeman, S. E., Miller, R. J. Multiple calcium channels mediate neurotransmitter release from peripheral neurons. Proc Natl Acad Sci. 83, 6656-6659 (1986).
- Mason, S. A., MacLeod, K. T. Cardiac action potential duration and calcium regulation in males and females. Biochem Biophys Res Commun. 388, 565-570 (2009).
- Raat, N. J., Wetzels, G. E., DeMey, J. G. Calcium-contraction relationship in rat mesenteric arterial smooth muscle. Effects of exogenous and neurogenic noradrenaline. Pflugers Arch. 436, 262-269 (1998).
- Alagarsamy, S., Johnson, K. M. Voltage-dependent calcium channel involvement in NMDA-induced activation of NOS. Neuroreport. 6, 2250-2254 (1995).
- Su, L. T. TRPM7 regulates cell adhesion by controlling the calcium-dependent protease calpain. J Biol Chem. 281, 11260-11270 (2006).
- Dubinsky, J. M., Rothman, S. M. Intracellular calcium concentrations during "chemical hypoxia" and excitotoxic neuronal injury. J Neurosci. 11, 2545-2551 (1991).
- George, J. Sodium channel activation augments NMDA receptor function and promotes neurite outgrowth in immature cerebrocortical neurons. J Neurosci. 29, 3288-3301 (2009).
- Price, K. L., Lummis, S. C. FlexStation examination of 5-HT3 receptor function using Ca2+ - and membrane potential-sensitive dyes: advantages and potential problems. J Neurosci Methods. 149, 172-177 (2005).
- Laude, A. J. Rapid functional assays of recombinant IP3 receptors. Cell Calcium. 38, 45-51 (2005).
- Marincsak, R. The analgesic drug, tramadol, acts as an agonist of the transient receptor potential vanilloid-1. Anesth Analg. 106, 1890-1896 (2008).
- Xie, X. Validation of high throughput screening assays against three subtypes of Ca(v)3 T-type channels using molecular and pharmacologic approaches. Assay Drug Dev Technol. 5, 191-203 (2007).
- Christensen, B. N., Kochukov, M., McNearney, T. A., Taglialatela, G., Westlund, K. N. Proton-sensing G protein-coupled receptor mobilizes calcium in human synovial cells. Am J Physiol Cell Physiol. 289, C601-C608 (2005).
- Boulay, G. Cloning and expression of a novel mammalian homolog of Drosophila transient receptor potential (Trp) involved in calcium entry secondary to activation of receptors coupled by the Gq class of G protein. J Biol Chem. 272, 29672-29680 (1997).
- Nanda, K. Functional screening of adrenergic receptors by measuring intracellular calcium using the FlexStation scanning fluorimeter. Biotechnol J. 4, 417-422 (2009).
