Summary
Cette vidéo fournit un protocole détaillé pour l'étude du profil pharmacologique de canaux à l'aide humaine TRPA1 Flexstation 3. Le protocole couvre les détails de préparation de cellules, le colorant de charge et le fonctionnement du lecteur de microplaques, Flexstation 3.
Abstract
Flexstation La Molecular Devices '3 est une paillasse multi-mode lecteur de microplaques capable de mesure de la fluorescence automatisé plaques multi-puits. Elle est idéale pour les moyennes et à haut débit écrans dans les milieux universitaires. Il dispose d'un module de transfert de fluide intégré équipé d'un pipetteur multi-canal et la machine lit une colonne à la fois de surveiller les changements de fluorescence d'une variété de réactifs fluorescents. Par exemple, Flexstation 3 a été utilisé pour étudier la fonction de Ca 2 +-perméable canaux ioniques et G récepteurs couplés aux protéines en mesurant les changements de libre intracellulaire de Ca 2 + niveaux. Transitoire des récepteurs potentiels (TRP) des canaux sont une grande famille de canaux cationiques non sélectifs qui jouent un rôle important dans de nombreuses fonctions physiologiques et physiopathologiques. La plupart des canaux TRP sont perméables de calcium et d'induire l'influx de calcium lors de l'activation. Dans cette vidéo, nous démontrons l'application de Flexstation 3 pour étudier le profil pharmacologique de la voie TRPA1, un capteur moléculaire pour de nombreux stimuli nocifs. Cellules HEK293 exprimant de façon stable ou transitoire humaine TRPA1 canaux, cultivés dans des plaques 96 puits, sont chargés avec un Ca 2 + sensibles au colorant fluorescent, Fluo-4, et en temps réel les changements de fluorescence de ces cellules sont mesurés avant et pendant l'application de la un agoniste TRPA1 utilisant le mode FLEX de l'Flexstation 3. L'effet d'une putative TRPA1 antagoniste a été également examiné. Les données sont transférées à partir du logiciel Pro SoftMax de construire des relations concentration-réponse du TRPA1 activateurs et inhibiteurs.
Protocol
1. Les préparations de cellules dans des plaques 96 puits
Pour les cellules HEK293 transitoirement trasfected avec TRPA1 ADNc humain
- HEK293 cellules sont cultivées pendant un à deux jours dans Dulbecco Minimal Essential Medium (DMEM) contenant 4,5 mg / ml de glucose (Thermo Scientific, SH3002201), complétée par inactivé à la chaleur 10% de sérum de veau fœtal (Invitrogen, 16000-044), 50 unités / ml de pénicilline et 50 pg / ml de streptomycine (Invitrogen, 15140-163). Le jour de la transfection, la densité cellulaire devrait atteindre 70-90%.
- Manteau plaques à 96 puits par pipetage 50 ul de poly-L-ornithine (Sigma P3655, 20 pg / ml en eau distillée stérile) dans chaque puits et incuber à 37 ° C pendant au moins 15 min. Rincez chaque puits une fois avec du phosphate de Dulbecco saline tamponnée (DPBS) sans Mg 2 + et Ca 2 + (Thermo Scientific, SH3002803). La plaque peut être laissé dans la hotte de culture cellulaire pour quelques heures.
- Pour chaque puits d'une plaque de 96 puits, diluer dans un tube de 1,5 ml Eppendorf 0,2 pg d'ADNc dans 25 ul OPTI-MEM (Invitrogen, 31985-070). Intensifier proportionnellement selon le nombre de puits à être transfectées par l'ADNc mêmes. Aussi diluer dans un séparées de 1,5 ml tube Eppendorf 0,4 ul Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019) dans 25 ul OPTI-MEM pour chaque puits à transfecter. Échelle de cette place en fonction du nombre total de puits à transfecter.
- Brièvement au vortex de 2000 diluée ADNc et Lipofectamine et laissez-les reposer à la température ambiante pendant environ 5 min.
- Transférer un volume égal de la Lipofectamine diluée 2000 sur le tube qui contient l'ADNc dilué, vortex et laisser reposer le mélange à la température ambiante pendant 15 min à 2 heures. Pendant ce temps, le transfert de l'ADNc / Lipofectamine 2000 mélange à 49 ul / puits de la plaque de poly-L-ornithine couché.
- Trypsiniser les cellules HEK293 (étape 1.1), comte de densité cellulaire à l'aide d'un hémocytomètre ou contre la comtesse de cellules automatisé (Invitrogen, C10227), et de transférer une quantité désirée de cellules (généralement environ ~ 125,000-150,000 cellules / puits) d'une solution stérile de 15 ml tube à centrifuger conique à fond. Centrifuger à 1000 RPM x pendant 5 min. Resuspendre les cellules à ~ 1,250,00-1,500,000 cellules / ml dans le milieu de culture DMEM, supplémenté avec 10% inactivés par la chaleur du sérum de veau fœtal, mais sans antibiotiques.
- Distribuer 98 suspension cellulaire ul à chaque puits qui contient l'ADNc-Lipofectamine 2000 en utilisant un mélange de pipetteur multicanaux ou le distributeur de microplaques MicroFill (Bio-Tek). Laissez reposer la plaque dans la hotte pendant au moins 30 min avant de le placer à l'humidifié incubateur de culture cellulaire. Incuber à 37 ° C CO, 5% pour les 20-44 2 heures.
Pour les cellules HEK293 exprimant de façon stable TRPA1
- Suivez l'étape 1.2 pour enduire les plaques 96 puits.
- La ligne inductible de cellules HEK293-hTRPA1 a été généreusement fourni par le Dr A. Patapoutian (Le Scripps Research Institute) et maintenu dans le même milieu que les HEK293 cellules de type sauvage (étape 1.1), mais supplémenté avec 5 pg / ml blasticidine (Invitrogen, A1113902) et 50 pg / ml d'hygromycine B (Invitrogen, 10687010). Lorsque la densité cellulaire atteint environ 90%, trypsiniser cellules, comptez densité cellulaire, et centrifuger la quantité désirée de cellules à 1000 x RPM pendant 5 min. Resuspendre les cellules à une densité de ~ 1.000.000 cellules / ml dans le même milieu de culture complété par la doxycycline (Fisher, BP26535, 0,25 pg / ml).
- Répartir la suspension cellulaire à la poly-L-ornithine plaques revêtues à 100 l / puits en utilisant un pipetteur multicanaux ou l'MicroFill (Bio-Tek). Laissez reposer la plaque dans la hotte pendant au moins 30 min avant de le placer à l'humidifié incubateur de culture cellulaire. Incuber à 37 ° C, 5% de CO 2 pour 16 - 24 heures.
2. Solutions
- Une solution de Hank saline tamponnée (HBSS) est utilisé comme la solution extracellulaire. Il contient (en mM): 137 NaCl, KCl 5,4, 0,25 Na 2 HPO 4, 0,44
KH 2 PO 4, CaCl 2 1,3, 1,0 MgSO 4, 1,0 MgCl 2, 10 de glucose, 10 HEPES, avec un pH ajusté à 7,4 en utilisant NaOH 1N). - Fluo-4 contient un tampon d'essai de 2 mM de probénécide dans HBSS. Faire 250 mm Stock probénécide (Sigma, P8761) dans NaOH 0,5 N. Diluer à HBSS à un ratio de 1:125. Réajuster le pH à 7,4 à l'aide du HCl 1 N.
3. De chargement cellulaire avec Fluo-quatre heures
- Dissoudre 1 mg Fluo-quatre heures (Invitrogen, F14202) dans 912 ul de DMSO anhydre pour faire une solution de réserve de 1 mM. Le Fluo-quatre heures solution stock peut être conservé à -20 ° C pendant au moins un mois.
- Mélanger 10 ul 1 mM Fluo-quatre heures avec 10 ul Pluronic F-127 (Invitrogen, P3000MP, 20% (p / v) solution dans le DMSO), puis transférer le contenu entier de 5 ml Fluo-4 tampon de dosage (étape 2.2) supplémenté avec 0,1% de sérumalbumine bovine (Sigma, A9418).
- Laver les cellules cultivées en plaques 96 puits (étape 1.7 ou 1.10) avec HBSS à 80 ul / puits 2 fois en utilisant un laveur de microplaques (comme ELx405TM de Bio-Tek).
- Ajouter le Fluo-4 AM chargement solution (étape 3.2) à 50 pl / puits en utilisant un pipetteur multicanaux ou l'MicroFill (Bio-Tek) et incuber la plaque à 37 ° C pendant 1 heure.
- Laver les cellules trois fois avec le tampon de dosage Fluo-4 (étape 2.2.) En utilisant le laveur de microplaques ELx405TM. Après le dernier lavage, laisser 80 ul du tampon de dosage Fluo-4 dans chaque puits.
4. Préparation de la plaque de composés
- Pendant la période de 1 heure de chargement de cellules, de préparer une série de dilutions 3x d'agonistes (ou antagonistes) de 3x de la concentration finale souhaitée dans la mémoire tampon de Fluo-4 dosage.
- Pipeter 250 à 300 pl de la solution diluée composé d'une plaque composé de 96 puits. Arrangez-vous pour avoir le dilutions en série d'un composé et les contrôles positifs et négatifs correspondants dans la même colonne de la plaque composé chaque fois qu'il est possible parce que Flexstation 3 lit une seule colonne à la fois.
5. Lecture des plaques dans les trois Flexstation
- Allumez le système (Flexstation 3, l'ordinateur et le logiciel de SoftMax Pro 5.2)
- Enregistrer l'expérience avec un nouveau nom. Lors de la mise en place, choisissez le mode FLEX et entrez les valeurs suivantes:
Protocole n ° 1, l'effet agoniste 
Protocole n ° 2, effet antagoniste 
- Placez une zone nouvelle astuce, plaque composé et la plaque de lecture pour les bacs appropriés dans Flexstation 3 et cliquez sur "lire" le bouton. Le Flexstation 3 va lire une colonne à la fois et d'ajouter des composés au niveau des points de temps préprogrammés sans interrompre la lecture. Il faut environ 3 minutes (5 min pour le protocole n ° 2) pour terminer la lecture d'une colonne et la machine va continuer à lire la colonne suivante avec des ajouts effectués composé tel que programmé par l'utilisateur dans l'étape 5.2 jusqu'à ce que toutes les colonnes sont lues.
6. L'analyse des données
- Les données expérimentales peuvent être traitées directement en utilisant les SoftMax Pro 5.2 logiciel ou copié et collé dans n'importe quel tableur comme Microsoft Excel. Courbe concentration-réponse d'un acide TRPA1 agoniste flufénamique (FFA) est construit en utilisant la routine d'ajustement suivant les moindres carrés.
, Où Y est la réponse observée, Y max est la réponse normalisée maximale, C est la concentration du médicament correspondant, CE 50 est la concentration qui évoque une réponse semi-maximale, et n H est le coefficient de Hill apparente. Concentration d'inhibition de la courbe pour une putative TRPA1 composé antagoniste A est obtenu en utilisant une concentration fixe de la FFA (100 uM), et en augmentant progressivement la concentration du composé A. CI 50 du composé A est calculé par moindres carrés montage de ce qui suit équation. 
, Où Y est la réponse observée et Y max est normalisé la réponse maximale, [Ant] est le composé correspondant Une concentration, IC 50 est la concentration antagoniste qui produit des demi-inhibition maximale de la FFA-réponse évoquée, et n H est la Colline apparente coefficient.
, Où Y est la réponse observée, Y max est la réponse normalisée maximale, C est la concentration du médicament correspondant, CE 50 est la concentration qui évoque une réponse semi-maximale, et n H est le coefficient de Hill apparente. Concentration d'inhibition de la courbe pour une putative TRPA1 composé antagoniste A est obtenu en utilisant une concentration fixe de la FFA (100 uM), et en augmentant progressivement la concentration du composé A. CI 50 du composé A est calculé par moindres carrés montage de ce qui suit équation. 
, Où Y est la réponse observée et Y max est normalisé la réponse maximale, [Ant] est le composé correspondant Une concentration, IC 50 est la concentration antagoniste qui produit des demi-inhibition maximale de la FFA-réponse évoquée, et n H est la Colline apparente coefficient. 7. Les résultats représentatifs:
TRPA1 est un canal Ca 2 + cation-perméable, l'activation de ce qui conduit à un afflux de calcium qui peuvent être détectés par le Ca 2 + sensibles au colorant, Fluo-4 (1-2). Une lignée cellulaire HEK293-hTRPA1 stable a été utilisé pour étudier les relations concentration-réponse de TRPA1 agonistes et antagonistes. Les cellules ont été chargées avec Fluo-quatre heures, placées dans 80 ul du tampon de dosage, et lire l'aide Flexstation 3. Après l'enregistrement de la fluorescence de base pour 30 s, 40 pi d'une dilution en série de l'agoniste TRPA1, FFA, chacun à 3x sur la concentration finale désirée, ont été ajoutés à des cellules à travers un pipetteur multicanaux inclus comme une partie du module fluidique des Flexstation 3. Les changements de fluorescence ont été suivis pendant une supplémentaire de 180 s. Les changements relatifs Fluo-4 de fluorescence de chaque puits ont été exprimés en AF = (F - F 0), où 0 F et F sont des valeurs de fluorescence à la fois de l'intérêt et le début de la lecture, respectivement. Représentant des traces des cours du temps pour les changements de fluorescence en réponse à une série de concentrations FFA sont présentés sur la Fig. 1. Note pour les concentrations dernière FFA quatre, bien que les niveaux de réponse maximal sont similaires, la cinétique d'activation est nettement plus rapide à la plus élevée que pour les concentrations inférieures FFA. Par conséquent, pour distinguer ces différences, la concentration - relation dose-réponse a été construite en mesurant les taux initiaux (pente) de l'augmentation de fluorescence lors de l'addition de concentrations variables de la FFA (Fig. 2). L'effet maximal moitiéla concentration IVE (CE 50) de la FFA a été établi à 55,4 uM (n = 3). Pour tester la putatifs TRPA1 antagoniste, le composé A, nous avons réalisé une expérience similaire en utilisant le protocole n ° 2 (étape 2). Dans ce cas, une série de dilutions de l'antagoniste ont été ajoutés à 30 s (40 pi de 3x désiré concentrations finales) et la FFA a été ajouté plus tard, 180 s (60 pi à 300 uM pour une concentration finale de 100 uM). Composé A dose-dépendante réduit la réponse de l'TRPA1 cellules à la FFA avec une concentration maximale moitié inhibitrices (CI 50) de 4,3 uM (n = 3) (Fig. 2).
Figure 1. Concentration-dépendante l'activation de TRPA1 humaine par la FFA. Les traces sont plus évoqués FFA de la fluorescence au cours du temps (réponses uniquement dans les 60 premières secondes sont présentés pour mieux illustrer la cinétique rapide de la FFA-réponses évoquées). S'il vous plaît noter que des concentrations plus élevées FFA évoqué augmentation de fluorescence avec un. Beaucoup plus rapide que les cinétiques des concentrations plus faibles, même si les niveaux de crête de fluorescence ont été similaires
Figure 2 Concentration -. Relations de réponse pour le changement induit par la FFA fluorescence et composé A induit une inhibition de la réponse de la FFA dans le TRPA1 humaine exprimée de façon stable dans les cellules HEK293. Δ, la concentration - relation dose-réponse du FFA a été déterminée en mesurant le taux initial (pente) de l'augmentation de la fluorescence normalisée lors de l'addition de concentrations variables de la FFA. O, relation concentration-réponse de l'inhibition de la FFA-réponse évoquée du calcium par une putative TRPA1 antagoniste, composé A.
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Discussion
Intracellulaire de Ca 2 + joue un rôle important dans de nombreuses conditions physiologiques et pathologiques, tels que libération des neurotransmetteurs (3), le potentiel d'action cardiaque (4), la contraction des cellules musculaires (5), la transduction du signal cellulaire (6-7), et la mort cellulaire excitotoxique ( 8). Mesure de Ca 2 + intracellulaire niveaux aide à élucider les changements fonctionnels de Ca 2 +-canaux perméables dans la membrane plasmique ou organites intracellulaires et la contribution de
Ca 2 + au processus ci-dessus (9-13). Le test peut également être utilisé pour étudier la fonction de G récepteurs couplés aux protéines, dont beaucoup, lors de l'activation, conduire à une augmentation intracellulaire de Ca 2 + en libérant des concentrations de Ca 2 + à partir intracellulaire de Ca 2 + magasins ou en activant d'autres Ca 2 + perméables canaux ioniques (14-16). Flexstation 3 permet l'utilisation de Ca 2 + colorants sensibles, qui donnent lieu à l'intensité de fluorescence accrue, ou des changements ratiométrique, avec l'augmentation des intracellulaire de Ca 2 + de concentration. Cet article démontre la vidéo de l'application de Flexstation 3 dans l'étude de Ca 2 +-perméable TRPA1 canaux hétérologue exprimé dans les cellules HEK293. Bien que nous avons seulement utilisé des plaques de 96 puits pour la démonstration, les utilisateurs peuvent facilement choisir à partir de 96 - ou 384 puits format de plaque en changeant la distribution pipettes (8 - ou 16-canaux). Ce test fournit un moyen rapide de capacité de débit de criblage à haut d'agonistes et / ou antagonistes et est applicable à beaucoup d'autres canaux ioniques de Ca 2 +-perméable. Toutefois, il convient de noter que le dosage du calcium intracellulaire est une mesure indirecte des activités de canaux ioniques. Détail des études de suivi à l'aide des enregistrements de patch-clamp de mesurer directement courant ionique qui coule à travers la membrane cellulaire sont encore nécessaires pour tirer les conclusions appropriées.
Pour obtenir la qualité des données fiables, les précautions suivantes doivent être prises:
- Pour les cellules faiblement adhérentes, telles que les cellules HEK293, le revêtement des plaques est essentielle. Cependant, pour des cellules fortement adhérentes, tels que ovaire de hamster chinois (CHO) ou des cellules HELA, le revêtement n'est pas nécessaire.
- Il est important que la même quantité de cellules sont ensemencées dans chaque puits de la plaque multi-puits et de la densité des cellules dans chaque puits devrait être compris entre 90-100% de confluence au moment du dosage.
- Doucement se dispenser de liquide dans les cellules et éviter de déranger les cellules lors du chargement et de lavage des cellules.
- Le probénécide est ajouté pour empêcher la fuite de teinture. Toutefois, depuis le probénécide a également un effet sur certains canaux ioniques, la prudence devrait être prise lors de l'interprétation des données obtenues par des expériences qui incluent le probénécide dans le tampon d'essai.
- Pour déterminer les concentrations de composés dans la plaque composé, considérer le facteur de dilution pour chaque puits selon le volume de tampon dans le puits correspondant de la plaque échantillon avant et après l'ajout composé.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous remercions les Drs. John Hancock, Ray Grill, Andrew Morris et Olga Chumakova pour leur soutien. Le système est Flexstation 3 cadre de la Facilité d'imagerie Cytodynamic UTHSC. Nous remercions également les docteurs. Ardem Patapoutian et Michael Bandell du Scripps Research Institute et l'Institut de génomique de la Fondation Novartis pour la recherche (GNF) pour fournir la lignée cellulaire HEK293-hTRPA1 stable. La recherche est financée en partie par des subventions du NIH (GM081658 à MXZ) et le Texas Medical Center Digestive Diseases Center (à HH) et la Mission Connect / TIRR Fondation (à HH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FlexStation 3 | Molecular Devices | FLEX3 | |
| 96-Well, FlexStation Pipet Tips | Molecular Devices | 9000-0912 | |
| 96-Well Plates | Greiner Bio-One | 655090 | |
| 96-Well Clear Flat Bottom plates | Costar | 3595 | |
| DMEM | Invitrogen | 12430-104 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14202 | |
| PluronicF-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P36551 | |
| probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 |
References
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